CN117903978A - 一株能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化和抗炎能力的戊糖片球菌、方法和应用 - Google Patents
一株能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化和抗炎能力的戊糖片球菌、方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一株能够用于发酵桔梗的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，所述戊糖片球菌的名称为：ZY23，分类名称为：戊糖片球菌，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2023年11月17日，保藏号：CGMCC NO：29047。本发明戊糖片球菌ZY23菌株分离于植物发酵物，具有很强的生长活性。本发明方法可以显著提高桔梗发酵液中多酚、黄酮、多糖、还原糖等活性成分，提高其抗氧化及抗炎能力。
Description
技术领域
本发明属于微生物、桔梗发酵技术领域，尤其是一株能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化和抗炎能力的戊糖片球菌、方法和应用。
背景技术
植物桔梗(Platycodon grandiflorus(Jacq.)A.DC.)属于桔梗科(Campanulaceae)，广泛生长于亚洲东北部。桔梗(Platycodonis Radix)为植物桔梗的根，是一种药食同源的中药材。桔梗可作为普通蔬菜食用，常用于制作泡菜、腌菜等。由于其富含维生素和皂苷类化合物，因此具有被开发成饮料和食品添加剂的潜力。由于其富含黄酮、多酚、皂苷、多糖类物质，因此具有一定的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、保肝护肾、降血糖、降血脂以及激活免疫功能的作用。除此而外，桔梗中还富含聚乙炔、挥发油、氨基酸以及钾、钠、镁、磷、钙等矿物质。
戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)属于片球菌属，是一种兼性厌氧革兰氏阳性球菌，也是食品中常见有益菌之一，具有促进伤口愈合、抑制细菌生长、促进消化、提高免疫力的作用与功效。因此，其应用十分广泛，常被应用于保健食品饮料、农业和环保领域。通过代谢作用，产生丰富的代谢产物，对人们的生产生活带来巨大的影响和益处。已有研究表明，戊糖片球菌是自然发酵肉制品和发酵蔬菜中的固有乳酸菌种类，可改善食品的营养价值、色泽以及风味等。其产生的单宁酶具有很好的温度稳定性，还可合成谷氨酸脱羧酶将谷氨酸转化为γ-氨基丁酸，该氨基酸是中枢神经系统的主要神经递质，可以有效降低神经元兴奋性，维持细胞的氧化还原稳态。但目前有关戊糖片球菌是否能够提高发酵桔梗的活性成分尚未见报道。
中药作为传统天然药物，因其活性物质丰富、毒副作用低，被广泛用于医学和食品等诸多领域。随着现代中药发酵技术的出现，因其可提高中药利用率和增强药效作用，近年来成为医药和食品领域的研究热点。特别地，采用微生物发酵药食同源中药，有利于中药有效活性成分产出，对治疗疾病、预防疾病都有一定的益处。目前，戊糖片球菌对于中药发酵的研究较少。
因此，寻找一株可提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化和抗炎能力的菌株具有重要的意义。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一株能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化和抗炎能力的戊糖片球菌、方法和应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一株能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化和抗炎能力的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，所述戊糖片球菌的名称为：ZY23，分类名称为：戊糖片球菌，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2023年11月17日，保藏号：CGMCC NO.29047。
进一步地，所述戊糖片球菌是从植物发酵物中筛选获得。
进一步地，所述戊糖片球菌在MRS固体培养基上菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，凸起，不透明的乳白色菌落，在37℃恒温的条件下，在MRS培养基中培养12h达到对数末期。
或者，所述戊糖片球菌的基因序列为MT463851.1。
进一步地，所述戊糖片球菌能够提高发酵桔梗中活性成分含量；
或者，所述戊糖片球菌能够提高发酵桔梗的总抗氧化能力；
或者，所述戊糖片球菌能够提高发酵桔梗的总还原能力；
或者，所述戊糖片球菌能够提高发酵桔梗的DPPH自由基清除率；
或者，所述戊糖片球菌能够提高发酵桔梗的羟自由基清除率；
或者，所述戊糖片球菌能够提高发酵桔梗的抗炎能力。
一种利用如上所述的戊糖片球菌发酵桔梗的方法，包括步骤如下：
将戊糖片球菌ZY23的种子发酵液，按2-5％接种量接种于桔梗提取液，发酵条件为30-42℃，转速为50-150r/min，发酵24-72h。
进一步地，所述桔梗提取液的制备步骤如下：
将桔梗片用粉碎机粉碎后，过40目筛制成粉末，称量桔梗粉末和蒸馏水，桔梗粉末：蒸馏水的质量比为2.5:50，充分混匀后，于121℃，20min灭菌，制成桔梗提取液；
所述戊糖片球菌ZY23的种子发酵液的发酵方法为：
将冻存的戊糖片球菌ZY23菌液解冻后，接种于MRS固体培养基上，于37℃培养箱倒置培养24h，挑取菌株形态最大、表面光滑湿润，边缘整齐的乳白色单菌落接种于MRS液体培养基中进行活化，再以1％的接种量接种于MRS液体培养基中37℃，150r/min培养24h，二次活化后制成种子发酵液。
如上所述的戊糖片球菌在桔梗或发酵中药中的应用。
如上所述的戊糖片球菌在提高桔梗发酵液中多酚、黄酮、多糖、还原糖含量方面中的应用。
如上所述的戊糖片球菌在提高桔梗发酵液中抗氧化活性方面中的应用。
如上所述的戊糖片球菌在提高桔梗发酵液中抗炎活性方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明戊糖片球菌ZY23菌株分离自植物发酵物，具有较强的生长活性。将该菌株按2-5％接种量接种于桔梗提取液，发酵条件为30-42℃摇床培养，转速为50-150r/min，发酵24-72h。本发明所述方法可以显著提高桔梗发酵液中多酚、黄酮、多糖等活性成分，提高其抗氧化和抗炎能力。
2、本发明戊糖片球菌ZY23具有提高发酵桔梗中活性成分含量的能力。
3、本发明戊糖片球菌ZY23具有提高发酵桔梗的抗氧化能力。
4、本发明戊糖片球菌ZY23具有提高发酵桔梗的抗炎能力。
5、本发明戊糖片球菌ZY23有望被应用于发酵桔梗，提高桔梗提取物中活性成分，及其抗氧化和抗炎能力，为戊糖片球菌用于中药发酵提供了实验基础，也为桔梗发酵研究与应用提供了理论支撑，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明中戊糖片球菌ZY23的形态学观察；其中，A为戊糖片球菌ZY23菌落的基本形态，B为戊糖片球菌ZY23的革兰氏染色结果；
图2为本发明中戊糖片球菌ZY23的生长曲线；
图3为本发明中戊糖片球菌ZY23发酵前后桔梗提取液对RAW 264.7细胞增值的影响；
图4为本发明中戊糖片球菌ZY23发酵前后桔梗提取液对LPS诱导的RAW 264.7细胞增殖的影响；
图5为本发明中戊糖片球菌ZY23发酵前后桔梗提取液对LPS诱导RAW 264.7细胞释放的NO、IL-1β含量的影响；其中，A为戊糖片球菌ZY23发酵前后桔梗提取液对LPS诱导RAW264.7细胞释放的NO含量的影响；B为戊糖片球菌ZY23发酵前后桔梗提取液对LPS诱导RAW264.7细胞释放的IL-1β含量的影响。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
一株能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化和抗炎能力的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，所述戊糖片球菌的名称为：ZY23，分类名称为：戊糖片球菌，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2023年11月17日，保藏号：CGMCC NO.29047。
较优地，所述戊糖片球菌是从植物发酵物中筛选获得。
较优地，所述戊糖片球菌在MRS固体培养基上菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，凸起，不透明的乳白色菌落，在37℃恒温的条件下，在MRS培养基中培养12h达到对数生长末期。
或者，所述戊糖片球菌的基因序列为MT463851.1。
较优地，所述戊糖片球菌能够提高发酵桔梗中活性成分含量；
或者，所述戊糖片球菌能够提高发酵桔梗的总抗氧化能力；
或者，所述戊糖片球菌能够提高发酵桔梗的总还原能力；
或者，所述戊糖片球菌能够提高发酵桔梗的DPPH自由基清除率；
或者，所述戊糖片球菌能够提高发酵桔梗的羟自由基清除率；
或者，所述戊糖片球菌能够提高发酵桔梗的抗炎能力。
一种利用如上所述的戊糖片球菌发酵桔梗的方法，包括步骤如下：
将戊糖片球菌ZY23的种子发酵液，按2-5％接种量接种于桔梗提取液，发酵条件为30-42℃，转速为50-150r/min，发酵24-72h。
进一步地，所述桔梗提取液的制备步骤如下：
将桔梗片用粉碎机粉碎后，过40目筛制成粉末，称量桔梗粉末和蒸馏水，桔梗粉末：蒸馏水的质量比为2.5:50，充分混匀后，于121℃，20min灭菌，制成桔梗提取液；
所述戊糖片球菌ZY23的种子发酵液的发酵方法为：
将冻存的戊糖片球菌ZY23菌液解冻后，接种于MRS固体培养基上，于37℃培养箱倒置培养24h，挑取菌株形态最大、表面光滑湿润，边缘整齐的乳白色单菌落接种于MRS液体培养基中进行活化，再以1％的接种量接种于MRS液体培养基中37℃，150r/min培养24h，二次活化后制成种子发酵液。
如上所述的戊糖片球菌在桔梗或发酵中药中的应用。
如上所述的戊糖片球菌在提高桔梗发酵液中多酚、黄酮、多糖、还原糖含量方面中的应用。
如上所述的戊糖片球菌在提高桔梗发酵液中抗氧化活性方面中的应用。
如上所述的戊糖片球菌在提高桔梗发酵液中抗炎活性方面中的应用。
具体地，相关制备及检测实施例如下：
实施例1：菌株的活化及鉴定
将冻存的菌液接种于MRS液体培养基(蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，七水合硫酸镁0.58g，四水合硫酸锰0.25g，蒸馏水1L)，37℃摇床培养24h，然后采用三区划线方法接种于MRS固体培养基(琼脂15～20g)，37℃倒置培养48h，革兰氏染色镜检：菌株ZY23为革兰氏阳性菌株，显微镜下呈球状，在MRS固体培养基上生长，可形成表面乳白色，表面光滑湿润，边缘整齐的菌落，如图1所示。在MRS液体培养基呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
该菌株与NCBI中GenBank的Pediococcus pentosaceus菌种的同源性达99％。结果显示该菌种为戊糖片球菌，命名为戊糖片球菌ZY23。
实施例2：戊糖片球菌ZY23的菌株的形态特征和理化特征
(1)菌株的形态特征：菌株菌体呈球状；革兰氏染色呈阳性，无芽孢。MRS固体培养基上菌落光滑，边缘整齐，凸起，呈球形，乳白色，不透明。
(2)菌株的生理生化特征：发酵多种糖产酸不产气，能发酵蔗糖、葡萄糖，过氧化氢酶阴性。
实施例3：戊糖片球菌ZY23的生长曲线
将实施例1中的戊糖片球菌接种于MRS固体培养基，37℃培养48h。挑取生长状态良好的单菌落接种于MRS液体培养基中进行活化，再以1％的接种量接种于MRS液体培养基中，静置培养24h，每2h取一次菌悬液测定OD(600nm)，并绘制戊糖片球菌ZY23的生长曲线。如图2所示，培养至8-12h时，菌株生长进入稳定期。
实施例4：戊糖片球菌ZY23在37℃，5％接种比例，发酵72h对桔梗提取液中的活性成分含量的影响
将桔梗片用粉碎机粉碎后，过40目筛制成粉末，称取2.5g桔梗粉末于锥形瓶，加入50mL蒸馏水，充分混匀后，于121℃，20min灭菌，制成桔梗提取液。按5％的接种量向桔梗提取液中接入戊糖片球菌ZY23，未发酵组加入等量蒸馏水做对照。发酵72h后将发酵液转入离心管中，8000r/min离心20min，取上清于121℃，灭菌20min。测定发酵液中总多酚、黄酮、多糖、还原糖含量。相较于未发酵组，戊糖片球菌ZY23发酵之后桔梗提取液中的活性成分显著提高，其中戊糖片球菌ZY23发酵组的多酚含量相较于未发酵组，由4.44±0.49mg/mL上升到5.57±0.30mg/mL，提高了25.5％；黄酮含量相较于未发酵组，由8.22±0.64mg/mL上升到9.50±0.28mg/mL，提高了15.6％；多糖含量相较于未发酵组，由15.36±0.12μg/mL上升到16.04±0.34μg/mL，提升了4.4％；还原糖含量相较于未发酵组，由8.45±0.08μg/mL上升到10.72±0.23μg/mL，提升了26.9％。如表1所示。
表1戊糖片球菌ZY23发酵桔梗前后多酚、黄酮、多糖和还原糖的含量变化
实施例5：戊糖片球菌ZY23发酵前后桔梗提取液的抗氧化能力的变化
将桔梗片用粉碎机粉碎后，过40目筛制成粉末，称取2.5g桔梗粉末于锥形瓶，加入50mL蒸馏水，充分混匀后，于121℃，20min灭菌，制成桔梗提取液。按5％的接种量向桔梗提取液中接入戊糖片球菌ZY23，未发酵组加入等量蒸馏水做对照。发酵72h后将发酵液转入离心管中，8000r/min离心20min，取上清于121℃，灭菌20min。相较于未发酵组，戊糖片球菌ZY23发酵组的抗氧化能力显著提高，其中发酵后桔梗提取液的T-AOC由8.36±0.22μmol/mL显著提高至9.58±0.50μmol/mL；还原力由111.13％±4.10％显著提高至119.04％±2.14％；DPPH自由基清除率由84.26％±3.03％显著提高至93.22％±2.67％；羟自由基清除率84.01％±2.33％显著提高至92.84％±2.65％。如表2所示。
表2戊糖片球菌ZY23发酵前后桔梗提取液的抗氧化能力的变化
| T-AOC | 还原力 | DPPH自由基清除率 | 羟自由基清除率 | |
| 未发酵 | 8.36±0.22μmol/mL | 111.13％±4.10％ | 84.26％±3.03％ | 84.01％±2.33％ |
| 戊糖片球菌 | 9.58±0.50μmol/mL | 119.04％±2.14％ | 93.22％±2.67％ | 92.84％±2.65％ |
实施例6：戊糖片球菌ZY23发酵前后桔梗提取液对RAW 264.7细胞增殖的影响
将桔梗片用粉碎机粉碎后，过40目筛制成粉末，称取2.5g桔梗粉末于锥形瓶，加入50mL蒸馏水，充分混匀后，于121℃，20min灭菌，制成桔梗提取液。按5％的接种量向桔梗提取液中接入戊糖片球菌ZY23，未发酵组加入等量蒸馏水做对照。发酵72h后将发酵液转入离心管中，8000r/min离心20min，取上清于121℃，灭菌20min。使用旋转蒸发仪对上清进行浓缩，置于-80℃冷冻过夜，然后置于冻干机进行冻干，得到发酵上清冻干粉。称取1mg的冻干粉溶于1mL的PBS，过0.22μm滤膜以除菌，得到1mg/mL的溶液。用DMEM培养基将其稀释为100μg/mL和200μg/mL的溶液以备用。
小鼠巨噬细胞RAW 264.7用DMEM培养基(含10％胎牛血清和1％的100×青-链霉素双抗溶液)，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养。每24h进行传代，直到第3代开始进行细胞实验。根据实验所需选择96孔板，按2×104个/孔进行细胞铺板，待细胞密度达到60％左右，吸弃培养基，分别加入含有不同浓度的未发酵桔梗提取液和发酵桔梗提取液的培养基，培养箱中孵育24h，避光条件下每孔加入10μLMTT，培养箱中避光孵育4h，吸弃上清，每孔再加入100μLDMSO，置摇床低速振荡10min，于酶标仪检测490nm的OD值并计算细胞增殖率。如图3所示，经不同浓度的未发酵桔梗提取液和发酵桔梗提取液处理后，RAW 264.7的生长活性均没有受到抑制。
实施例7：戊糖片球菌ZY23发酵前后桔梗提取液对LPS诱导的RAW 264.7细胞增殖的影响
将实施例7中的RAW 264.7细胞按2×104个/孔种于96孔板，待细胞密度达到60％左右，吸弃培养基，分别加入含有不同浓度的实施例8中的提取液的培养基，置培养箱孵育2h后加入1μg/mL LPS，放回培养箱孵育24h，避光条件下每孔加入10μLMTT，培养箱中避光孵育4h，吸弃上清，每孔再加入100μLDMSO，置摇床低速振荡10min，于酶标仪检测490nm的OD值并计算细胞增殖率。如图4所示，经不同浓度的未发酵桔梗提取液和发酵桔梗提取液与LPS共同作用后，RAW 264.7的生长活性均没有受到抑制。
实施例8：戊糖片球菌ZY23发酵前后桔梗提取液对LPS诱导的RAW 264.7细胞释放NO、IL-1β的影响
取实施例8中的96孔板中细胞培养基，用于NO和炎症因子的测定。如图5所示，相较于未发酵组，戊糖片球菌ZY23发酵组的抗炎能力显著提高。从图5A可以看出，未发酵组和戊糖片球菌ZY23发酵组均可抑制LPS诱导RAW 264.7细胞释放NO，且戊糖片球菌ZY23发酵组的抑制效果高于未发酵组；而从图5B可以看出，未发酵组和戊糖片球菌ZY23均可抑制LPS诱导RAW 264.7细胞分泌IL-1β。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
Claims (6)
1.一株能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化和抗炎能力的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，其特征在于：所述戊糖片球菌的名称为：ZY23，分类名称为：戊糖片球菌，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2023年11月17日，保藏号：CGMCC NO.29047；
该菌株革兰氏阳性；在MRS平板培养基上生长，可形成表面光滑、乳白色的圆形菌落，边缘整齐，不透明；在MRS液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀，8-12h进入生长平稳期。
2.一种利用如权利要求1所述的戊糖片球菌发酵桔梗的方法，其特征在于：包括步骤如下：
将戊糖片球菌ZY23的种子发酵液，按2-5％接种量接种于桔梗提取液，发酵条件为30-42℃，转速为50-150r/min，发酵24-72h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述桔梗提取液的制备步骤如下：
将桔梗片用粉碎机粉碎后，过40目筛制成粉末，称量桔梗粉末和蒸馏水，桔梗粉末：蒸馏水的质量比为2.5:50，充分混匀后，于121℃，20min灭菌，制成桔梗提取液；
所述戊糖片球菌ZY23的种子发酵液的发酵方法为：
将冻存的戊糖片球菌ZY23菌液解冻后，接种于MRS固体培养基上，于37℃培养箱倒置培养24h，挑取菌株形态最大、表面光滑湿润，边缘整齐的乳白色单菌落接种于MRS液体培养基中进行活化，再以1％的接种量接种于MRS液体培养基中37℃，150r/min培养24h，二次活化后制成种子发酵液。
4.如权利要求1所述的戊糖片球菌在提高桔梗发酵液中多酚、黄酮、多糖、还原糖含量方面中的应用。
5.如权利要求1所述的戊糖片球菌在提高桔梗发酵液中抗氧化活性方面中的应用。
6.如权利要求1所述的戊糖片球菌在提高桔梗发酵液中抗炎活性方面中的应用。
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| CN202410012629.1A Pending CN117903978A (zh) | 2024-01-04 | 2024-01-04 | 一株能够提高发酵桔梗的活性成分及抗氧化和抗炎能力的戊糖片球菌、方法和应用 |
Country Status (1)
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| CN (1) | CN117903978A (zh) |
-
2024
- 2024-01-04 CN CN202410012629.1A patent/CN117903978A/zh active Pending
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