CN117925568A - 一种羧酸酯酶突变体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种羧酸酯酶突变体及其制备方法与应用，涉及基因工程技术领域，所述羧酸酯酶突变体包括在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列上发生如下突变：第180位异亮氨酸替换为亮氨酸、第206位脯氨酸替换为丙氨酸和第282位丝氨酸替换为缬氨酸，在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列上，选择I180、P206和S282突变位点作为改造的位点，得到羧酸酯酶突变体，显著提高了其选择性拆分3‑环己烯‑1‑羧酸甲酯制备(S)‑3‑环己烯‑1‑甲酸的活性，光学纯度可达99.2％以上。得到的羧酸酯酶突变体可在细胞上清中可溶性表达，可通过微生物发酵进行大规模生产，反应条件温和，操作过程简便，更适用于工业生产。

Description

一种羧酸酯酶突变体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种羧酸酯酶突变体及其制备方法与应用。
背景技术
(S)-3-环己烯-1-甲酸(CAS号：5708-19-0)，是口服抗凝药依度沙班的关键中间体。以往的报道中，化学法和酶法拆分外消旋酯或者酸是合成光学纯环己烯甲酸的重要方法。在化学Diels-Alder反应是合成(S)-3-环己烯-1-甲酸的主要途径，但是该方法反应条件严苛，步骤非常繁琐，至少需要六次重结晶才能得到光学纯的(S)-3-环己烯-1-甲酸，拆分收率仅20％左右。另外，化学拆分中会用到大量的有机试剂，造成环境污染，经济型很低。
生物催化具有绿色、环保、经济型高的优势，可以弥补生产中有机试剂的使用。目前，现有的商业化酶包括猪肝酯酶(PLE)，马肝酯酶(HLE)和猪胰脂肪酶(PPL)可以拆分3-环己烯-1-羧酸甲酯，但是这几种动物来源的商品酶价格昂贵、批次差异大，难以实现工业化生产。除此之外，文献中也报道过一些羧酸酯酶，包括AcEst1(Bioresour Technol，2020，317，123984)，AcCarEst3(Org Lett，2021，23，3043-3047)，和BioH(Biosci BiotechnolBiochem，2019，83，1263-1269)，这些酶存在对应选择性不够高，结果仅限于实验室条件下等不足，难以实现大规模生产。
因此，针对外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯的拆分，迫切需要一种高催化活性和高选择性的生物催化剂，以满足工业化生产的需求。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种羧酸酯酶突变体，以解决现有技术中存在应用于拆分3-环己烯-1-羧酸甲酯的升温催化剂的催化活性低和选择性低的问题。
本发明的目的之二在于提供一种编码上述的羧酸酯酶突变体的多核苷酸。
本发明的目的之三在于提供一种重组载体。
本发明的目的之四在于提供一种重组细胞。
本发明的目的之五在于提供一种构建上述的重组细胞的方法。
本发明的目的之六在于提供一种羧酸酯酶突变体的制备方法。
本发明的目的之七在于提供上述的羧酸酯酶突变体或应用上述的制备方法制备的羧酸酯酶突变体在制备(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用。
本发明的目的之八在于提供一种(S)-3-环己烯-1-甲酸的制备方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种羧酸酯酶突变体，所述羧酸酯酶突变体包括在SEQID NO.1所示氨基酸序列上发生如下突变：第180位异亮氨酸替换为亮氨酸、第206位脯氨酸替换为丙氨酸和第282位丝氨酸替换为缬氨酸。
进一步的，所述羧酸酯酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第二方面，本发明提供了一种编码上述的羧酸酯酶突变体的多核苷酸；
优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
第三方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体携带上述的核苷酸序列；
优选地，所述重组载体为pET28a(+)、pET21a(+)或pET21b(+)；
优选地，所述重组载体含有T7启动子。
第四方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞表达上述的羧酸酯酶突变体，或携带上述的核苷酸序列，或携带上述的重组载体。
第五方面，本发明提供了一种构建上述的重组细胞的方法，包括以下步骤：将上述的重组载体转化至宿主菌中，得到重组细胞；
优选地，所述宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或者酿酒酵母。
第六方面，本发明提供了一种羧酸酯酶突变体的制备方法，包括以下步骤：将上述的重组细胞或应用上述的方法构建的重组细胞进行培养，得到含有胞内表达重组载体的菌体；破碎所述菌体得到所述羧酸酯酶突变体；
优选地，还包括对得到的羧酸酯酶突变体进行分离纯化的步骤。
第七方面，本发明提供了如上述的羧酸酯酶突变体或应用上述的制备方法制备的羧酸酯酶突变体在制备(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用。
第八方面，本发明提供了一种(S)-3-环己烯-1-甲酸的制备方法，包括以下步骤：将上述的羧酸酯酶突变体、缓冲液和外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯混合均匀，进行催化反应，反应产物经纯化得到(S)-3-环己烯-1-甲酸；
进一步的，所述催化反应的温度为25～40℃，优选为28～35℃；
所述催化反应的时间为1～6h，优选为3～6h；
所述催化反应的pH为6～9，优选pH为6～7；
优选地，所述外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯的质量浓度为50g/L～140g/L，优选为100g/L～140g/L；
优选地，所述羧酸酯酶突变体的用量为1g/L～20g/L，优选为5g/L～10g/L；
优选地，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCI或NaOH-甘氨酸溶液；
优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；
优选地，所述磷酸盐缓冲液中磷酸盐的摩尔浓度为30mM～100mM；
优选地，所述磷酸盐包括磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。
本发明提供的羧酸酯酶突变体，在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列上，选择I180、P206和S282位点作为进行改造的位点，得到羧酸酯酶突变体，显著提高了其选择性拆分3-环己烯-1-羧酸甲酯制备(S)-3-环己烯-1-甲酸的活性，光学纯度可达99.2％以上。得到的羧酸酯酶突变体可在细胞上清中可溶性表达，可通过微生物发酵进行大规模生产，反应条件温和，操作过程简便，更适用于工业生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例4提供的羧酸酯酶突变体的粗酶和纯酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。
本发明一方面提供了一种羧酸酯酶突变体，所述羧酸酯酶突变体包括在SEQ IDNO.1所示氨基酸序列上发生如下突变：第180位异亮氨酸替换为亮氨酸、第206位脯氨酸替换为丙氨酸和第282位丝氨酸替换为缬氨酸。
在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列上，选择I180、P206和S282突变位点作为进行改造的位点，得到羧酸酯酶突变体，显著提高了其选择性拆分3-环己烯-1-羧酸甲酯制备(S)-3-环己烯-1-甲酸的活性，光学纯度可达99.2％以上。得到的羧酸酯酶突变体可在细胞上清中可溶性表达，可通过微生物发酵进行大规模生产，反应条件温和，操作过程简便，更适用于工业生产。
在一些具体的实施例中，所述羧酸酯酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明另一方面提供了一种编码是述的羧酸酯酶突变体的多核苷酸；
优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
其中，“多核苷酸”指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，多核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。多核苷酸的实例包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸编码上述T7 RNA聚合酶突变体，编码可选地为编码正义链或反义链。多核苷酸可以是天然存在的、合成的、重组的或它们的任意组合。术语“多核苷酸”和“核酸”本文中可互换地使用。
本发明另一方面提供了一种重组载体，所述重组载体携带上述的核苷酸序列；
所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌粒、柯斯质粒或人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。
优选地，所述重组载体为重组质粒；
在本发明中，优选地，所述重组载体为pET28a(+)、pET21a(+)或pET21b(+)；
优选地，所述重组载体含有T7启动子。
T7启动子是一种较弱的启动子，便于筛选活性较高的羧酸酯酶突变体，且不会因为过高的转录水平影响增加胞内酶的活性。
本发明另一方面提供了一种重组细胞，所述重组细胞表达上述的羧酸酯酶突变体，或者携带上述的核苷酸序列，或携带上述的重组载体。
其中，所述细胞可以指单个细胞，也可以指细胞系，或细胞培养物。本文中细胞包括其后代，后代可以由于天然的、偶然的或故意的突变不一定与原代细胞完全相同，在形态学上和/或在基因组DNA上与原代细胞存在差异。所述细胞可以为天然细胞或转化体。
本发明另一方面提供了一种构建上述的重组细胞的方法，包括以下步骤：将上述的重组载体转化至宿主菌中，得到重组细胞；
需要说明的是，本发明中的宿主菌并不限于大肠杆菌，可根据具体情况选择其他合适的宿主菌种类，如枯草芽孢杆菌或者酿酒酵母等。
优选地，所述宿主菌为大肠杆菌，如本领域常见用作基因工程宿主的EcoliW3110、E coli W3110、E coli BL21、E.coli BW25113等模式菌株，只要可以对其进行基因编辑表达上述需要过表达或异源过表的基因即可。
优选地，所述宿主菌为E.coli BL21(DE3)。
本发明另一方面提供了一种羧酸酯酶突变体的制备方法，包括以下步骤：将上述的重组细胞或应用上述的方法构建的重组细胞进行培养，得到含有胞内表达重组载体的菌体；破碎所述菌体得到所述羧酸酯酶突变体；
优选地，还包括对得到的羧酸酯酶突变体进行分离纯化的步骤。
具体的，可利用重力镍柱亲和层析对粗酶液进行纯化。
本发明另一方面提供了如上述的羧酸酯酶突变体或应用上述的制备方法制备的羧酸酯酶突变体在制备(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用。
本发明另一方面提供了一种(S)-3-环己烯-1-甲酸的制备方法，包括以下步骤：将上述的羧酸酯酶突变体、缓冲液和外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯混合均匀，进行催化反应，反应产物经纯化得到(S)-3-环己烯-1-甲酸；
在一些具体的实施例中，所述催化反应的温度为25～40℃，优选为28～35℃；
所述催化反应的时间为1～6h，优选为3～6h；
所述催化反应的pH为6～9，优选pH为6～7；
优选地，所述外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯的质量浓度为50g/L～140g/L，优选为100g/L～140g/L；
优选地，所述羧酸酯酶突变体的用量为1g/L～20g/L，优选为5g/L～10g/L；
优选地，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCI或NaOH-甘氨酸溶液；
优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；
优选地，所述磷酸盐缓冲液中磷酸盐的摩尔浓度为30mM～100mM；
通过优化催化反应的温度、时间及PH，进一步提高羧酸酯酶突变体的催化活性。对底物外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯添加浓度的优化，提高(S)-3-环己烯-1-甲酸的催化反应的效率，避免过多的底物降低催化效率，或过少的底物无法充分发挥羧酸酯酶突变体的催化活性。
其中，所述催化反应的温度可以为但不限于25℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃或40℃，也可以为25～40℃之间任意值。
所述催化反应的时间可以为但不限于1h、2h、3h、4h、5h或6h，也可以为1～6h之间任意值。
所述催化反应的pH可以为但不限于6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或9.0，也可以为6.0～9.0之间任意值。
所述外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯的质量浓度可以为但不限于50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L或140g/L，也可以为50g/L～140g/L之间任意值。
所述羧酸酯酶突变体的用量可以为但不限于1g/L、3g/L、5g/L、7g/L、9g/L、11g/L、13g/L、15g/L、17g/L、19g/L或20g/L，也可以为1g/L～20g/L之间任意值。
所述磷酸盐缓冲液中磷酸盐的摩尔浓度可以为但不限于30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM，也可以为30mM～100mM。
优选地，所述催化反应的温度为28～35℃；所述催化反应的时间为3～6h；所述催化反应的pH为6～7；所述外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯的质量浓度为100g/L～140g/L；所述羧酸酯酶突变体的用量为5g/L～10g/L；
优选地，所述磷酸盐包括磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：重组载体pET28a(+)-CarE的构建
本实施例中表达载体pET28a(+)购自上海Novagen公司，具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的羧酸酯酶突变体由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
pET28a(+)用限制性内切酶BamHI和XhoI(Thermo Fisher Scientific)切开。根据羧酸酯酶突变体基因设计无缝克隆引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的核苷酸序如SEQ ID NO.5所示。PCR扩增反应的反应体系为：2×Phanta Max Buffer25μL，dNTP Mix(10mMeach)1μL，10μM上游引物2μL，10μM下游引物2μL，模板1μL，Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 1μL，水18μL。PCR扩增反应的反应程序为：98℃与变性2分钟；98℃变性20秒，56℃退火20秒，72℃延伸5分钟，30个循环；72℃延伸10分钟。
PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。利用诺维赞公司无缝克隆试剂盒，将PCR纯化产物和切开的pET28a(+)长片段做无缝连接。连接产物转化至大肠埃希氏菌E.coliDH5α感受态细胞，在含有卡那霉素抗性的LB平板上对重组体进行筛选，挑取单克隆做菌落PCR验证。所用鉴定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。阳性克隆送至金唯智生物科技有限公司测序。
实施例2：羧酸酯酶突变体表达细胞的构建和羧酸酯酶突变体的发酵制备
培养实施例1中的重组菌，扩增并提取重组载体，转化至大肠埃希氏菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培养过夜，即羧酸酯酶突变体表达细胞。
将上述获得的羧酸酯酶突变体表达细胞在含有卡那霉素的LB平板上划线培养，挑取单克隆接种至5mL含有卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl 10g/L，pH为7.0)，37℃，200rpm培养过夜。按照1：100的接种量转接入装有200mL种子培养基的2L三角瓶中，37℃，200rpm震荡培养，直至OD600约1～2时停止。
发酵培养包括20g/L的葡萄糖、11.8g/L的蛋白胨、24g/L的酵母浸粉，9.4g/L的K2HPO4和2.2g/L的K2HPO4，pH为7.0，115℃灭菌30min，降温至37℃待用。
流加培养基包括600g/L的葡萄糖，24g/L的酵母浸粉，115℃灭菌30min后冷却至室温待用。
将上步骤中的种子液加入到发酵罐中，加入无菌滤膜过滤后的卡那霉素，37℃培养至OD600约15时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，诱导温度调至30℃，开始发酵。控制D0为25％，通风比为1:1(VVM)，发酵10h溶氧突升，开始补料，发酵12h放罐。发酵液离心收集细胞，并用生理盐水洗涤三次，将细胞重悬于pH7.0的磷酸盐缓冲液利用均质机进行破碎，菌体干重浓度控制在40g/L，均质机破碎压力40Mpa，离心收集上清液，即为羧酸酯酶突变体的粗酶液。接下来，可以利用重力镍柱亲和层析对粗酶液进行纯化，所得即为纯化后的羧酸酯酶突变体的纯酶液。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析，具体结果如图1所示，其中M为marker，1为粗酶，2为纯酶。获得的羧酸酯酶突变体在上清中可溶性表达。此外，用BCA定量测定蛋白浓度。考虑到反应的简便性，后续催化反应用羧酸酯酶突变体的粗酶液进行。
实施例3：羧酸酯酶突变体在选择性拆分3-环己烯-1-羧酸甲酯制备(S)-3-环己烯-1-甲酸的应用
在10L发酵罐中做5L的反应体系，包括25g羧酸酯酶突变体的粗酶液(终浓度5g/L)，外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯700g(终浓度140g/L)，用pH7.0的磷酸盐缓冲液补齐至5L。反应温度保持在30℃，以30％的碳酸氢钠维持体系pH值在6.0。反应6h，取样送手性GC，直至结果显示3-环己烯-1-羧酸甲酯的ees值大于98.5％，反应停止。用甲基叔丁基醚萃取两次，合并有机相，合并的有机相用无水硫酸钠干燥，干燥后的有机相在60℃真空浓缩仪中浓缩至无馏分蒸出，即(S)-3-环己烯-1-羧酸甲酯。
将上步骤中得到的(S)-3-环己烯-1-羧酸甲酯，加入到1L 20％的氢氧化钠溶液中，50℃搅拌，反应6h点板，直至板上显示无原料残留，反应停止。将体系降温至室温，用盐酸调节pH值至2，用500mL甲基叔丁基醚萃取两次，合并有机层，以无水硫酸钠干燥，干燥后的有机层在60℃真空浓缩仪中浓缩至无馏分蒸出，得到(S)-3-环己烯-1-甲酸301.54g。两步收率为43.08％，光学纯度为99.2％。
实施例2和实施例3可知，本发明制备的羧酸酯酶突变体对3-环己烯-1-羧酸甲酯具备高选择性，可通过生物发酵法进行大规模生产，操作简单，对(R)-3-环己烯-1-羧酸甲酯有高的选择性和催化活性，更适于工业生产。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种羧酸酯酶突变体，其特征在于，所述羧酸酯酶突变体包括在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列上发生如下突变：第180位异亮氨酸替换为亮氨酸、第206位脯氨酸替换为丙氨酸和第282位丝氨酸替换为缬氨酸。
2.根据权利要求1所述的羧酸酯酶突变体，其特征在于，所述羧酸酯酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.编码权利要求1或2所述的羧酸酯酶突变体的多核苷酸；
优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体携带权利要求3所述的核苷酸序列；
优选地，所述重组载体为pET28a(+)、pET21a(+)或pET21b(+)；
优选地，所述重组载体含有T7启动子。
5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达权利要求1或2所述的羧酸酯酶突变体，或者携带权利要求3所述的核苷酸序列，或携带权利要求4所述的重组载体。
6.一种构建权利要求5所述的重组细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求4所述的重组载体转化至宿主菌中，得到重组细胞；
优选地，所述宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或者酿酒酵母。
7.一种羧酸酯酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求5所述的重组细胞或应用权利要求6所述的方法构建的重组细胞进行培养，得到含有胞内表达重组载体的菌体；破碎所述菌体得到所述羧酸酯酶突变体；
优选地，还包括对得到的羧酸酯酶突变体进行分离纯化的步骤。
8.如权利要求1或2所述的羧酸酯酶突变体或应用权利要求7所述的制备方法制备的羧酸酯酶突变体在制备(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用。
9.一种(S)-3-环己烯-1-甲酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1或2所述的羧酸酯酶突变体、缓冲液和外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯混合均匀，进行催化反应，反应产物经纯化得到(S)-3-环己烯-1-甲酸。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述催化反应的温度为25～40℃，优选为28～35℃；
所述催化反应的时间为1～6h，优选为3～6h；
所述催化反应的pH为6～9，优选pH为6～7；
优选地，所述外消旋3-环己烯-1-羧酸甲酯的质量浓度为50g/L～140g/L，优选为100g/L～140g/L；
优选地，所述羧酸酯酶突变体的用量为1g/L～20g/L，优选为5g/L～10g/L；
优选地，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCI或NaOH-甘氨酸溶液；
优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；
优选地，所述磷酸盐缓冲液中磷酸盐的摩尔浓度为30mM～100mM；
优选地，所述磷酸盐包括磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。
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