CN117925694A - 一种提高大豆耐盐和抗旱能力的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物育种领域，具体涉及一种提高大豆耐盐和抗旱能力的方法。本发明公开了一个与大豆耐盐和抗旱能力有关的基因，通过编辑该基因可以提高大豆耐盐和抗旱能力。

Description

一种提高大豆耐盐和抗旱能力的方法及其应用

技术领域

本发明属于植物育种领域，具体涉及一种提高大豆耐盐和抗旱能力的方法。

背景技术

大豆是我国主要的粮食作物之一，也是关系国计民生的战略性物资。近年来，受人类活动干扰影响，各地自然灾害频发。其中，干旱的气候条件以及土壤盐碱化对大豆的生产造成了极大的影响，提高大豆的抗旱和耐盐能力具有重要的价值。

由于抗逆性状的复杂性，大豆中鉴定出来的与抗逆相关的基因还比较少，这在一定程度上限制了培育抗逆大豆新品种所能应用的技术手段。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于公开一种与大豆抗旱和耐盐性相关的蛋白和核酸序列，提供了一种提高大豆耐盐和/或抗旱能力的方法，并提供具有高耐盐和/或抗旱效果的人工突变基因和突变蛋白。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种大豆基因在提高大豆耐盐和/或抗旱能力中的应用，其特征在于，所述基因的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供一种提高大豆耐盐和/或抗旱能力的方法，其特征在于，在待改良大豆材料中降低上述基因的表达和/或活性，选择耐盐和/或抗旱能力增加的植株。

在一些实施方案中，上述降低蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、定点插入有抑制作用的元件中任一种。

在一些实施方案中，上述基因编辑的靶标序列如SEQ ID NO.4所示。

在一些实施方案中，上述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。

本发明还提供一种用于提高大豆耐盐和/或抗旱能力的试剂盒，其特征在于：包括如下1)～3)任一种和Cas9蛋白：

(1)能够识别上述靶标序列的RNA分子；在一些实施方案中，上述的RNA分子的序列如SEQ ID NO.5所示；

(2)编码(1)所述RNA的DNA分子；

(3)表达(1)所述RNA的载体。

本发明还提供一种突变基因，其特征在于：所述突变基因序列为SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供一种突变蛋白，其特征在于：所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示。

本发明还提供对大豆进行育种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)获得上述突变基因的大豆；

2)将步骤1)所获得的大豆通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到大豆植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；

3)对步骤2)所获得的后代大豆植株进行抗旱或耐盐性鉴定，选择耐盐和/或抗旱能力提高的大豆植株。

本发明的有益效果如下：本发明通过基因筛选和抗逆性鉴定，获得了一个与大豆耐盐和抗旱性相关的基因GmTRE，并明确编辑该基因后能够提高大豆耐盐和抗旱性。本发明还明确了一种能够使得大豆抗逆和产量性状表现均较佳的突变基因。上述发明内容均有助于培育新的耐盐和抗旱大豆新品种。

附图说明

图1pGWB535载体图。

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。

除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”、“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。

在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。所述杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可以用诸如32P的可检测基团或其它可检测标志物来标记。因而，例如，可以通过标记基于实施方案序列的合成寡核苷酸制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA及基因组文库的方法通常为本领域已知。可以在严紧条件下进行所述序列的杂交。如本文所用，术语“严紧条件”或“严紧杂交条件”表示如下条件，即在该条件下，相对于与其它序列杂交，探针将以可检测的更大程度(例如，背景的至少2倍、5倍或10倍)与其靶序列杂交。严紧条件是序列依赖性的并且在不同环境中有所不同。通过控制杂交严紧性和/或控制清洗条件，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列(同源探针法)。可选择地，可以调节严紧条件，以允许一些序列错配，以便检测较低的相似度(异源探针法)。通常，探针长度少于约1000或500个核苷酸。通常，严紧条件是如下的条件，即在该条件中，盐浓度为pH 7.0至8.3下，少于约1.5M Na离子，通常约0.01M至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且温度条件为：当用于短探针时(例如10到50个核苷酸)，至少约30℃；当用于长探针时(例如大于50个核苷酸)，至少约60℃。还可以通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现严紧条件。示例性的低严紧条件包括37℃下使用30％至35％的甲酰胺缓冲液、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)杂交，50℃至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中清洗。示例性的中度严紧条件包括37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，55℃至60℃下在0.5×至1×SSC中清洗。示例性的高严紧条件包括37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，60℃至65℃下在0.1×SSC中最后清洗至少约20分钟。任选地，清洗缓冲液可以包含约0.1％至约1％SDS。杂交持续时间通常少于约24小时，通常为约4小时至约12小时。特异性通常依赖杂交后的清洗，关键因素在于最后清洗溶液的离子强度和温度。DNA-DNA杂合体的Tm(热力学熔点)可以近似自Meinkoth andWahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的公式：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是一价阳离子的克分子浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，“甲酰胺％”是杂交溶液的甲酰胺百分数，而L是杂合体的碱基对长度。Tm是(确定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。通常将清洗至少进行至达到平衡，并且达到低的杂交背景水平，诸如进行2小时、1小时或30分钟。每1％的错配对应使Tm降低约1℃；因而，可以调节Tm、杂交和/或清洗条件，从而与所需一致性的序列杂交。例如，如果需要≥90％一致性的序列，可以将Tm降低10℃。通常，将严紧条件选择为比确定离子强度和pH下的特异序列及其互补序列的Tm低约5℃。然而，在非常严紧的条件下，可以在比所述Tm低4℃下进行杂交和/或清洗；在中度严紧条件下，可以在比所述Tm低6℃下进行杂交和/或清洗；在低严紧条件下，可以在比所述Tm低11℃下进行杂交和/或清洗。

除非另外指明，本说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、反应条件等的所有数字应被理解为在所有情况下用术语“约”来修饰。如本文所使用的术语“约”，当指代可测量的值例如质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的量时，意味着涵盖在一些实施例中与规定量相比±20％的变化、在一些实施例中与规定量相比±10％的变化、在一些实施例中与规定量相比±5％的变化、在一些实施例中与规定量相比±1％的变化、在一些实施例中与规定量相比±0.5％的变化、以及在一些实施例中与规定量相比±0.1％的变化，因为此类变化适合于执行所披露的方法和/或使用所披露的组合物、核酸、多肽等。因此，除非相反地指出，在本说明书和所附权利要求书中所列出的数值参数是可以取决于试图通过本申请披露的主题获得的期望特性而变化的近似值。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:alaboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例

实施例1大豆耐盐抗旱相关基因的发现

海藻糖可以被海藻糖酶催化生成糖苷，海藻糖酶在非生物胁迫耐受中有一定的作用。然而，大豆中参与海藻糖代谢的基因究竟是哪一个，该基因与哪一种非生物胁迫有关，以及如何操作能够提高大豆对非生物胁迫的耐受性是不确定的。

发明人首先通过生物信息的方法进行分析，找到了一些与海藻糖代谢途径相关的基因，包括5个海藻碳6磷酸合酶基因，2个海藻糖6磷酸酯酶基因以及1个海藻糖酶基因。所以编辑一个海藻糖酶可达到调节海藻糖代谢的目的，并尝试使用基因编辑的方法突变这些基因以测试其与非生物胁迫耐受的效果。

基因编辑载体骨架为大豆基因编辑专用载体pGES401(具体参考Bai M,Yuan C,Kuang H,et al.Combination of two multiplex genome-edited soybean varietiesenables customization of protein functional properties[J].Mol Plant.2022,15(7):1081-1083.)，sgRNA靶标序列设计可通过在线工具设计，如http://crispr.dbcls.jp/，经过Oligo退火后，通过Bsa I酶切克隆进入pGES401载体。

构建好的大豆基因编辑载体通过农杆菌侵染子叶节法进行大豆遗传转化。首先对大豆种子采用氯气灭菌，在培养基上萌发后，取子叶节作为外植体并进行农杆菌侵染。外植体随后历经诱导培养、伸长培养、生根培养等过程进行筛选。筛选抗性为Basta。T0抗性苗PCR初步鉴定后转入土培并收种。T1代种子萌发后在叶片涂抹Basta，阳性植株再进行PCR鉴定，获得稳定转化植株，并开展后续试验。

将获得的编辑植株进行盐和干旱的胁迫处理，具体方法为：

(1)蛭石培养盐胁迫处理：

在播种7天时挑选长势较好、整齐一致的大豆幼苗移栽至新的小黑盒里，且每个小黑盒含有相同体积的蛭石，每个小黑盒里移栽6棵植株继续培养。播种10天后开始进行盐胁迫处理。将大豆低氮营养液的母液稀释后加入氯化钠固体配成250mmol/L的盐胁迫处理液后调pH值为5.8-6.0，处理组每个小黑盒每次加入盐胁迫处理液150mL，对照组每次加入150mL大豆低氮营养液。盐处理出现明显表型后统计植株存活率。

(2)蛭石培养干旱胁迫处理：

在播种7天时挑选长势较好、整齐一致的大豆幼苗移栽至新的小黑盒里，且每个小黑盒含有相同体积的蛭石，每个小黑盒里移栽6株植株继续培养。在干旱胁迫处理中，处理组在播种10天和对照组浇过相同体积的大豆低氮营养液之后开始断水处理，对照组则会在处理期间添加大豆低氮营养液。不同株系在干旱处理出现明显表型后进行复水处理，在进行复水处理的第5天统计植株存活率。

结果显示，两个基因编辑植株在盐胁迫和干旱胁迫下表现出更高的耐受能力。进一步研究显示，这两个基因编辑植株中的H₂O₂含量也显著降低。

编辑靶点的鉴定和分析结果显示，这两个基因编辑植株的靶标序列均为“5’-TTTTGGATGCTCAAGGTTGC-3’”，该靶标位于大豆GmTRE基因外显子区。GmTRE基因的基因组序列如SEQ ID NO.3所示，编码区序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

检测结果表明，两个编辑植株的GmTRE基因被编辑后，表达的蛋白都被截短，从而产生的敲除的效果。两个编辑植株中GmTRE基因编辑后的编码区序列如SEQ ID NO.6和SEQID NO.8所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9所示。

发明人进一步构建了GmTRE基因的超表达大豆植株(超表达载体使用pGWB602，载体图见图1，具体信息参考Nakagawa T,Suzuki T,Murata S,et al.Improved Gatewaybinary vectors:high-performance vectors for creation of fusion constructs intransgenic analysis of plants.Biosci Biotechnol Biochem.,2007,71(8):2095-100.)。性状鉴定结果显示，与WT相比，GmTRE过表达系表现出对盐和干旱胁迫的敏感性，H₂O₂含量更高，存活率更低。这些结果表明，GmTRE对耐盐性和抗旱性具有负调控作用。

表2GmTRE基因编辑植株性状表现

实施例2优异植株的筛选

发明人进一步在田间正常栽培条件下调查了两个GmTRE基因编辑株系的农艺性状，包括株高、分枝数、荚数、百粒重、单株种子重、蛋白质含量和含油量。结果表明，虽然gmtre-2株系在盐胁迫和干旱胁迫下的成活率比gmtre-1株系要高，株高也比gmtre-1更高大(与受体对照更接近)，但是其种子数、种子重最低。因此，综合抗逆性和产量表现，gmtre-1是更优的编辑株系。gmtre-1株系可用于培育耐盐或抗旱的大豆新品种(例如通过回交转育的方式将gmtre-1中的GmTRE突变基因导入到其他大豆种质中，或使用基因工程手段将其他大豆种质中的GmTRE基因改造成gmtre-1中的突变基因)。

表2GmTRE基因编辑植株性状表现

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.大豆基因在提高大豆耐盐和/或抗旱能力中的应用，其特征在于，所述基因的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

2.一种提高大豆耐盐和/或抗旱能力的方法，其特征在于，在待改良大豆材料中降低权利要求1中所述基因的表达和/或活性，选择耐盐和/或抗旱能力增加的植株。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述降低蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、定点插入有抑制作用的元件中任一种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述基因编辑的靶标序列如SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。

6.一种用于提高大豆耐盐和/或抗旱能力的试剂盒，其特征在于：包括如下1)～3)任一种和Cas9蛋白：

(1)能够识别权利要求4中所述靶标序列的RNA分子；

(2)编码(1)所述RNA的DNA分子；

(3)表达(1)所述RNA的载体。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述的RNA分子序列如SEQ ID NO.5所示。

8.一种突变基因，其特征在于：所述突变基因序列如SEQ ID NO.6所示。

9.一种突变蛋白，其特征在于：所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

10.对大豆进行育种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)获得包含权利要求8所述突变基因的大豆；

2)将步骤1)所获得的大豆通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到大豆植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；

3)对步骤2)所获得的后代大豆植株进行抗旱或耐盐性鉴定，选择耐盐和/或抗旱能力提高的大豆植株。