CN117925712A - 一种基于细菌胞外囊泡的拟穴青蟹体内蛋白过表达方法 - Google Patents

一种基于细菌胞外囊泡的拟穴青蟹体内蛋白过表达方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于细菌胞外囊泡的拟穴青蟹体内蛋白过表达方法；该方法包括：将带有外源基因的重组质粒、细菌胞外囊泡和电转缓冲液混合，得到电转染体系；对电转染体系施加电击，电压为400‑600V，脉冲次数为1‑2次，单次电击脉冲的时间为1‑3ms；将电转后的体系注射到拟穴青蟹体内，检测外源蛋白的过表达情况；本发明提供的方法能够简单、高效和经济地生产携带生物活性物质的细菌胞外囊泡；同时，本发明提供的细菌胞外囊泡渗透性好，内毒素低，无显著免疫排斥反应，易被受体细胞摄取，能够在拟穴青蟹体内蛋白过表达，为无细胞系生物的蛋白过表达体系构建提供新思路。

Description

一种基于细菌胞外囊泡的拟穴青蟹体内蛋白过表达方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于细菌胞外囊泡的拟穴青蟹体内蛋白过表达的方法。
背景技术
由于高密度养殖模式、环境恶化等，青蟹的疾病爆发频繁，给青蟹养殖业带来了巨大的损失。目前在青蟹免疫研究中仍然缺乏有效的过表达手段，一定程度上阻碍了青蟹病害的防治。
细菌胞外囊泡是一种直径为30-150nm的致密的磷脂双分子层膜性囊泡，在细胞间信息交流、物质递送发挥重要作用，与非病毒载体中的脂质体相似，但功能和结构更为复杂，与真核生物中的外泌体类似。作为天然的纳米颗粒载体，具有低免疫原性、无内毒素、渗透性好等优势，目前是最具有潜力的药物递送载体，适合递送各种化学物质、蛋白质、核酸和基因治疗剂。
目前外源基因导入主要有物理、化学以及生物方法。物理方法包括电穿孔、基因枪、显微注射等；化学方法包括磷酸钙、纳米粒子介导等方法；生物方法有农杆菌转化法和病毒转染法。各类外源基因导入技术在应用过程中具备各自的优缺点。显微注射技术成功率高，但其操作复杂、实验进程长、对设备及操作要求高；电穿孔技术通常采用病毒和脂质体进行转染，然而病毒介导的转染适用性受限，且安全性较差；而脂质体转染对细胞毒性大。
拟穴青蟹作为开管式循环的甲壳类动物，尚且没有可供使用的成熟细胞系，无法利用上述技术将外源基因直接导入拟穴青蟹体细胞内进行过表达。
因此，针对上述问题提出一种基于细菌胞外囊泡的拟穴青蟹体内蛋白过表达的方法。
发明内容
本发明旨在提供一种基于细菌胞外囊泡的拟穴青蟹体内蛋白过表达的方法，该方法利用电场刺激将DNA质粒非内吞地递送至细菌胞外囊泡中，这些胞外囊泡内毒素含量低，同时能够高效地被受体细胞摄取，可以将活性物质带入受体细胞，发挥活性物质的生物学作用。
本发明提供一种基于细菌胞外囊泡的拟穴青蟹体内蛋白过表达方法，包括以下步骤：
S1、构建克隆载体，筛选阳性克隆并提取质粒；
S2、通过工程菌诱导细菌胞外囊泡分泌，并通过超滤法提取所述细菌胞外囊泡；
S3、将所述细菌胞外囊泡与所述质粒、电转缓冲液混匀后电击，制得电转染体系；
S4、将所述电转染体系注射到拟穴青蟹体内进行蛋白过表达。
可选地，步骤S1中所述质粒中包含外源基因。
可选地，步骤S2中所述工程菌外膜上为被修饰过的类脂，不会引起内毒素反应。
可选地，步骤S2中所述超滤法包括以下步骤：
6000×g离心10min，得到上清液一及沉淀；
加入PBS重悬沉淀并进行超声破碎，制得破碎液；
将破碎液于6000×g，离心30min得上清液二；
将上清液一与上清液二混合并通过0.22μm滤膜过滤后得到滤液；
将滤液加入100kDa的超滤管中，2000×g离心10min；
将上一步离心得到的上清液加入100kDa的超滤管中，2000×g离心10min；重复此步骤至离心得到的上清液体积浓缩至1mL，制得到细菌胞外囊泡浓缩液。
可选地，步骤S3中所述电击的参数为：单次脉冲的电压为400-600V；单次脉冲的时间为1-3ms；共1-2次脉冲。
可选地，步骤S3中所述电转染体系的体积为150-200μL。
可选地，步骤S3中所述电转染体系中细菌胞外囊泡的颗粒数目为(1.0～5.0)×1010。
另一方面，本发明提供的方法可应用于无细胞系生物体内构建蛋白过表达技术。
本发明具备的有益效果包括：
(1)本发明提供的方法能够简单、高效和经济地生产携带生物活性物质的细菌胞外囊泡；
(2)本发明提供的方法中制得的胞外囊泡可以被受体细胞所摄取发挥生物活性物质的作用，且本发明所使用的胞外囊泡渗透性好，内毒素低，无显著免疫排斥反应；
(3)本发明提供的电转染体系及其参数，能够稳定地将质粒转入拟穴青蟹外泌体中，并且在拟穴青蟹体内进行蛋白表达，可为无细胞系生物的蛋白过表达体系构建提供新思路。
附图说明
图1为实施例1中提取的细菌胞外囊泡的纳米颗粒跟踪分析图；
图2为实施例1中提取的细菌胞外囊泡的透射电镜图；
图3为实施例和对比例中拟穴青蟹体内EGFP蛋白过表达后血细胞的荧光显微镜图(图3中的A为实施例1的荧光显微镜图；图3中的B为对比例1的荧光显微镜图；图3中的C为实施例2的荧光显微镜图；图3中的D为对比例2的荧光显微镜图)；
图4为实施例和对比例中拟穴青蟹体内EGFP蛋白过表达后血细胞蛋白的Westernblot图(图4中的A为实施例1的EGFP蛋白表达结果；图4中的B为对比例1的EGFP蛋白表达结果；图4中的C为实施例2的EGFP蛋白表达结果；图4中的D为对比例2的EGFP蛋白表达结果)。
具体实施方式
本发明将结合说明书附图，通过以下实施例作进一步说明。
本发明实施例提供一种基于细菌胞外囊泡的拟穴青蟹体内蛋白过表达方法，包括以下步骤：
S1、构建克隆载体，筛选阳性克隆并提取质粒；
S2、通过工程菌诱导细菌胞外囊泡分泌，并通过超滤法提取所述细菌胞外囊泡：
S3、将所述细菌胞外囊泡与所述质粒、电转缓冲液混匀后电击，制得电转染体系；
S4、将所述电转染体系注射到拟穴青蟹体内进行蛋白过表达。
具体的，步骤S1中所述质粒中包含外源基因。
一些实施例中，步骤S2中所述工程菌外膜上为被修饰过的类脂，不会引起内毒素反应。
一些实施例中，步骤S2中所述超滤法包括以下步骤：
6000×g离心10min，得到上清液一及沉淀；
加入PBS重悬沉淀并进行超声破碎，制得破碎液；
将破碎液于6000×g，离心30min得上清液二；
将上清液一与上清液二混合并通过0.22μm滤膜过滤后得到滤液；
将滤液加入100kDa的超滤管中，2000×g离心10min；
将上一步离心得到的上清液加入100kDa的超滤管中，2000×g离心10min；重复此步骤至离心得到的上清液体积浓缩至1mL，制得到细菌胞外囊泡浓缩液。
一些实施例中，步骤S3中所述电击的参数为：单次脉冲的电压为400-600V；单次脉冲的时间为1-3ms；共1-2次脉冲。
具体的，多次脉冲的间隔时间为10-20s。
具体的，步骤S3中所述电转染体系的体积为150-200μL。
具体的，步骤S3中所述电转染体系中细菌胞外囊泡的颗粒数目为(1.0～5.0)×1010。
一些实施例中，步骤S4拟穴青蟹注射电转染体系的注射量为4-6μL/g。
具体的，拟穴青蟹体内注射电转染体系的量为5μL/g
一些实施例中，注射电转染体系后拟穴青蟹的培养时间为24-48h。
另一方面，本发明提供的方法可应用于无细胞系生物体内构建蛋白过表达技术。
本发明实施例中使用的表达载体、试剂盒均为市售；其中表达载体pGL3-BasiC购自丰晖生物，货号：BR014；无内毒素试剂盒购自天根生化科技北京有限公司，货号：DP120。
实施例1
本发明实施例1提供一种基于细菌胞外囊泡的拟穴青蟹体内蛋白过表达的方法，包括以下步骤：
S1、构建克隆载体，筛选阳性克隆并提取质粒，包括以下子步骤：
S11、将EGFP基因克隆到表达载体pGL3-BasiC上，得到pGL3-EGFP载体；并根据序列设计引物；设计得到的引物5’-3’端上下游序列如下所示：
F：CTGTAAAACACAACATATCCAGTCA；
R：TTGGAACCTCTTACGTGCCG；
S12、将构建得到的pGL3-EGFP载体，于42℃下热处理60s转化到感受态细胞DH5α中，于37℃培养复苏1h，得到培养液；
S13、培养完成后，将培养液涂布到LB平板(含有氨苄青霉素)上进行筛选，37℃培养12h；
S14、培养完成后，挑取LB平板上的单菌落进行菌落PCR和Nco I和Not I双酶切鉴定阳性克隆，筛选得到阳性克隆菌株，经37℃，150rpm培养12h后提取质粒对EGFP基因进行二代测序；
S15、测序后质粒序列中EGFP基因与步骤S11中克隆前的EGFP基因序列相同的菌株于37℃，150rpm培养12h；培养完成后，用无内毒素试剂盒提取pGL3-EGFP质粒，最后质粒溶于无菌且无内毒素的水中，用Nanodrop测核酸浓度，质粒浓度低于100ng/μL判断为转染效果略差；
S2、通过工程菌诱导细菌胞外囊泡分泌，并通过超滤法提取所述细菌胞外囊泡，包括以下子步骤：
S21、将工程细菌接种到含有氨苄抗生素(最终浓度为50μg/mL)的LB培养基中，37℃培养12-16h至OD值为0.8；
LB培养基的制备过程包括，取胰蛋白胨3g，酵母膏1.5g，氯化钠3g，加超纯水定容至300mL，混匀。
S22、培养完成后，加入Tween-20(10000：1)诱导分泌胞外囊泡；37℃培养2h后进行离心；
S23、4℃，6000×g，离心10min，得到上清液一和沉淀一；原离心管中沉淀一加入100mL-PBS后进行超声破碎，得到破碎液；
S24、将破碎液在4℃，6000×g离心30min，收集上清液二至新的离心管中；
S25、将上清液一和上清液二混合后过0.22μm滤膜，得到滤液；
S26、将滤液加入100kDa超滤管中，2000×g，离心10min；
S27、离心后将上清液加入100kDa超滤管中，2000×g，离心10min，重复此步骤至上清液体积浓缩至1mL；制得细菌胞外囊泡浓缩液；
步骤S21中使用的工程细菌其外膜上为修饰后的类脂，所述类脂与野生型的脂多糖(LPS)相比，缺乏寡糖链和两条二级酰基链，不能诱导活化的hTLR4/MD-2复合物的形成，避免了LPS-TLR4/NF-kB信号通路的内毒素反应；
S3、将所述细菌胞外囊泡与所述质粒、电转缓冲液混匀后电击，制得电转染体系，包括以下子步骤：
S31、取步骤S25中制得的细菌胞外囊泡悬浮液125μL中加入50μL EBEL电转缓冲液(苏州壹达生物科技)，调整细菌胞外囊泡浓度至1×1011particles/mL，得到混合液一；
S32、在混合液一中加入步骤S15中制得的25μL无内毒素pGL3-EGFP质粒，混合均匀，静置平衡3min后转移至2mm电转杯中，使用BIO-RAD MicroPulserElectroporator于电压400V电击2ms，脉冲1次，制得电转染体系；
S4、将所述电转染体系注射到拟穴青蟹体内进行蛋白过表达，包括以下步骤：
将步骤S32中制得的电转染体系从第三附肢关节处注射到拟穴青蟹体内，注射的电转染体系与拟穴青蟹的体积质量比为5μL/g；注射体系中细菌胞外囊泡中含有携带EGFP基因的质粒。
实施例2
本发明实施例2提供一种基于细菌胞外囊泡的拟穴青蟹体内蛋白过表达的方法，与实施例1的不同之处在于S32步骤中电击电压为600V；其他条件、步骤保持一致。
对比例1
本发明对比例1提供一种不进行注射的拟穴青蟹。
对比例2
本发明对比例2提供一种基于细菌胞外囊泡的拟穴青蟹体内蛋白过表达的方法，与实施例1的不同之处在于S32步骤中不进行电击；其他条件、步骤保持一致。
性质检测
1.对实施例1中制得的细菌胞外囊泡进行粒径分析和形态鉴定：
取步骤S27制得的细菌胞外囊泡浓缩液进行纳米粒度跟踪分析，结果如图1所示；
透射电镜进行鉴定，结果如图2所示；
2.对实施例中完成注射的拟穴青蟹及对比例中不进行注射的拟穴青蟹进行蛋白过表达检测，包括以下步骤：
D1、将注射完成后在蟹公寓中加入刚好没过青蟹的盐度为25‰的海水，25℃培养24h，抽取血淋巴，850×g离心10min获得血细胞；一份用于荧光检测，一份用于Westernblot检测EGFP蛋白的表达情况；
D2、将其中一份血细胞固定于共聚焦皿，进行荧光检测，结果如图3所示；
D3、在另一份血细胞中加入400μL RIPA裂解液，4℃下进行超声破碎后静置10min；4℃，12000×g，离心10min；
D4、离心完成后取100μL上清至新的离心管中，加入20μL 6X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，混匀后95℃加热10min，得到处理样品；
D5、通过Western blot检测EGFP蛋白在拟穴青蟹体内的表达，结果如图4所示。
结果分析：
参见图1，纳米颗粒跟踪分析显示本发明提供的方法提取的细菌胞外囊泡的纯度高，集中在30nm-150nm的范围内，峰值在97nm处，峰值处浓度达到了2.6E+6颗粒/mL，总浓度达到了2.2E+10颗粒/mL。
参见图2，在透射电子显微镜下细菌胞外囊泡呈圆形或椭圆形的杯托状双层膜结构，且背景干净，这说明本发明提供的方法，不对细菌胞外囊泡的形态造成影响。
参见图3，对比例的荧光检测中可以看见，未经电击的电转染体系注入到拟穴青蟹体内没有表达EGFP蛋白，荧光在共聚焦显微镜下未被激发出绿色荧光；从图3中的A、图3中的B来看，在实施例1、2中注射电转染体系后的拟穴青蟹血细胞中均可见绿色荧光，说明本发明提供的电转参数400V-600V的条件下，均可达到质粒电转染的要求。
参见图4，Western blot的结果以β-tubulin作为内参蛋白，作为蛋白表达的标准；在实施例1、2中，25kDa处均出现明显条带，并且条带大小与EGFP蛋白大小相符；在对比例中，25kDa未出现明显条带；证明，本发明以细菌胞外囊泡为载体，在拟穴青蟹体内表达了拟穴青蟹本身不存在的蛋白，实现了蛋白过表达。
虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。

Claims (8)

1.一种基于细菌胞外囊泡的拟穴青蟹体内蛋白过表达方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、构建克隆载体，筛选阳性克隆并提取质粒；
S2、通过工程菌诱导细菌胞外囊泡分泌，并通过超滤法提取所述细菌胞外囊泡；
S3、将所述细菌胞外囊泡与所述质粒、电转缓冲液混匀后电击，制得电转染体系；
S4、将所述电转染体系注射到拟穴青蟹体内进行蛋白过表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述质粒中包含外源基因。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述工程菌外膜上为被修饰过的类脂，不会引起内毒素反应。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述超滤法包括以下步骤：
6000×g离心10min，得到上清液一及沉淀；
加入PBS重悬沉淀并进行超声破碎，制得破碎液；
将破碎液于6000×g，离心30min得上清液二；
将上清液一与上清液二混合并通过0.22μm滤膜过滤后得到滤液；
将滤液加入100kDa的超滤管中，2000×g离心10min；
将上一步离心得到的上清液加入100kDa的超滤管中，2000×g离心10min；重复此步骤至离心得到的上清液体积浓缩至1mL，制得到细菌胞外囊泡浓缩液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述电击的参数为：单次脉冲的电压为400-600V；单次脉冲的时间为1-3ms；共1-2次脉冲。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述电转染体系的体积为150-200μL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述电转染体系中细菌胞外囊泡的颗粒数目为(1-5)×1010。
8.如权利要求1所述的方法在1-7任一项在无细胞系生物体内构建蛋白过表达技术中的应用。
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