CN117925891A - 一种鉴定西瓜果皮厚度的caps分子标记、引物对、方法、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定西瓜果皮厚度的CAPS分子标记、引物对、方法、试剂盒及其应用，属于分子标记辅助育种技术领域，解决了目前对于西瓜果皮厚度的精细测量方法较为繁琐、准确性欠佳的问题。本发明提供了一种与西瓜果皮厚度性状紧密连锁的分子标记，该分子标记存在一处SNP位点上的变化，通过引物对对西瓜幼苗基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物后，利用限制性内切酶MspⅠ对其进行酶切，根据所得到的酶切产物是否具有375bp的片段即可对西瓜是否具有厚果皮性状进行区分。本发明所述的鉴定方法，操作简便，准确度高，为西瓜果皮厚度性状的分子鉴定提供了行之有效的工具。本发明所述的CAPS分子标记、引物对、方法、试剂盒适用于西瓜分子标记辅助育种领域。
Description
技术领域
本发明属于分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种鉴定西瓜果皮厚度的CAPS分子标记、引物对、方法、试剂盒及其应用。
背景技术
西瓜[Citrullus lanatus(Thunb.)Mansf.]是广泛种植于世界各地的葫芦科重要作物，果皮厚度是西瓜重要的农艺性状之一，是影响西瓜商品品质的重要性状。果皮厚度通常与果皮硬度、果皮韧性、耐贮运性和产量密切相关。在甜瓜中，已有报道表明果皮厚度对于产量的影响很大，但在西瓜中还未见相关报道。在番茄中，同样得出外果皮越厚越耐贮运的观点。目前，对于西瓜果皮厚度的精细测量方法存在较为繁琐、准确性欠佳的问题。CAPS分子标记是目前常见的且技术成熟的分子标记，其原理是酶切位点发生单碱基突变，从而导致酶切后的片段存在多态性。此类标记广泛分布于基因组中，操作比较简单，结果便于观察与识别，在相同物种不同材料中具有普遍适用性。因此，对能够用于研究西瓜果皮厚度的CAPS分子标记进行挖掘，并且运用到西瓜的种质资源筛选和分子育种过程中，对于明确西瓜果皮厚度遗传机制对西瓜耐贮运资源改良具有重要意义。
发明内容
本发明公开了一种鉴定西瓜果皮厚度的CAPS分子标记、引物对、方法、试剂盒及其应用，解决了目前对于西瓜果皮厚度的精细测量方法较为繁琐、准确性欠佳的问题。
本发明的技术方案如下：
一种鉴定西瓜果皮厚度的CAPS分子标记，所述CAPS分子标记为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸片段和如SEQ ID NO.2所示的核苷酸片段；所述SEQ ID NO.1与薄果皮性状紧密连锁，所述SEQ ID NO.2与厚果皮性状紧密连锁；所述薄果皮性状的果皮厚度为小于0.7cm，厚果皮性状的果皮厚度为大于等于0.7cm。
一种鉴定西瓜果皮厚度的CAPS分子标记的引物对，所述引物对包括如SEQ IDNO.3所示的上游引物和如SEQ ID NO.4所示的下游引物。
所述的引物对在鉴定西瓜果皮厚度中的应用，所述应用为利用引物对扩增西瓜基因组DNA获得扩增产物，再利用限制性内切酶MspⅠ酶切扩增产物，根据酶切产物鉴定西瓜果皮厚度。
进一步的，所述西瓜基因组DNA取自幼苗期、抽蔓期或结果期的任一一个时期。
进一步的，所述根据酶切产物鉴定西瓜果皮厚度的方法为若酶切产物具有或包含375bp的片段，则判断西瓜表现为厚果皮性状；若酶切产物不具有375bp的片段，则判断西瓜表现为薄果皮性状。
一种鉴定西瓜果皮厚度的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待测西瓜的基因组DNA；
(2)以步骤(1)获得的基因组DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增，获得扩增产物；所述引物对包括如SEQ ID NO.3所示的上游引物和如SEQ ID NO.4所示的下游引物；
(3)利用限制性内切酶MspⅠ酶切扩增产物，根据酶切产物来鉴定西瓜果皮厚度。
进一步的，步骤(3)所述根据酶切产物来鉴定西瓜果皮厚度的方法为若酶切产物具有或包含375bp的片段，则判断西瓜表现为厚果皮性状；若酶切产物不具有375bp的片段，则判断西瓜表现为薄果皮性状。
上述的方法在西瓜果皮厚度性状辅助鉴定、辅助育种及西瓜果皮厚度性状筛选中的应用。
一种用于鉴定西瓜果皮厚度性状的试剂盒，所述试剂盒含有引物对和限制性内切酶MspⅠ；所述引物对包括如SEQ ID NO.3所示的上游引物和如SEQ ID NO.4所示的下游引物。
所述试剂盒在西瓜果皮厚度性状辅助鉴定、辅助育种及西瓜果皮厚度性状筛选中的应用。
本发明在前期通过High-throughput sequencing技术，构建出西瓜果皮厚度基因池；使用Graded-seq分析方法，在有结果的染色体区段内将SNP位点开发为CAPS分子标记。进而使用2021年种植的250株F2代群体以及2022年种植的527株F2代群体进行遗传连锁分析，最终在西瓜基因组2号染色体末端约12.85Kb的范围内获得了一个稳定的主效QTL。与此同时，根据两亲本重测序数据，开发CAPS分子标记，通过分子标记辅助选择的方法，在西瓜苗期即可对果皮厚度进行分子标记辅助选择，提高了筛选的准确性和效率，具有重要的理论和实践意义。
此外，本发明还依据上述技术，开发出了与西瓜果皮厚度性状紧密连锁的CAPS分子标记，设计出了用于扩增该分子标记的引物对。具体做法为在定位区间内，依据母本及父本的SNP位点差异，使用SNP2CAPS软件得到存在酶切位点的差异序列，进行引物设计，从而获得能够用于鉴定西瓜果皮厚度的引物对。通过该引物对对西瓜幼苗基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物后，利用限制性内切酶MspⅠ对其进行酶切，根据所得到的酶切产物是否具有375bp的片段即可对西瓜是否具有厚果皮性状进行区分，达到了更快捷地和更准确地在西瓜苗期对西瓜果皮厚度进行鉴定的目的。
附图说明
图1为实施例1中西瓜果皮厚度主效位点定位结果图；
图2为实施例3中母本(厚果皮西瓜)、父本(薄果皮西瓜)、F1代和自然群体的酶切产物电泳结果图；其中，泳道1为分子量Marker，自上而下条带大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，泳道2为母本的酶切结果，泳道3为父本的酶切结果，泳道4为F1代的酶切结果，其余泳道均为自然群体的酶切结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，实施本发明的过程、条件、实验方法及试剂等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和市场常规产品，本发明没有特别限制内容。
基因组DNA的提取方法：
基因组DNA提取方法参照Murray等(1980)的方法(Murray M.,Thompson W.F.,Rapid isolation ofhigh molecular weight plant DNA[J].Nucl.Acid.Res.,1980,8:668-673.)，并在此基础上进行改良。
具体步骤如下：
①将所摘取叶片用液氮磨好，然后快速加入65℃预热30min的700μL的CTAB(2％的CTAB，使用前加入2％的巯基乙醇，先预热，再加巯基乙醇)。
②而后充分搅拌，使用65℃水浴1h，使细胞裂解。
③每隔10min的时间上下颠倒该样品，使之受热均匀并充分混匀。
④从水浴锅中取出样品，将之冷却到室温。加入24:1的氯仿：异戊醇(v:v)700μL，上下颠倒10min，混匀后静置10min。
⑤进行离心操作，离心时间为10min，离心温度为4℃，转速为13000rpm。使用200μL的移液器吸取550-600μL上清液装入离心管中，加入24:1的氯仿：异戊醇(v:v)600μL，这次轻轻颠倒混匀(注意：此处与上一步骤不尽相同)，静置10min。
⑥再次离心，离心时间为10min，离心温度为4℃，转速为13000rpm。吸取共计400μL的上层清液，将其装到离心管中，加入此前已经提前进行预冷操作的400μL异丙醇，轻轻进行颠倒混匀的操作。
⑦如果出现白色絮状物，说明存在蛋白质沉淀，这时再次使用上述步骤中的氯仿抽提。将离心管置于-20℃中2h以上，可以过夜。
⑧进行离心操作，离心时间为10min，离心温度为4℃，转速为13000rpm。去掉上清，使离心管管口向下，将其倾斜放置在滤纸上，洗掉所剩的废弃液体。
⑨其后将DNA沉淀用75％的乙醇清洗两次，以便能够去除所残留的异戊醇及其余杂质，置于超净台上吹干沉淀。
⑩溶解DNA，加入20μL去离子水使其溶解，然后在-20℃的条件下保存。
实施例1
与西瓜果皮厚度性状紧密连锁的分子标记及其获取方法。
本实施例涉及西瓜果皮厚度性状关键基因连锁位点、CAPS标记及该标记的获取方法。
(1)供试材料的选取：
所述的供试材料包括母本(厚果皮西瓜)、父本(薄果皮西瓜)、F1代和F2代；
所述的母本材料为：1061，厚果皮西瓜，果皮厚度为1.14cm±0.02cm；
所述的父本材料为：812，薄果皮西瓜，果皮厚度为0.59cm±0.11cm；
上述母本和父本均公开于Yang,T.；Amanullah,S.；Li,S.；Cheng,R.；Zhang,C.；Zhao,Z.；Liu,H.；Luan,F.；Wang,X.Molecular Mapping of Putative Genomic RegionsControlling Fruit and Seed Morphology of Watermelon.Int.J.Mol.Sci.2023,24,15755.
所述的F1代为：以上述两材料为亲本进行杂交获得的F1代；
所述的F2代群体为：上述F1代自交获得的F2代群体，2021年和2022年所用F2代群体数量分别为250株和527株。
(2)供试材料果皮厚度确定：收获成熟果实，纵切后，利用游标卡尺测定果皮厚度；
根据该步骤的调查结果表明：F1代果皮厚度为1.06cm±0.03cm，F2代单株中果皮厚度呈现正态分布，说明西瓜果皮厚度性状为数量性状。
(3)利用Graded-seq及遗传连锁分析方法，获得与西瓜果皮厚度性状紧密连锁的染色体区段：
在F2世代中选择厚果皮、薄果皮单株各20株，分别提取各单株DNA，调节DNA浓度一致后等量混合，构建西瓜果皮厚度基因池，进行Graded-seq分析；根据分析结果结合两亲本基因组重测序数据，在Graded-seq分析结果的染色体区段内开发CAPS分子标记，对2021年和2022年F2代群体进行遗传连锁分析，最终在西瓜基因组2号染色体上约12.85Kb范围内获得了一个稳定的主效QTL，图1为西瓜果皮厚度主效位点qpt2.1初步定位结果。
(4)候选CAPS标记开发：
根据两亲本重测序数据，开发CAPS分子标记，在F2代分离群体中对各单株进行基因分型，结合表型数据，判断基因型与表型的符合度。结果表明，该区段内存在一处SNP位点的变化(A→G)与西瓜果皮厚度性状紧密连锁。
进而本发明获得了与西瓜果皮厚度紧密连锁的CAPS分子标记，CAPS分子标记为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸片段和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸片段；所述SEQ ID NO.1与薄果皮性状紧密连锁，所述SEQ ID NO.2与厚果皮性状紧密连锁。SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2的区别在于第127位的碱基分别为A和G。
如果待检测的样本中含有SEQ ID NO.1的序列，127位的碱基为A，那么样本西瓜为具有薄果皮性状的西瓜，所述薄果皮性状的果皮厚度为小于0.7cm；
如果待检测的样本中含有SEQ ID NO.2的序列，127位的碱基为G，那么样本西瓜为具有厚果皮性状的西瓜，所述厚果皮性状的果皮厚度为大于等于0.7cm。
SEQ ID NO.1：
GATTCAACGGTCACGACGAAAGCATGTGTCATCATTGGGATATGTCAATTCCTTTGTTAAATTTCAATTTGGGACACATGCCAACTTTTGATTAGTCCCGAATTTTAATTTCTTTGATTAGTCCCGAATTTTAATTTCTTAATTAATTGAGAAACGATGTTACAATTTGTGACTGGTCCAAAATTTATCATTCAACAATACCTATGGCATACAGTATTCCCATTTTTTTCTTTTCATCAAAATTCTAATATCTTTTGTGATTATTGTGGCAAGAATCCCTTTTTCTGAAAATTGACCATCTAATATAGTTTCTCCTATTTACTGTGTTTACGGTAAAAGAAATCATTTATTCCAAGATTGTCCTTGTAGCCTTGC
SEQ ID NO.2：
GATTCAACGGTCACGACGAAAGCATGTGTCATCATTGGGATATGTCAATTCCTTTGTTAAATTTCAATTTGGGACACATGCCAACTTTTGATTAGTCCCGAATTTTAATTTCTTTGATTAGTCCCGGATTTTAATTTCTTAATTAATTGAGAAACGATGTTACAATTTGTGACTGGTCCAAAATTTATCATTCAACAATACCTATGGCATACAGTATTCCCATTTTTTTCTTTTCATCAAAATTCTAATATCTTTTGTGATTATTGTGGCAAGAATCCCTTTTTCTGAAAATTGACCATCTAATATAGTTTCTCCTATTTACTGTGTTTACGGTAAAAGAAATCATTTATTCCAAGATTGTCCTTGTAGCCTTGC
实施例2
用于鉴定西瓜果皮厚度性状的引物对的获取。
根据亲本重测序数据开发结果与西瓜果皮厚度性状紧密连锁的CAPS分子标记，设计扩增该分子标记的引物对，具体是在初步定位区间内，依据两亲本测序数据存在的SNP差异，利用SNP2CAPS软件查找存在酶切位点的差异序列，进行引物设计，获得了核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物。
CAPS-F(SEQ ID NO.3)：3’-GATTCAACGGTCACGACGAA-5’；
CAPS-R(SEQ ID NO.4)：3’-GCAAGGCTACAAGGACAATCTT-5’。
实施例3
一种鉴定西瓜果皮厚度性状的方法。
一种鉴定西瓜果皮厚度性状的方法，具体包括如下步骤：
(1)提取待测西瓜样品叶片或其他组织的基因组DNA。
本发明的鉴定方法可以以不同时期的西瓜幼苗为材料，为不影响后续生长最佳时期，本实施例是以西瓜幼苗期(两叶一心期)的叶子为材料提取DNA。
分别提取实施例1中父本、母本、F1代和自然群体内各单株基因组DNA。
自然群体包括香久山、夏友、郑资067号、中生系、黄旭都、郑资001号、PI612474、墨黑、小钢皮、伊吹、引选一号、黑皮RG-1、PI635722、PI612458、早板、G-1-10、PI593361、小西瓜-1、新西2号、HS-5、Javrijsky、P0、74-5-2号、新西3号、橡皮瓜、邵选201、XPH940、829、大红甜、ZXG-271、双XY、5507-1、PI585222、郑二黑皮、PI600950、黄肉早花、京彩、京美2k、查理斯顿选、早生系、波尔强斯基、短蔓、火洲1号、PI482362。
利用实施例2获得的CAPS引物对分别对父本、母本、F1代和自然群体内各单株基因组DNA进行PCR扩增，再分别对各PCR扩增产物进行酶切反应，得到各自的酶切产物。
上述PCR反应体系为：上、下游引物各1μL(引物浓度为2pM)，DNA模板2μL(浓度为50ng/μL)，10×PCR Buffer 2μL(含Mg2+15mM)，dNTP 0.3μL(浓度为10mM)，Taq酶0.2μL(5U/μL)，无菌去离子水13.5μL。
上述PCR反应程序为：94℃预变性10min，94℃变性30s，54.4℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
上述酶切反应体系为：PCR产物5μL(浓度为0.1～0.5μg)，限制性核酸内切酶MspⅠ0.3μL，Buffer 1.5μL，去离子水8.2μL。
上述酶切反应程序为：37℃水浴酶切3.5h后，4℃保存。
PCR扩增产物和酶切产物检测：分别取3μLPCR产物或酶切产物，加入1μL LoadingBuffer，混匀后点入1％琼脂糖凝胶中，220V/400mA电泳，电泳时间为18min。
依据酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果判断西瓜果皮厚度，不具有375bp片段则表现为薄果皮性状，具有375bp片段则表现为厚果皮性状，结果如图2所示。
由图2的结果可知，母本和F1代的酶切结果显示具有375bp的片段，父本的酶切结果显示不具有375bp的片段，判断母本和F1代为厚果皮西瓜，父本为薄果皮西瓜，该结论与实施例1中对父本、母本和F1的果皮厚度测量结果一致。泳道5-40自然群体的酶切结果显示具有375bp的片段，泳道41-48自然群体的酶切结果显示不具有375bp的片段，判断泳道5-40的自然群体具有厚果皮性状，泳道41-48的自然群体具有薄果皮性状。根据对自然群体果皮厚度的实际测量发现，泳道5-40的自然群体果皮厚度变异范围为大于等于0.7cm，泳道41-48的自然群体果皮厚度变异范围为小于0.7cm，因此，根据酶切产物电泳结果(标记基因分型结果)判定的西瓜果皮厚度性状与各西瓜品种的实际果皮厚度高度相符，基因型和表型是完全一致的，符合度100％。说明实施例1提供的分子标记，实施例2提供的引物对，实施例3提供的限制性内切酶及鉴定西瓜果皮厚度性状的方法可以应用于西瓜果皮厚度的苗期分子标记鉴定。
本实施例中选用的自然群体材料公开于下述文献：
Guo,S.,Zhao,S.,Sun,H.et al.Resequencing of 414 cultivated and wildwatermelon accessions identifies selection for fruit quality traits.Nat Genet51,1616-1623(2019).
实施例4
一种用于鉴定西瓜果皮厚度性状的试剂盒。
一种用于鉴定西瓜果皮厚度性状的试剂盒包括如下试剂：
实施例2中所述的CAPS-F和CAPS-R(浓度均为2pM)，10×PCR Buffer(含Mg2+15mM)，dNTP(浓度为10mM)，Taq酶(5U/μL)，无菌去离子水。
CAPS-F(SEQ ID NO.3)：3’-GATTCAACGGTCACGACGAA-5’；
CAPS-R(SEQ ID NO.4)：3’-GCAAGGCTACAAGGACAATCTT-5’。
实施例5
一种用于鉴定西瓜果皮厚度性状的试剂盒的使用方法。
(1)提取待测西瓜的基因组DNA，并调节基因组DNA浓度至50ng/μL。
(2)按照如下PCR体系添加样品及试剂：
上述PCR反应体系为：上、下游引物各1μL(引物浓度为2pM)，DNA模板2μL(浓度为50ng/μL)，10×PCR Buffer 2μL(含Mg2+15mM)，dNTP 0.3μL(浓度为10mM)，Taq酶0.2μL(5U/μL)，无菌去离子水13.5μL。
(3)进行PCR扩增，PCR扩增的反应程序为94℃预变性10min，94℃变性30s，54.4℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物的验证方法为取3μLPCR产物，加入1μL Loading Buffer，混匀后点入1％琼脂糖凝胶中，220V/400mA电泳，电泳时间为18min。
(4)对PCR扩增产物进行酶切，酶切反应体系为：PCR产物5μL(浓度为0.1～0.5μg)，限制性核酸内切酶MspⅠ0.3μL，Buffer 1.5μL，去离子水8.2μL。酶切反应条件为：37℃水浴酶切3.5h后，4℃保存。
(5)酶切产物检测：取3μL酶切产物，加入1μL Loading Buffer，混匀后点入1％琼脂糖凝胶中，220V/400mA电泳，电泳时间为18min。若酶切产物具有或包含375bp的片段，则判断西瓜表现为厚果皮性状；若酶切产物不具有375bp的片段，则判断西瓜表现为薄果皮性状。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种鉴定西瓜果皮厚度的CAPS分子标记，其特征在于，所述CAPS分子标记为如SEQID NO.1所示的核苷酸片段和如SEQ ID NO.2所示的核苷酸片段；所述SEQ ID NO.1与薄果皮性状紧密连锁，所述SEQ ID NO.2与厚果皮性状紧密连锁；所述薄果皮性状的果皮厚度为小于0.7cm，厚果皮性状的果皮厚度为大于等于0.7cm。
2.一种鉴定西瓜果皮厚度的CAPS分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对包括如SEQ ID NO.3所示的上游引物和如SEQ ID NO.4所示的下游引物。
3.权利要求2所述的引物对在鉴定西瓜果皮厚度中的应用，其特征在于，所述应用为利用引物对扩增西瓜基因组DNA获得扩增产物，再利用限制性内切酶MspⅠ酶切扩增产物，根据酶切产物鉴定西瓜果皮厚度。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述西瓜基因组DNA取自幼苗期、抽蔓期或结果期的任一一个时期。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述根据酶切产物鉴定西瓜果皮厚度的方法为若酶切产物具有或包含375bp的片段，则判断西瓜表现为厚果皮性状；若酶切产物不具有375bp的片段，则判断西瓜表现为薄果皮性状。
6.一种鉴定西瓜果皮厚度的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待测西瓜的基因组DNA；
(2)以步骤(1)获得的基因组DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增，获得扩增产物；所述引物对包括如SEQ ID NO.3所示的上游引物和如SEQ ID NO.4所示的下游引物；
(3)利用限制性内切酶MspⅠ酶切扩增产物，根据酶切产物来鉴定西瓜果皮厚度。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述根据酶切产物来鉴定西瓜果皮厚度的方法为若酶切产物具有或包含375bp的片段，则判断西瓜表现为厚果皮性状；若酶切产物不具有375bp的片段，则判断西瓜表现为薄果皮性状。
8.权利要求6或7任意一项所述的方法在西瓜果皮厚度性状辅助鉴定、辅助育种及西瓜果皮厚度性状筛选中的应用。
9.一种用于鉴定西瓜果皮厚度性状的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有引物对和限制性内切酶MspⅠ；所述引物对包括如SEQ ID NO.3所示的上游引物和如SEQ ID NO.4所示的下游引物。
10.权利要求9所述的试剂盒在西瓜果皮厚度性状辅助鉴定、辅助育种及西瓜果皮厚度性状筛选中的应用。
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