CN117929708A - 一种百日咳人源IgG抗体参考血清及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学技术领域，公开了一种百日咳人源IgG抗体参考血清及其制备方法，该制备方法包括将人源血清分为待调配组和稀释用人源血清组两组，将含有高浓度百日咳IgG抗体的血清混合获得调配组，含有低浓度百日咳IgG抗体的血清混合获得稀释液组；将调配组和稀释液组混合适当混合即可获得百日咳人源IgG抗体参考血清；本发明提供了一种简单、快速且经济有效地制备百日咳人源IgG抗体参考血清的方法，这种方法不仅可以提高制备效率，而且可以更精确地控制最终产品的浓度和一致性。本发明制备得到的百日咳人源IgG抗体参考血清可以作为百日咳临床诊断、治疗及科研等领域的重要工具。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种百日咳人源IgG抗体参考血清及其制备方法。
背景技术
人源IgG抗体是一种在人体免疫系统中发挥关键作用的蛋白质，具有与抗原结合并触发免疫反应的能力。人源IgG抗体参考血清是一种用于研究和诊断目的的特殊血清，其中包含了明确定量的人源IgG抗体。这种血清通常被用于生物医药研究领域，以帮助科学家们了解人类免疫系统的反应和功能。人源IgG抗体参考血清具有多种应用，其中最常见的是用于酶联免疫吸附试验（ELISA）免疫学试验中，以检测和定量样品中的IgG抗体。由于这种血清来自人类，因此它能够代表人类免疫系统的真实反应，并且与来自其他动物来源的抗体相比，具有更高的交叉反应性和兼容性。
除了在免疫学研究中的使用，人源IgG抗体参考血清还可以用于研究和诊断一些疾病，例如自身免疫性疾病、感染性疾病和癌症等。通过使用这种血清，科学家们可以更好地了解这些疾病的发病机制和病理生理过程，并开发出更好的诊断方法和治疗策略。
总之，人源IgG抗体参考血清是一种重要的生物试剂，在生物医药领域的研究和诊断中发挥着至关重要的作用。由于其独特的人类来源和优秀的性能，它已经成为免疫学研究和疾病诊断的重要工具之一。
百日咳是一种由百日咳杆菌引起的急性呼吸道传染病，主要通过飞沫传播。百日咳的传染性极强，可以通过飞沫传播，也可通过接触污染物体表面传播。而且百日咳的病程较长，通常需要数周甚至数月才能痊愈。在这期间，患者需要忍受长期的咳嗽和不适，给生活和工作带来很大的不便。同时，由于百日咳的传染性，患者可能需要隔离治疗，这也会给家庭和社会带来一定的负担。此外，百日咳还可能导致一些严重的并发症。例如，肺炎是百日咳最常见的并发症之一，患者可能会出现呼吸困难、呼吸急促等症状。脑炎也是百日咳的并发症之一，患者可能会出现头痛、呕吐、精神不振等症状。这些并发症不仅会影响患者的身体健康，还可能危及生命。因此，检测百日咳杆菌感染能够及时发现并预防百日咳的发生，对于保护公众健康具有重要意义。
百日咳人源IgG抗体参考血清是一种用于检测百日咳杆菌感染的血清学方法。通过检测血清中的IgG抗体水平，可以判断患者是否感染了百日咳杆菌，以及感染的时间和病情的严重程度。因此，发明一种百日咳人源IgG抗体参考血清对于及时诊断百日咳具有重要的参考价值。
发明内容
为达到上述目的，本发明提出了一种百日咳人源IgG抗体参考血清的制备方法，包括：
将人源血清依次进行热灭活和反复冻融后，经粗筛检测后，分为待调配组和稀释用人源血清组；所述反复冻融具体为先将血清冷冻4小时以上后，取出置于室温缓冻至血清完全溶解，震荡混匀后重复此操作，重复10-20次；
含百日咳IgG抗体的人源血清分为调配组和稀释液组；
将所述调配组和所述稀释液组按适当比例混合后，获得所述百日咳人源IgG抗体参考血清。
优选的，所述调配组和所述稀释液组混合时，所述调配组的添加量X和所述稀释液组的添加量Y通过以下方程式计算：
；
其中，H表示所述调配组的浓度，浓度单位为IU/mL；L表示所述稀释液组的浓度，浓度单位为IU/mL；M表示所述调配组和所述稀释液组的总体积；1表示所述百日咳人源IgG抗体参考血清的浓度为1 IU/mL。
优选的，将含百日咳IgG抗体浓度较高的血清相混合，获得所述调配组，将含百日咳IgG抗体浓度较低的血清相混合，获得所述稀释液组。
优选的，将所述调配组和所述稀释液组混合后，获得所述百日咳人源IgG抗体参考血清，包括：
将所述调配组和所述稀释液组混合后，获得待检样品；
获得所述待检样品的吸光度值，利用所述吸光度对所述待检样品进行标准评判，获得标准评判结果；
根据所述标准评判结果判断是否需要对所述待检样品进行浓度调整；
当判断结果为不需要对所述待检样品进行浓度调整时，所述待检样品即为所述百日咳人源IgG抗体参考血清；
当判断结果为需要对所述待检样品进行浓度调整时，对所述待检样品进行浓度调整后获得所述百日咳人源IgG抗体参考血清。
优选的，在获得所述待检样品的吸光度值，利用所述吸光度对所述待检样品进行标准评判，获得标准评判结果时，包括：
将所述待检样品按照浓度梯度进行稀释，获得若干稀释样品；
将标准品PT-IgG按照浓度梯度进行稀释，获得若干标准品，所述标准品PT-IgG的浓度梯度与所述待检样品的浓度梯度相同；
通过ELISA方法检测获取若干所述稀释样品和若干所述标准品的吸光度值，分别对若干所述稀释样品和若干所述标准品的吸光度值进行直线拟合和/或曲线拟合，根据拟合结果对所述待检样品进行标准评判；
其中，若干所述稀释样品和若干所述标准品的CV≤10%。
优选的，所述直线拟合的方法为平行线拟合法，所述曲线拟合的方法为Curve曲线拟合法。
优选的，所述平行线拟合法具体为：
若干所述标准品的吸光度值中应至少4个点满足线性拟合，且R2≥0.99；
若干所述稀释样品的吸光度值中应至少4个点满足线性拟合，且R2≥0.99；
由所述稀释样品与所述标准品拟合的直线方程应平行，y=kx+b，k值相等；
所述Curve曲线拟合法具体为：
根据若干所述标准品的吸光度值在CurveExpert软件中通过curve finder模块进行拟合曲线搜索，选择拟合度最高，且拟合曲线符合ELISA抗原抗体结合反应规律的曲线作为拟合曲线；
输入若干所述稀释样品的吸光度值，根据所述拟合曲线计算若干所述稀释样品的浓度值；
选择符合稀释比例关系的样品点作为计算基准，反推所述待检样品的浓度。
优选的，选择符合稀释比例关系的样品点作为计算基准，反推所述待检样品的浓度后，包括：
当若干所述稀释样品和若干所述标准品的吸光度值的拟合曲线不重合时，对所述待检样品的浓度进行调整，直到若干所述稀释样品和若干所述标准品的吸光度值的拟合曲线重合，且总体CV值不大于10%，且若干所述标准品的吸光度值普遍大于若干所述稀释样品时，所述待检样品为所述百日咳人源IgG抗体参考血清。
优选的，选择浓度≥150IU/mL的所述人源血清进行配伍作为所述待调配组，选择浓度≤20IU/mL的所述人源血清进行配伍作为所述稀释液组。
优选的，所述百日咳人源IgG抗体参考血清的制备方法还包括：
获得所述百日咳人源IgG抗体参考血清后，将所述百日咳人源IgG抗体参考血清进行冻干，获得人源IgG抗体参考血清冻干粉；
所述冻干的方法为：将所述百日咳人源IgG抗体参考血清在-80℃冷冻48小时后，使用冻干机进行冻干获得所述百日咳人源IgG抗体参考血清冻干粉，其中，所述冻干机的主冻干真空压力0.075帕，冻干时间15-17小时。
本发明还提出了一种人源IgG抗体参考血清，所述百日咳人源IgG抗体参考血清通过任一所述的百日咳人源IgG抗体参考血清的制备方法制备获得。
与现有技术相比，其有益效果在于：
本发明提供一种百日咳人源IgG抗体参考血清及其制备方法。
本发明公开的制备方法可以有效地制备百日咳人源IgG抗体参考血清，并且可以精确地控制其浓度。通过将人源血清分为待调配组和稀释用人源血清组，并将百日咳IgG与它们混合，可以得到调配组和稀释液组。然后，将这两个组混合，就可以获得所需浓度的百日咳人源IgG抗体参考血清。这种方法的好处是简单易行，并且可以快速得到所需浓度的参考血清。此外，这种方法还可以确保参考血清的稳定性和一致性，使其在不同批次之间保持一致。这种方法不仅适用于科研领域，还可应用于临床诊断、治疗和药物研发等领域。
通过本发明的制备方法，可以得到高纯度的百日咳人源IgG抗体参考血清，其中的杂质含量极低，可以忽略不计。此外，该血清的稳定性非常好，这种稳定性使得该血清可以在各种环境下使用，包括在实验室中进行各种检测及实验操作。该百日咳人源IgG抗体参考血清的可重复性也非常好，这意味着每次制备的血清质量都非常稳定，可以重复使用多次，这种可重复性不仅提高了实验的效率，同时也降低了实验成本。
此外，该百日咳人源IgG抗体参考血清也可以用于临床诊断和治疗方法的研究和开发。例如，可以将其用于制备针对特定疾病的诊断试剂盒或治疗药物。由于该血清是人体自身的抗体，因此不会引起免疫反应，使得诊断和治疗更加安全有效。
总之，本发明制备得到的百日咳人源IgG抗体参考血清具有高纯度、低杂质、稳定性和可重复性好等优点，可以用于临床诊断和治疗方法的研究和开发。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种抗体参考血清的制备方法，具体包括：
1、人源血清评价及无害化预处理
依据《中国药典》2015版相关要求，选择合格血清，确认乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、丙型肝炎病毒抗体（HCV抗体）、人类免疫缺陷病毒抗体（HIV-1和HIV-2抗体）、梅毒均检测为阴性后，采用常规热灭活方式对人源血清进行无害化处理。常规热灭活方式为50℃-70℃加热10min-60min。
为便于后期稳定性，可事先将血清进行反复冻融10-20次：先将血清置于-80℃冰箱冷冻4小时以上（确保冷冻完全），之后将其取出置于室温（15℃-25℃）缓冻至血清完全溶解，约需1小时，震荡混匀后重复此操作，以消除不稳定的血清干扰同时提高最终参考血清的稳定性。
2、初筛
对步骤1处理后血清进行初步检测，选择浓度≥150IU的血清进行配伍作为待调配组，选择浓度≤20IU的血清进行配伍，作为稀释用血清组。
3、调配与定量
根据初筛结果，选择适宜调配方案进行目标IgG抗体和血清的调配，调配后血清与国际标准质控血清NIBSC 06/140均进行多点稀释后，进行ELISA检测，检测后吸光度值分别根据《中国药典》2015版进行平行线测定方法以及应用CurveExpert软件进行定量计算并予以最终赋值。经前期预实验及文献显示，CurveExpert软件提供的曲线拟合与平行线测定法在定量结果上具有较好的一致性，平行线测定法需对标准品及待检测样品均进行适宜稀释，确保在两者线性反应浓度范围至少包含四个点，经验证两者稀释点呈平行线关系，方可实验成立并对待检测样品赋值，操作复杂且可能存在稀释点不足需重复的可能，相比较CurveExpert软件提供的曲线拟合具有操作简便，样品与标准品可拟合范围广的优势。
4、分装与冻干
定量调配至100IU、80IU、40IU、20IU浓度的血清，按照每瓶1mL体积进行分装，分装后血清-80℃冷冻48小时后，使用冻干机进行冻干，冻干后产品应为均匀淡黄色，孔隙致密，紧致粉饼状，偶可见裂隙属正常状态，不可过度冻干呈硬壳、萎缩、塌陷、空洞，如过度冻干则本批次产品应做废弃或重配制处理。
5、抽样复检
成品应每批抽样进行全项目检测，如分亚批，应根据亚批编制的情况确定各亚批需分别进行检测的项目。抽样应具有代表性，应在分装过程的前、中、后三个阶段或从成品存储不同层中抽取样品。根据实际生产情况，成品检定部分项目可在贴签或包装前抽样进行检定。除定量检测目标IgG抗体外，还应同时完成乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、丙型肝炎病毒抗体（HCV抗体）、人类免疫缺陷病毒抗体（HIV-1和HIV-2抗体）、梅毒检测，并且完成常规分装精度、水分、无菌检测。
实施例1
百日咳毒素（Pertussis toxin, PT）是百日咳鲍特菌的特异性抗原成分，同时也是百日咳疫苗的重要组成成分，在感染和疫苗接种中可诱导机体产生免疫反应，生成特异性的抗PT抗体，有研究显示，抗PT-IgG抗体不会长时间维持在高浓度水平状态，即在接受疫苗免疫或感染百日咳鲍特菌刺激后，抗PT-IgG抗体水平会在较短时间内上升至高浓度水平，之后在2-6个月的时间内下降恢复至相对较低浓度水平，根据此特点，通过抗PT-IgG抗体水平的检测实现对百日咳疫苗接种后免疫效果的评价以及百日咳感染的抗体反应临床诊断。
2007年，经15个国家的22个实验室共同参与验证，制定了百日咳抗体的国际标准活性单位，通过ELISA方法进行百日咳疫苗接种后免疫效果的评价以及百日咳感染的抗体反应临床诊断时，对于检测结果的解读与分析也同样需要基于统一的检测标准。目前已有较为成熟的商品化ELISA定量检测试剂盒可用于相关检测，虽然试剂盒标称所检测结果可溯源至国际标准，但是由于运输、存储或其他因素，检测结果往往具有较大的不确定度，且不同产品不同批次检测结果往往较难直接进行比较，直接购买国际标准质控品又往往受交通、贸易关系等不确定因素影响，存在货期过长的缺点，因此有必要基于国际标准单位建立更为适合实际工作需求的国内本土百日咳参考血清。
以下为以百日咳为例，制备百日咳人源IgG抗体参考血清。
调配血清所用仪器及试剂为：经校准的酶标仪、洗板机、经校准的10uL、100uL、200uL、1000uL量程移液器及配套低吸附吸头、稀释用深孔板、一次性加样槽、37℃温箱、已验证ELISA检测吸光度为0值的小牛血清、百日咳PT IgG ELISA检测试剂盒。
1、人源血清评价及无害化预处理
依据《中国药典》2015版相关要求，选择合格血清，确认乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、丙型肝炎病毒抗体（HCV抗体）、人类免疫缺陷病毒抗体（HIV-1和HIV-2抗体）、梅毒均检测为阴性后，采用常规热灭活方式对人源血清进行无害化处理。常规热灭活方式为50℃加热10min。
为便于后期稳定性，事先将血清进行反复冻融10次：先将血清置于-80℃冰箱冷冻4小时以上（确保冷冻完全），之后将其取出置于室温缓冻至血清完全溶解，约需1小时，震荡混匀后重复此操作，以消除不稳定的血清干扰同时提高最终参考血清的稳定性。
2、初筛
应用商品化ELISA检测试剂盒对上述处理后血清进行初步检测，选择浓度≥150IU的血清进行配伍作为待调配组，选择浓度≤20IU的血清进行配伍，作为稀释用血清组。
分组情况如表1所示：
表1
| 组别 | 粗定量 | 混合后体积 | 混合后再次定量 |
| A组(调配组) | ≈200IU/mL | 5mL | 221IU/mL |
| B组（稀释液组） | ≈0.5IU/mL | 100mL | 0.25IU/mL |
3、调配与定量
根据初筛结果，选择适宜调配方案进行目标IgG抗体和血清的调配。调配方案为：
1）调配初计算。由于目前常用的百日咳PT IgG ELISA检测中，样品实际被稀释了100倍，因此所提供的质控品也同样预先进行了100倍稀释，即所标识的100IU/mL质控品实际浓度为1IU/mL，以调配10mL 100IU/mL质控品为例，列方程式如下：
；
解方程得解：X=0.03398mL≈34uL；Y≈9966uL。
2）依据调配计算完成初调配，配置后混匀作为待检样品A，并且对A进行多点稀释，设定其浓度为100IU/mL，按照100IU/mL（A1）、80IU/mL（A2）、60IU/mL（A3）、40IU/mL（A4）、20IU/mL（A5）、10IU/mL（A6）进行多点样品稀释准备，此系列待检样品。
3）调配后血清与国际标准质控血清NIBSC 06/140均进行多点稀释，进行ELISA检测，具体为：对国际标准品06/140，按照说明书采用1mL无菌蒸馏水进行完全重新溶解，溶解后液体50uL-100uL分装后冻存备用，按照原液为335IU/mL浓度计算，采用稀释用小牛血清，对国际标准品进行稀释，稀释后标准品PT-IgG浓度为150IU/mL（S0）、100IU/mL（S1）、80IU/mL（S2）、60IU/mL（S3）、40IU/mL（S4）、20IU/mL（S5）、10IU/mL（S6）标准品，此系列稀释标准品均应现用现制，配制后可存储于4℃冰箱，48小时内可重复使用，所有稀释后标准品在进行商品化试剂盒ELISA检测过程中，均应视为未稀释血清，按照试剂盒要求再次稀释后进行检测。
4）采用百日咳PT IgG ELISA检测试剂盒对待检样品A1-A6、标准品系列S0-S6进行ELISA复孔检测，获取所有检测样的吸光度值，检测后吸光度值分别根据《中国药典》2015版进行平行线测定方法以及应用CurveExpert软件进行定量计算并予以最终赋值。经前期预实验及文献显示，CurveExpert软件提供的曲线拟合与平行线测定法在定量结果上具有较好的一致性，平行线测定法需对标准品及待检测样品均进行适宜稀释，确保在两者线性反应浓度范围至少包含四个点，经验证两者稀释点呈平行线关系，方可实验成立并对待检测样品赋值，操作复杂且可能存在稀释点不足需重复的可能，相比较CurveExpert软件提供的曲线拟合具有操作简便，样品与标准品可拟合范围广的优势。
检测结果评判标准具体为：
a：百日咳PT IgG ELISA检测试剂盒自带阴阳性质控应符合试剂盒规定范围，阴性质控为阴性；
b：所检测样品吸光度读值应符合稀释规律，呈下降趋势，且读数分布合理（处于酶标仪有效读值范围）S0样品OD值≥1.2；
c：每份样品复孔检测读取值CV，其中，CV=标准差/平均值×100%，且CV≤10%。
平行线拟合法：
d1：S0-S6中应至少4个点满足线性拟合，且R2≥0.99；
e1：A1-A6中应至少4个点满足线性拟合，且R2≥0.99；
f1：由A系列与S系列拟合的直线方程应平行，y=kx+b，k值相等。
Curve曲线拟合法：
d2：根据S0-S6的OD值读数，输入相应浓度值，在CurveExpert软件中通过curvefinder模块进行拟合曲线搜索，选择拟合度最高，且拟合曲线符合ELISA抗原抗体结合反应规律的曲线作为拟合曲线，可参考使用四参数logistic回归公式进行数据拟合【y=D+(A-D)/(1 + ((x / C)^B))】；
e2：输入A1-A6的OD值读数，根据拟合曲线计算A1-A6浓度值。
f2：选择符合稀释比例关系的样品点作为计算基准，反推初调配样品A浓度。
其中，在实际应用中，平行线拟合法和Curve曲线拟合法择一使用。
满足上述结果，则检测成立，根据A、S系列方程拟合，可计算样品A实际含量。可选的，规定使用四参数Logistic回归进行曲线拟合，公式补充到这个段落里面了。实际操作中，可选其他满足相关拟合要求的曲线公式。
5）检测后再调配。根据上述计算结果，对初调配样品A进行微调，适量通过增加原始液或稀释液进行调整，重复上述4）步骤，最终调配至A1-A6的OD值与S0-S6的OD值重合，总体CV值小于等于10%，且不可呈现A系列样品普遍OD值均大于或小于S系列OD值的现象，如此可确定最终调配所得混合液作为100IU/mL质控品，其他浓度质控品参照此操作进行，可重新稀释，亦可从高浓度质控品稀释，所有浓度样品均应完成上述检测确定溯源值。
4、分装与冻干
定量调配至100IU、80IU、40IU、20IU浓度的血清，按照每瓶1mL体积进行分装，分装后血清-80℃冷冻48小时后，使用冻干机进行冻干，主冻干真空压力0.075帕，冻干时间15-17小时。
冻干后产品应为均匀淡黄色，孔隙致密，紧致粉饼状，偶可见裂隙属正常状态，不可过度冻干呈硬壳、萎缩、塌陷、空洞，如过度冻干则本批次产品应做废弃或重配制处理。
5、抽样复检
成品应每批抽样进行全项目检测，如分亚批，应根据亚批编制的情况确定各亚批需分别进行检测的项目。抽样应具有代表性，应在分装过程的前、中、后三个阶段或从成品存储不同层中抽取样品。根据实际生产情况，成品检定部分项目可在贴签或包装前抽样进行检定。除定量检测百日咳PT IgG抗体外，还同时完成乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、丙型肝炎病毒抗体（HCV抗体）、人类免疫缺陷病毒抗体（HIV-1和HIV-2抗体）、梅毒检测，并且完成常规分装精度、水分、无菌检测。
本实施例为百日咳人源PT IgG抗体参考血清又叫百日咳IgG抗体参考血清（PT，人源），包装形式可为西林瓶装的冻干粉剂，每盒4瓶，预设浓度分别为100IU/mL、80IU/mL、40IU/mL、20IU/mL。
冻干后粉剂可在短时间（5分钟内）重新复溶于1mL无菌水中，用于ELISA检测中的质控，浓度选择为20IU/mL时，可以用于国内疫苗免疫效果评价中，免疫后血清阳性的判定标准；浓度选择为40IU/mL时，可以用于国际和国内人群抗体水平研究中，常以之作为是否近一年内是否存在百日咳感染的判定标准；浓度选择为80IU/mL与100IU/mL时，可以用于国际和国内人群抗体水平研究以及百日咳临床诊断中，常以之作为是否近期（三个月内）是否存在百日咳感染的判定标准。
本实施例中制备得到的百日咳人源PT IgG抗体参考血清能够适用于多种检测百日咳人源PT IgG抗体检测试剂盒，不同选择浓度可充分满足检测者各种研究需求，采用CurveExpert软件提供的曲线拟合的方式，对检测结果进行定量计算，操作简便，且摆脱了不同试剂盒原有计算方法不同导致的结果之间的差异，如果每次检测均采用本实施例提供的产品进行定量，可以为研究者将不同时期，不同试剂盒的检测结果进行横向和纵向的比较提供便利。
本实施例提供的冻干产品，相较于商品化试剂盒常规提供的液体质控产品，具有便于运输与存储：液体状态质控品为避免抗体效价下降，往往需严格控制运输及存储温度，维持在2℃-8℃，且不可反复冻融，本专利产品运输过程不必严格控制低温环境，存储条件低于室温即可，且干燥状态下5次以内的温度升降不影响后期使用。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种百日咳人源IgG抗体参考血清的制备方法，其特征在于，包括：
将人源血清依次进行热灭活和反复冻融后，经粗筛检测后，分为待调配组和稀释用人源血清组；所述反复冻融具体为先将血清冷冻4小时以上后，取出置于室温缓冻至血清完全溶解，震荡混匀后重复此操作，重复10-20次；
将含百日咳IgG抗体的人源血清分为调配组和稀释液组；
将所述调配组和所述稀释液组按适当比例混合后，获得所述百日咳人源IgG抗体参考血清。
2.根据权利要求1所述的百日咳人源IgG抗体参考血清的制备方法，其特征在于，所述调配组和所述稀释液组混合时，所述调配组的添加量X和所述稀释液组的添加量Y通过以下方程式计算：
；
其中，H表示所述调配组的浓度，浓度单位为IU/mL；L表示所述稀释液组的浓度，浓度单位为IU/mL；M表示所述调配组和所述稀释液组的总体积；1表示所述百日咳人源IgG抗体参考血清的浓度为1 IU/mL。
3.根据权利要求2所述的百日咳人源IgG抗体参考血清的制备方法，其特征在于，将所述调配组和所述稀释液组混合后，获得所述百日咳人源IgG抗体参考血清，包括：
将所述调配组和所述稀释液组混合后，获得待检样品；
获得所述待检样品的吸光度值，利用所述吸光度对所述待检样品进行标准评判，获得标准评判结果；
根据所述标准评判结果判断是否需要对所述待检样品进行浓度调整；
当判断结果为不需要对所述待检样品进行浓度调整时，所述待检样品即为所述百日咳人源IgG抗体参考血清；
当判断结果为需要对所述待检样品进行浓度调整时，对所述待检样品进行浓度调整后获得所述百日咳人源IgG抗体参考血清。
4.根据权利要求3所述的百日咳人源IgG抗体参考血清的制备方法，其特征在于，在获得所述待检样品的吸光度值，利用所述吸光度对所述待检样品进行标准评判，获得标准评判结果时，包括：
将所述待检样品按照浓度梯度进行稀释，获得若干稀释样品；
将标准品PT-IgG按照浓度梯度进行稀释，获得若干标准品，所述标准品PT-IgG的浓度梯度与所述待检样品的浓度梯度相同；
通过ELISA方法检测获取若干所述稀释样品和若干所述标准品的吸光度值，分别对若干所述稀释样品和若干所述标准品的吸光度值进行直线拟合和/或曲线拟合，根据拟合结果对所述待检样品进行标准评判；
其中，若干所述稀释样品和若干所述标准品的CV≤10%。
5.根据权利要求4所述的百日咳人源IgG抗体参考血清的制备方法，其特征在于，所述直线拟合的方法为平行线拟合法，所述曲线拟合的方法为Curve曲线拟合法。
6.根据权利要求5所述的百日咳人源IgG抗体参考血清的制备方法，其特征在于，所述平行线拟合法具体为：
若干所述标准品的吸光度值中应至少4个点满足线性拟合，且R2≥0.99；
若干所述稀释样品的吸光度值中应至少4个点满足线性拟合，且R2≥0.99；
由所述稀释样品与所述标准品拟合的直线方程应平行，y=kx+b，k值相等；
所述Curve曲线拟合法具体为：
根据若干所述标准品的吸光度值在CurveExpert软件中通过curve finder模块进行拟合曲线搜索，选择拟合度最高，且拟合曲线符合ELISA抗原抗体结合反应规律的曲线作为拟合曲线；
输入若干所述稀释样品的吸光度值，根据所述拟合曲线计算若干所述稀释样品的浓度值；
选择符合稀释比例关系的样品点作为计算基准，反推所述待检样品的浓度。
7.根据权利要求6所述的百日咳人源IgG抗体参考血清的制备方法，其特征在于，选择符合稀释比例关系的样品点作为计算基准，反推所述待检样品的浓度后，包括：
当若干所述稀释样品和若干所述标准品的吸光度值的拟合曲线不重合时，对所述待检样品的浓度进行调整，直到若干所述稀释样品和若干所述标准品的吸光度值的拟合曲线重合，且总体CV值不大于10%，且若干所述标准品的吸光度值普遍大于若干所述稀释样品时，所述待检样品为所述百日咳人源IgG抗体参考血清。
8.根据权利要求1所述的百日咳人源IgG抗体参考血清的制备方法，其特征在于，选择浓度≥150IU/mL的所述人源血清进行配伍作为所述待调配组，选择浓度≤20IU/mL的所述人源血清进行配伍作为所述稀释液组。
9.根据权利要求1所述的百日咳人源IgG抗体参考血清的制备方法，其特征在于，所述百日咳人源IgG抗体参考血清的制备方法还包括：
获得所述百日咳人源IgG抗体参考血清后，将所述百日咳人源IgG抗体参考血清进行冻干，获得人源IgG抗体参考血清冻干粉；
所述冻干的方法为：将所述百日咳人源IgG抗体参考血清在-80℃冷冻48小时后，使用冻干机进行冻干获得所述百日咳人源IgG抗体参考血清冻干粉，其中，所述冻干机的主冻干真空压力0.075帕，冻干时间15-17小时。
10.一种人源IgG抗体参考血清，其特征在于，所述百日咳人源IgG抗体参考血清通过权利要求1-9任一项所述的百日咳人源IgG抗体参考血清的制备方法制备获得。
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Citations (3)
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| CN102128927A (zh) * | 2010-12-29 | 2011-07-20 | 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 | 一种艾滋病检测质控血清的配制方法 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101122605A (zh) * | 2007-08-28 | 2008-02-13 | 宁波美康生物科技有限公司 | 单项胆红素质控血清的制备方法 |
| CN102128927A (zh) * | 2010-12-29 | 2011-07-20 | 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 | 一种艾滋病检测质控血清的配制方法 |
| CN102621335A (zh) * | 2011-01-27 | 2012-08-01 | 首都医科大学附属北京安定医院 | 一种血液制品及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 刘文辉主编: "免疫学检验", vol. 1, 31 December 2019, 中国医药科技出版社, pages: 347 * |
| 徐颖华等: "第1代国家人源抗百日咳血清参考品的制备", 中国生物制品学杂志, vol. 24, no. 10, 31 October 2011 (2011-10-31), pages 1211 - 1213 * |
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