CN117882829A - 一种改善睡眠的复合益生菌发酵豆乳 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改善睡眠的复合益生菌发酵豆乳，制备步骤包括：制备枯草芽孢杆菌种子液和植物乳杆菌种子液；制备初级豆乳；枯草芽孢杆菌初级发酵；植物乳杆菌二级发酵。本发明的优点在于：采用枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌进行有序分级发酵，制备得到的发酵豆乳不但保留了传统豆乳的优点，可以显著延长总的睡眠时长以及深度睡眠时长，对改善睡眠有显著效果。
Description
技术领域
本发明涉及保健饮品技术领域，特别涉及一种改善睡眠的复合益生菌发酵豆乳。
背景技术
失眠是指睡眠时间不足或睡眠质量不佳，轻者表现为入睡困难、深度睡眠时间短或多梦易醒等情况，重者表现为彻夜难以入睡。长期失眠会引起焦虑、烦躁甚至抑郁的心理状态，还会引发心率过高等多种疾病。目前失眠的治疗方式包括药物治疗、心理治疗、物理治疗等。常用的药物治疗有苯二氮卓类药、抗抑郁药等，但是长期服用此类药物会形成依赖，产生一些列副作用，比如影响反应能力和记忆力，引发精神异常等后果，还会破坏肠道有益菌落，导致肠道生态的失调等。因此，研发一种可以改善睡眠，且无副作用的助眠饮品具有广泛的市场应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种安全无副作用的改善睡眠的复合益生菌发酵豆乳。
本发明提供一种改善睡眠的复合益生菌发酵豆乳，制备方法包含如下步骤：
(1)制备枯草芽孢杆菌种子液和植物乳杆菌种子液；
(2)制备初级豆乳：将大豆粉碎，加水配置成未经过发酵的初级豆乳，并灭菌冷却；
(3)初级发酵：根据步骤(1)制备得到的枯草芽孢杆菌种子液的浓度计算使初级豆乳中菌液终浓度为0.1×107cfu/mL～1.0×108cfu/mL所需的枯草芽孢杆菌种子液的体积，取计算的所需体积的枯草芽孢杆菌种子液,装于50mL无菌离心管中，5000rmp～6000rmp低温离心5min后弃上清，然后用0.9％的无菌生理盐水洗菌体两次，最后用生理盐水重悬菌体后全部接种于步骤(2)制备得到的初级豆乳内，混匀后于150rmp，35℃～37℃恒温摇床内发酵18h～24h，制备得到初级发酵豆乳；
(4)二级发酵：根据步骤(1)制备得到的植物乳杆菌种子液的浓度计算使初级发酵豆乳中菌液终浓度为0.1×107cfu/mL～1.0×108cfu/mL所需的植物乳杆菌种子液的体积，取计算的所需体积的植物乳杆菌种子液,分装于50mL无菌离心管中，5000rmp～6000rmp低温离心5min后弃上清，然后用0.9％的无菌生理盐水洗菌体两次，最后用生理盐水重悬菌体后全部接种于步骤(3)制备得到的初级发酵豆乳中，混匀后于37℃恒温培养箱内发酵48h，制备得到发酵豆乳。
进一步的，所述步骤(4)后还设有步骤(5)低温后发酵：将步骤(4)制备得到的发酵豆乳置于2℃-8℃环境下进行后发酵；
进一步的，所述步骤(4)或步骤(5)后还设有调味步骤：向发酵豆乳中加入调味剂。
进一步的，所述调味剂包括低聚半浆糖、低聚果糖、菊粉中的一种或多种。
进一步的，所述步骤(4)、步骤(5)或步骤(6)后还设有制备固体粉末步骤：将发酵豆乳于-80℃冷冻8h-12h后，再将冰冻后的发酵豆乳冻干至粉末，得发酵豆乳冻干粉。
进一步的，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌SP-8-5(Bacillus subtilis SP-8-5)，已于2023年3月06日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2023254。
进一步的，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌YM-4-3(LactobacillusplantarumYM-4-3)，已于2023年03月06日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2023253。
进一步的，所述枯草芽孢杆菌种子液的制备方法为：将保藏的枯草芽孢杆菌SP-8-5(Bacillus subtilisSP-8-5)取出后于冰上解冻后，取50μL接种于5mL无菌NB培养基内，于35℃，150rmp恒温摇床活化传代两次后，取处于对数生长期的菌液接种至500mL NB培养基内，150rmp，35℃恒温摇床扩大培养，得到菌体浓度为1.0×106cfu/mL～1.0×109cfu/mL的种子液。
进一步的，所述植物乳杆菌种子液的制备方法为：将保藏的植物乳杆菌YM-4-3(Lactobacillus plantarum YM-4-3)取出后于冰上解冻后，取20μL接种于5mL无菌MRS培养基内，于37℃恒温培养箱静置活化传代两次后，取处于对数生长期的菌液接种至500mL MRS培养基内，得到菌体浓度为1.0×108cfu/mL～1.0×1010cfu/mL的种子液。
进一步的，所述MRS养基的配方为：10g蛋白陈、8g牛肉粉、4g酵母粉、20g葡萄糖、1mL吐温80、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰，加入1000mL蒸馏水混匀，pH调整为6.2±0.2。
进一步的，所述NB培养基的配方为：10g蛋白陈、3g牛肉粉、5g牛肉粉、1g葡萄糖，加入1000mL蒸馏水混匀，pH调整为7.4±0.1。
进一步的，所述步骤(2)的具体方法为：将大豆粉碎，过40目筛，再过80目筛，然后再加入蒸馏水配制成豆乳，豆乳的浓度为60g/L～100g/L，所述灭菌的具体方法为：100℃～110℃煮沸10min～20min。
本发明还提供一种发酵豆乳冻干粉，制备方法为：将上述制备得到的复合益生菌发酵豆乳于-80℃冷冻8h-12h后，再将冰冻后的发酵豆乳冻干至粉末，得发酵豆乳冻干粉。
本发明有益效果：
本发明利用豆乳为基质，采用枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌进行有序分级发酵，制备得到的发酵豆乳不但保留了传统豆乳的优点，而且经过发酵后的豆乳其代谢物质发生改变，可以显著延长总的睡眠时长以及深度睡眠时长，对改善睡眠有显著效果，营养更加丰富的同时，能大量的保留枯草芽孢杆菌活菌数。相比于传统未经发酵的豆乳，具有改善睡眠、增强免疫力、保质期更长等优点，具有广阔的市场应用前景。
附图说明
图1为实施例1与对比例3的差异代谢物火山图；
图2为差异代谢物中上调和下调最显著的部分代谢物的火柴图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
一种改善睡眠的复合益生菌发酵豆乳，制备方法包含如下步骤：
(1)制备枯草芽孢杆菌SP-8-5(Bacillus subtilis SP-8-5)种子液和植物乳杆菌YM-4-3(Lactobacillus plantarum YM-4-3)种子液；所述枯草芽孢杆菌SP-8-5(Bacillussubtilis SP-8-5)，已于2023年3月06日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2023254，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。所述植物乳杆菌YM-4-3(LactobacillusplantarumYM-4-3)，已于2023年03月06日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2023253,保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
(2)制备初级豆乳：将黄豆粉碎，先用40目的滤网初筛，再用80目的滤网复筛，复筛后的豆粉用蒸馏水配制成浓度为60g/L～100g/L的豆乳，分装放入器皿内后，100℃～110℃煮沸灭菌10min～20min,将灭完菌的豆乳室温冷却至30℃左右备用，制备得到未经过发酵的初级豆乳；
(3)初级发酵：根据步骤(1)制备得到的枯草芽孢杆菌种子液的浓度计算使初级豆乳中菌液终浓度为1.0×108cfu/mL所需的枯草芽孢杆菌种子液的体积，取计算的所需体积的枯草芽孢杆菌种子液,装于50mL无菌离心管中，6000rmp低温离心5min后弃上清，然后用0.9％的无菌生理盐水洗菌体两次，最后用生理盐水重悬菌体后全部接种于步骤(2)制备得到的初级豆乳内，混匀后于150rmp，35℃～37℃恒温摇床内发酵24h，制备得到初级发酵豆乳；
(4)二级发酵：根据步骤(1)制备得到的植物乳杆菌种子液的浓度计算使初级发酵豆乳中菌液终浓度为1.0×108cfu/mL所需的植物乳杆菌种子液的体积，取计算的所需体积的植物乳杆菌种子液,分装于50mL无菌离心管中，6000rmp低温离心5min后弃上清，然后用0.9％的无菌生理盐水洗菌体两次，最后用生理盐水重悬菌体后全部接种于步骤(3)制备得到的初级发酵豆乳中，混匀后于37℃恒温培养箱内发酵48h，制备得到发酵豆乳。
(5)低温后发酵：将步骤(4)制备得到的发酵豆乳置于2℃-8℃环境下进行后发酵；
(6)调味：向发酵豆乳中加入调味剂。调味剂包括低聚半浆糖、低聚果糖、菊粉中的一种或多种。
具体的，所述枯草芽孢杆菌SP-8-5(Bacillus subtilisSP-8-5)种子液的制备方法为：将保藏的枯草芽孢杆菌SP-8-5(Bacillus subtilis SP-8-5)取出后于冰上解冻后，取50μL接种于5mL无菌NB培养基内，于35℃，150rmp恒温摇床活化传代两次后，取处于对数生长期的菌液接种至500mL NB培养基内，150rmp，35℃恒温摇床扩大培养，得到菌体浓度为1.0×106cfu/mL～1.0×109cfu/mL的种子液。
具体的，所述植物乳杆菌YM-4-3(Lactobacillus plantarum YM-4-3)种子液的制备方法为：将保藏的植物乳杆菌YM-4-3(Lactobacillus plantarum YM-4-3)取出后于冰上解冻后，取20μL接种于5mL无菌MRS培养基内，于37℃恒温培养箱静置活化传代两次后，取处于对数生长期的菌液接种至500mL MRS培养基内，得到菌体浓度为1.0×108cfu/mL～1.0×1010cfu/mL的种子液。
具体的，所述MRS养基的配方为：10g蛋白陈、8g牛肉粉、4g酵母粉、20g葡萄糖、1mL吐温80、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰，加入1000mL蒸馏水混匀，pH调整为6.2±0.2。
具体的，所述NB培养基的配方为：10g蛋白陈、3g牛肉粉、5g牛肉粉、1g葡萄糖，加入1000mL蒸馏水混匀，pH调整为7.4±0.1。
实施例2
一种发酵豆乳冻干粉，制备方法为：将实施例1制备得到的复合益生菌发酵豆乳于-80℃冷冻8h-12h后，再将冰冻后的发酵豆乳冻干至粉末，得发酵豆乳冻干粉。
本申请利用传统未经发酵的豆乳为基质，采用枯草芽孢杆菌SP-8-5(Bacillussubtilis SP-8-5)和植物乳杆菌YM-4-3(Lactobacillus plantarum YM-4-3)进行分级发酵。枯草芽孢杆菌SP-8-5(Bacillus subtilis SP-8-5)能在生长繁殖过程中产生多种酶，如蛋白酶、淀粉酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶等，能够分解大豆中的蛋白质和淀粉等大分子物质，还具有抗菌、溶血栓和抗癌等功能。此外，枯草芽孢杆菌SP-8-5(BacillussubtilisSP-8-5)在代谢豆类的过程中产生的多肽、氨基酸和单糖等物质为植物乳杆菌提供必需的营养要素，促进植物乳杆菌大量生长繁殖。植物乳杆菌YM-4-3(Lactobacillusplantarum YM-4-3)则具有高效合成γ-氨基丁酸的功能，使得发酵豆乳中γ-氨基丁酸以及其他有益助眠的产物的产量显著提高。
另外枯草芽孢杆菌SP-8-5(Bacillus subtilisSP-8-5)具有增强细胞免疫和体液免疫，提高免疫力等功能，其生长过程中还会产生枯草菌素和短杆菌肽等活性物质，对条件致病菌有明显的抑制作用，延长产品的货架期，提高安全性。
此外，在低温后发酵阶段，植物乳杆菌YM-4-3(Lactobacillus plantarum YM-4-3)能够产生酸、醇、醛和酮等多种风味物质，改善由纯种枯草芽孢杆菌发酵造成“风味较单一，不适合大多数中国居民口味”的豆制品特有风味。且经过低温后发酵阶段，豆豉的风味得到显著改善。
因此，采用本发明中有序分级发酵方法发酵出来的豆乳，不但保留了传统豆乳的优点，而且经过发酵后的豆乳其代谢物质发生改变，营养更加丰富的同时，能大量的保留枯草芽孢杆菌活菌数。相比于传统未经发酵的豆乳，具有改善睡眠、增强免疫力、保质期更长等优点。
为了探究枯草芽孢杆菌SP-8-5(Bacillus subtilis SP-8-5)和植物乳杆菌YM-4-3(Lactobacillus plantarum YM-4-3)在本申请中对于改善睡眠的作用，设置了单菌株发酵的对比例，并针对单菌株发酵和本申请中两株菌有序分级发酵进行了γ氨基丁酸的含量检测。具体试验方法如下：
对比例1
一种发酵豆乳，其制备方法与实施例1相比，减少了步骤(1)中的制备植物乳杆菌种子液以及步骤(3)初级发酵。其余步骤均与实施例1相同。
对比例2
一种发酵豆乳，其制备方法与实施例1相比，减少了步骤(1)中的制备枯草芽孢杆菌种子液以及步骤(4)二次发酵。其余步骤均与实施例1相同。
试验一：γ氨基丁酸的含量检测
分别取实施例1、对比例1和对比例2的样品进行γ氨基丁酸的含量检测，具体检测方法(HPLC检测方法)如下：。
1.PH＝7.2磷酸盐缓冲溶液的配制
A液：称取15.6gNaH2PO4放入500mL容量瓶，加入蒸馏水，定容至刻度线处。B液：称取72.0gNa2HPO4放入1000mL容量瓶中，加入蒸馏水，定容至刻度线处。混合：量取A液280mL和B液720mL混合均匀，取100mL备用。
2.0.5mol/L NaHCO3(PH＝9.0)的配制
称取0.6gNa2CO3和3.7gNaHCO3放入100mL容量瓶，再加入蒸馏水，定容到刻度线处。
3.衍生剂的配制
称取0.5gFDNB乙腈溶液放入50mL容量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度线处。
4.衍生方法
准确称量1mL样品液：然后转移到50mL离心管。依次加入0.5mol/L 1mL(PH＝9.0)NaHCO3溶液和1％FDNB乙腈溶液1mL，充分混合并60℃水溶(避光)1小时，水浴后取出冷却、加入7mLPH＝9.0的磷酸盐缓冲液，过滤后4℃保存备用。
5.色谱条件
色谱柱：Agilent 5TC-C18(2)(250x4.6mm)柱
流动相A相：甲醇
流动相B相：0.5％甲酸水溶液
流速为0.7mL/min.柱温为30℃，进样量为10mL，检测波长为355nm
A:B:60:40
γ氨基丁酸的含量检测结果显示对比例1的γ氨基丁酸含量为0.2154g/L，对比例2的γ氨基丁酸含量为0.2573g/L，实施例1的γ氨基丁酸含量为2.8536g/L。显然，本申请有序分级发酵的工艺可以显著提高γ氨基丁酸的含量，改善睡眠的效果更加。
为了验证本发明中复合益生菌发酵豆乳相比于传统未发酵豆乳的助眠效果，设置了传统未发酵豆乳为对比例3，并通过非靶向代谢组学针对实施例1和对比例3分别进行了代谢物分析，通过代谢物的对比，分析实施例1与对比例3之间的差异代谢物。
对比例3
一种未经发酵的初级豆乳，其制备方法与实施例1中的步骤(2)相同。
试验二：差异代谢物分析
按照VIP>1.0，FC>1.2或FC<0.833且P-value<0.05的标准进行差异代谢物的筛选，在实施例1和对比例3的比较组中有190个正离子模式代谢物差异显著，其中85个代谢物上调，105个代谢物下调；有180个负离子模式代谢物差异显著，其中92个代谢物上调，88个代谢物下调。图1展示了P-value相对log2FC的差异代谢物火山图，直观显示了整体差异代谢产物的分布情况。图2展示了根据差异代谢物的log2FC大小选取上调和下调最显著的20种差异代谢物的火柴图。
上述差异代谢物结果显示，具有较好的抑菌活性和抗肿瘤能力的代谢物显著上调，包括3-苯浆酸(3-Phenyllactic acid)、霉酚酸(Mycophenolic acid)、白皮衫醇(Piceatannol)、柚皮素(Naringenin)等。还检测到了具有助眠作用的化合物，包括γ-氨基丁酸、褪黑素、维生素B12、维生素C等。
可见，与传统的未经发酵的豆乳相比，本发明复合益生菌发酵豆乳中各有益化合物的量均有所增加，其中维生素B12增加了16倍，γ-氨基丁酸增加了1.5-4倍、维生素C、褪黑素、5-羟色氨酸、色氨酸等有助于改善睡眠的物质的量均有所增加。
实验三：失眠人群试喝
为了验证本发明中复合益生菌发酵豆乳的助眠性能，针对30位人群进行了志愿者服用试验，统计其服用本申请实施例2中的发酵豆乳冻干粉前后的总睡眠时长和深度睡眠时长，具体方法为：
30位受试者每人分发7袋(2g/袋)实施例2制备得到的发酵豆乳冻干粉，于每晚睡前0.5h-1h服用1袋，用温水或温热牛奶冲服或干吃均可，连续服用一周(7天)。7天后再对30位受试者进行调查问卷，将服用前后进行总睡眠时长和深度睡眠时长进行统计。
服用前后总睡眠时长的数据如下表所示：
| 大于8h | 7-8h | 6-7h | 5-6h | 小于5h | |
| 服用前 | 5 | 5 | 10 | 7 | 3 |
| 服用后 | 6 | 6 | 14 | 3 | 1 |
服用前后深度睡眠时长的数据如下表所示：
| 大于8h | 7-8h | 6-7h | 5-6h | 小于5h | |
| 服用前 | 5 | 6 | 11 | 5 | 3 |
| 服用后 | 6 | 7 | 14 | 2 | 1 |
可以看出，服用本发明中的发酵豆乳冻干粉后，睡眠时长大于6小时的受试者占比增加，睡眠时长小于6小时的受试者则由原来的10人降低到4人，减少了60％。同时，本发明对延长深度睡眠时间也有显著效果，深度睡眠时长小于2小时的受试者由原来的8人降低到3人，减少了62.5％。
综上可以看出本发明中的复合益生菌发酵豆乳以及发酵豆乳冻干粉可以明显延长总睡眠时间和深度睡眠时间，改善睡眠质量，具有广阔的市场应用前景。
以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种改善睡眠的复合益生菌发酵豆乳，其特征在于：制备方法包含如下步骤：
制备枯草芽孢杆菌种子液和植物乳杆菌种子液；
制备初级豆乳；
初级发酵：将一定量的枯草芽孢杆菌种子液离心后弃上清，用无菌生理盐水洗菌体，最后用生理盐水重悬菌体后接种于步骤（2）制备得到的初级豆乳内，混匀后于恒温摇床内发酵，制备得到初级发酵豆乳；
二级发酵：将一定量的植物乳杆菌种子液离心后弃上清，用无菌生理盐水洗菌体，最后用生理盐水重悬菌体后接种于步骤（3）制备得到的初级发酵豆乳中，混匀后发酵，制备得到发酵豆乳。
2.根据权利要求1所述的一种改善睡眠的复合益生菌发酵豆乳，其特征在于：所述步骤（4）后还设有步骤（5）低温后发酵：将步骤（4）制备得到的发酵豆乳置于2℃-8℃环境下进行后发酵。
3.根据权利要求2所述的一种改善睡眠的复合益生菌发酵豆乳，其特征在于：所述步骤（4）或步骤（5）后还设有调味步骤：向发酵豆乳中加入调味剂。
4.根据权利要求3所述的一种改善睡眠的复合益生菌发酵豆乳，其特征在于：所述调味剂包括低聚半浆糖、低聚果糖、菊粉中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种改善睡眠的复合益生菌发酵豆乳，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌SP-8-5（Bacillus subtilis SP-8-5），已于2023年3月06日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2023254。
6.根据权利要求5所述的一种改善睡眠的复合益生菌发酵豆乳，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌种子液的制备方法为：将保藏的枯草芽孢杆菌SP-8-5（Bacillus subtilis SP-8-5）取出后于冰上解冻后，接种于无菌NB培养基内，于35℃，150rmp恒温摇床活化传代两次后，取处于对数生长期的菌液接种至NB培养基内，150rmp，35℃恒温摇床扩大培养，得到枯草芽孢杆菌种子液。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的一种改善睡眠的复合益生菌发酵豆乳，其特征在于：所述植物乳杆菌为植物乳杆菌YM-4-3（Lactobacillus plantarum YM-4-3），已于2023年03月06日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2023253。
8.根据权利要求7所述的一种改善睡眠的复合益生菌发酵豆乳，其特征在于：所述植物乳杆菌种子液的制备方法为：将保藏的植物乳杆菌YM-4-3（Lactobacillus plantarum YM-4-3）取出后于冰上解冻后，接种于无菌MRS培养基内，于37℃恒温培养箱静置活化传代两次后，取处于对数生长期的菌液接种至MRS培养基内，得到植物乳杆菌种子液。
9.根据权利要求1所述的一种改善睡眠的复合益生菌发酵豆乳，其特征在于：所述步骤（2）制备初级豆乳的具体方法为：将大豆粉碎，用蒸馏水配制成豆乳，煮沸灭菌，冷却，制备得到未经过发酵的初级豆乳。
10.一种由权利要求1-9所述的改善睡眠的复合益生菌发酵豆乳制备得到的发酵豆乳冻干粉。
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