CN116732050A - 增加玉米产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种增加玉米产量的方法，属于分子遗传学领域。本发明公开了一个玉米产量调控基因，并公开了增加玉米产量和/或生物量的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种增加玉米产量的方法，属于分子遗传学领域。
背景技术
玉米是我国重要的粮食和饲料作物，除此之外，还是医疗、化工和酿造等许多行业的不可或缺的原料，在我国国民经济中发挥重要的作用。玉米高产是单位面积穗数、穗粒数和粒重三个产量要素协调发展的结果，近年来有很多产量性状相关基因被克隆。然而，由于玉米产量或生物量调控机制的复杂性，需要获得更多的产量/生物量调控基因，以应用于实际的产量/生物量改良，培育更加高产/高生物量的玉米新种质。
发明人在之前的研究过程中，发现GRMZM2G005732这个基因会影响玉米开花期，超量表达该基因会延迟玉米的开花时间，而使用基因编辑技术突变该基因会提早玉米的开花时间，但这些操作不会改变玉米的产量性状(详见专利CN 112646820A)。
本发明意外发现，GRMZM2G005732基因的另外一个转录本T03与玉米产量和生物量性状均相关，在玉米中表达T03转录本可以增加玉米产量和/或生物量性状，进而能够培育高产/高生物量玉米新种质。这为培育高产/高生物量玉米新种质提供了新的方法。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一个影响玉米产量和/或生物量的核酸分子，以及含有该核酸分子的表达盒、表达载体和宿主细胞。
本发明的目的之二在于提供一种增加玉米产量和/或生物量的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种核酸分子在调控玉米产量和/或生物量中的应用，其特征在于：所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种表达盒在调控玉米产量和/或生物量中的应用，其特征在于，所述表达盒含有上述的核酸分子。
本发明还提供一种表达载体在调控玉米产量和/或生物量中的应用，其特征在于，所述表达载体含有上述的表达盒。
本发明还提供一种宿主细胞在调控玉米产量和/或生物量中的应用，其特征在于，所述宿主细胞含有上述的表达载体。
在一些实施方案中上述宿主细胞为原核生物细胞。
在一些实施方案中上述宿主细胞为大肠杆菌或农杆菌细胞。
本发明还提供一种增加玉米产量和/或生物量的方法，其特征在于：在玉米中表达上述的核酸分子，选择玉米产量和/或生物量增加的植株。
与现有的技术相比，本发明的有益效果是：本发明意外发现GRMZM2G005732的T03转录本的新功能——影响玉米产量和/或生物量。在玉米中表达T03转录本的核酸分子能够增加玉米的产量和/或生物量。上述核酸分子以及含有该核酸分子的表达盒、表达载体或宿主细胞可以用于改良玉米产量和/或生物量性状。
附图说明
图1表达T01转录本的3个玉米株系的产量/生物量相关性状表现。Plant height：株高；Ear height：穗位高；Aboveground biomass fresh weight：地上生物量湿重；Aboveground biomass dry weight：地上生物量干重。“+”阳性转基因植株；“-”阴性对照；“ns”：表示没有显著性差异。
图2含T03核酸分子的表达载体图。
图3表达T03转录本玉米的表型。“+”阳性转基因植株；“-”阴性对照；长线代表bar＝10cm。
图4表达T03转录本的4个玉米株系的产量/生物量相关性状表现。Plant height：株高；Ear height：穗位高；Aboveground biomass fresh weight：地上生物量湿重；Aboveground biomass dry weight：地上生物量干重。“+”阳性转基因植株；“-”阴性对照；“*”：表示有显著性差异；“**”：表示有极显著性差异。
具体实施方式
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”、“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。
术语“性状”是指植物或特定的植物材料或细胞的生理、形态、生化或物理特性。在一些情况下，此特性对人眼是可见的，诸如种子或植株大小，或者可通过生物化学技术测量，诸如检测种子或叶的蛋白质、淀粉或油含量，或者通过观察代谢或生理过程，例如通过测量对水剥夺或特定盐或糖或氮浓度的耐受性，或者通过观察一个或多个基因的表达水平，或者通过农艺观察结果诸如渗透胁迫耐受性或收率。
“转基因”是指其基因组因异源核酸(诸如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株。本文所用的术语“转基因”包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性繁殖而产生的那些，并且不涵盖通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件(诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)进行的基因组(染色体或染色体外)改变。
“植物”包括对整株植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及它们的子代的标引。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚芽、分生区域、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。“子代”包含植物的任何后续世代。
在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。
阴性或对照植物可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。
本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。
在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。所述杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可以用诸如32P的可检测基团或其它可检测标志物来标记。因而，例如，可以通过标记基于实施方案序列的合成寡核苷酸制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA及基因组文库的方法通常为本领域已知。可以在严紧条件下进行所述序列的杂交。如本文所用，术语“严紧条件”或“严紧杂交条件”表示如下条件，即在该条件下，相对于与其它序列杂交，探针将以可检测的更大程度(例如，背景的至少2倍、5倍或10倍)与其靶序列杂交。严紧条件是序列依赖性的并且在不同环境中有所不同。通过控制杂交严紧性和/或控制清洗条件，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列(同源探针法)。可选择地，可以调节严紧条件，以允许一些序列错配，以便检测较低的相似度(异源探针法)。通常，探针长度少于约1000或500个核苷酸。通常，严紧条件是如下的条件，即在该条件中，盐浓度为pH 7.0至8.3下，少于约1.5M Na离子，通常约0.01M至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且温度条件为：当用于短探针时(例如10到50个核苷酸)，至少约30℃；当用于长探针时(例如大于50个核苷酸)，至少约60℃。还可以通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现严紧条件。示例性的低严紧条件包括37℃下使用30％至35％的甲酰胺缓冲液、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)杂交，50℃至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中清洗。示例性的中度严紧条件包括37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，55℃至60℃下在0.5×至1×SSC中清洗。示例性的高严紧条件包括37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，60℃至65℃下在0.1×SSC中最后清洗至少约20分钟。任选地，清洗缓冲液可以包含约0.1％至约1％SDS。杂交持续时间通常少于约24小时，通常为约4小时至约12小时。特异性通常依赖杂交后的清洗，关键因素在于最后清洗溶液的离子强度和温度。DNA-DNA杂合体的Tm(热力学熔点)可以近似自Meinkoth andWahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的公式：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是一价阳离子的克分子浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，“甲酰胺％”是杂交溶液的甲酰胺百分数，而L是杂合体的碱基对长度。Tm是(确定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。通常将清洗至少进行至达到平衡，并且达到低的杂交背景水平，诸如进行2小时、1小时或30分钟。每1％的错配对应使Tm降低约1℃；因而，可以调节Tm、杂交和/或清洗条件，从而与所需一致性的序列杂交。例如，如果需要≥90％一致性的序列，可以将Tm降低10℃。通常，将严紧条件选择为比确定离子强度和pH下的特异序列及其互补序列的Tm低约5℃。然而，在非常严紧的条件下，可以在比所述Tm低4℃下进行杂交和/或清洗；在中度严紧条件下，可以在比所述Tm低6℃下进行杂交和/或清洗；在低严紧条件下，可以在比所述Tm低11℃下进行杂交和/或清洗。
在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本申请涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本申请还包括源于本申请的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申请的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。
在核酸扩增的情况下术语“扩增”是其中产生附加拷贝的选择核酸(或其转录形式)的任何过程。一般的扩增方法包括基于多种聚合酶的复制方法，包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶介导的方法如连接酶链反应(LCR)以及基于RNA聚合酶的扩增(例如通过转录)方法。
本文所用术语“自交系”指在人工控制自花授粉情况下，经若干代，不断淘汰不良的穗行，选择农艺性状较好的单株进行自交，从而获得农艺性状较整齐一致、遗传基础较单纯的系。
“种质”指个体(例如植株)、一组个体(例如植株品系、品种或家族)、或来源于品系、品种、物种或培养物的克隆的或从其中得到的遗传物质。种质可为生物或细胞的部分，或者可从生物或细胞中分离得到。种质通常提供遗传物质与特异性分子构成，该分子构成提供生物或细胞培养物的一些或全部遗传性状的物理基础。如本文所用，种质包括可从中生长出新植株的细胞、种子或组织，或者植株部分如叶、茎、花粉、或细胞，它们能够被培养成整个植株。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:alaboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1GRMZM2G005732基因T01转录本功能研究
发明人在之前的研究过程中，发现GRMZM2G005732这个基因(信息详见maizeGDB，http://www.maizegdb.org)会影响玉米开花期，超量表达该基因(T01转录本)会延迟玉米的开花时间，而使用基因编辑技术突变该基因会提早玉米的开花时间(详见专利CN112646820 A)。
发明人进一步对超表达T01转录本的3个玉米株系进行了产量性状鉴定，结果发现，这3个玉米株系除了花期有改变外，株高、穗位高、地上生物量湿重及地上生物量干重等产量/生物量相关性状与对照相比均无显著性差异(见图1)。
实施例2GRMZM2G005732基因T03转录本功能研究
进一步查询GRMZM2G005732基因在maizeGDB数据库中的信息发现，该基因预测的转录本有3个。由于公开资料并未明确这些转录本是否有不同的功能以及具体的功能是什么，因此发明人通过人工合成的方式获得其他转录本的核酸分子(直接克隆无法获得)以进一步对其功能进行研究。由于T02转录本编码的氨基酸序列很短，本发明参考T03转录本的CDS序列(如SEQ ID NO.1所示)，依照单子叶植物密码子偏好性重新人工优化合成了序列GRMZM2G005732-T03(如SEQ ID NO.2所示)，优化后的序列与数据库重的CDS序列编码一致的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
依据专利CN 112646820 A实施例3中的方法将人工优化密码子后的合成的GRMZM2G005732-T03 CDS核酸分子构建到表达载体上并转化玉米。
具体为：载体使用pCAMBIA3300作为骨架。pCAMBIA3300质粒用BamHI、SacI双酶切，回收载体片段；将人工合成的T03设计BamHI、SacI酶切位点，酶切后连接到pCAMBIA3300的BamHI、SacI位点间，构建植物表达载体(载体图见图2)。构建好的载体含有T03表达盒(含ZmUbi启动子和nos终止子)和bar基因表达盒(含35s启动子和PolyA终止子)。载体质粒转化至农杆菌EHA105中。
含有表达载体的农杆菌EHA105分别在YEP固体培养基上涂布，28℃下暗培养1-3天。将培养好的农杆菌从平板上刮下重悬，调OD550至0.3，制成侵染液备用。取授粉后9-12天的玉米KN5585(来自未米生物科技(江苏)有限公司，品种权申请号20191002444)幼穗，剥去苞叶，75％酒精消毒10min，剥取幼胚于装有2mL重悬液的离心管中，每管100个幼胚，备用。侵染时弃尽重悬液，加入2mL侵染液，温和颠倒离心管数次混匀，室温暗处静止5min。侵染结束后，幼胚盾片朝上接种于共培养基中，20℃暗培养3天。转至静息培养基中，28℃暗培养7天。再转至含有1.5mg/L双丙氨膦的选择培养基S1中，28℃暗培养2周。如已得到初始愈伤组织，将其转至含有3mg/L双丙氨膦的筛选培养基S2中，以后每两周更换一次S2培养基。当筛选得到的抗性愈伤组织增殖至直径2cm左右时，将其转至暗分化培养基上，25℃暗培养2-3周。将分化得到的胚芽鞘转至光分化培养基上，25℃光下培养2周。待胚芽鞘形成完整的幼苗和根，将幼苗转入培养瓶中促根壮苗。10天后将幼苗移栽入营养钵，室内温室中培养。待幼苗长出1-2片新叶后移入大花盆。将转基因玉米及对照种植于吉林省农业科学院海南南繁转基因试验基地，并对所有材料进行PCR检测，以确定是阳性的转基因株系。
选取PCR检测结果为阳性的材料及KN5585阴性对照材料进行表型比较，发现转入了T03的玉米与KN5585对照相比株高、穗位高、茎节数均明显增加，茎变粗，叶片数量增多(见图3)。
选择4个株系调查株高、穗位高、地上部分生物量(湿重和干重)性状。不同株系及对照选取长势一致的5株材料进行调查。其中地上部分生物量(湿重)将植株从试验田中取回马上进行称重，取整株除穗以外的全部组织进行称重，干重的测量为地上部分自然风干30日后再次测量。结果显示，转T03的株系比对照的株高增加了24％～53％，穗位高增加了95％～154％，地上生物量湿重增加81％～134％，地上生物量干重增加60％～98％(图4)。
结合表型和农艺性状数据分析，发现表达T03的玉米比阴性对照表现为株高、穗位高、地上部生物量的显著增加。
这些结果表明，GRMZM2G005732基因的另外一个转录本T03与玉米产量和生物量性状均相关，在玉米中表达T03转录本可以增加玉米产量和/或生物量性状，进而能够培育高产/高生物量玉米新种质。这为培育高产/高生物量玉米新种质提供了新的方法。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种核酸分子在调控玉米产量和/或生物量中的应用，其特征在于：所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种表达盒在调控玉米产量和/或生物量中的应用，其特征在于，所述表达盒含有权利要求1中所述的核酸分子。
3.一种表达载体在调控玉米产量和/或生物量中的应用，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2中所述的表达盒。
4.一种宿主细胞在调控玉米产量和/或生物量中的应用，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3中所述的表达载体。
5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核生物细胞。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌或农杆菌细胞。
7.一种增加玉米产量和/或生物量的方法，其特征在于：在玉米中表达权利要求1中所述的核酸分子，选择玉米产量和/或生物量增加的植株。
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