CN117859703A - Anxa11基因的新突变致病位点C104G的敲入小鼠模型及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种Anxa11基因的新突变致病位点C104G的敲入小鼠模型及其构建方法，所述方法包括：获得活性的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；获得有活性的Cas9mRNA，所述Cas9核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；将所述有活性的sgRNA、Cas9mRNA和核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的打靶供体混合后显微注射到小鼠受精卵中，获得F0代小鼠；选择F0代阳性小鼠与野生型小鼠进行交配，从而获得具有稳定基因型的F1代小鼠；后筛选获得Anxa11基因突变敲入模式小鼠。该方法基因编辑效率高。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种Anxa11基因的新突变致病位点C104G的敲入小鼠模型及其构建方法。
背景技术
肌萎缩侧索硬化症(ALS)是种进行性四肢无力萎缩、致死致残的神经系统变性病，随着病情的进展，会出现上下运动神经元损害，最终累及呼吸肌导致呼吸衰竭。目前认为ALS与额颞叶痴呆(FTD)具有共病的特点，部分ALS病人可以同时患有FTD，同时一些基因如C9ORF72基因突变后可同时导致ALS和FTD。
肌萎缩侧索硬化症的致病基因包括常见的SOD1，C9ORF72等，鉴定ALS致病基因和突变有利于帮助明确该病发病机制。ANXA11基因是新近发现的ALS相关致病基因，已经在ALS合并FTD患者中发现存在ANXA11基因突变，这提示ANXA11基因有可能在ALS-FTD发病机制中具有重要意义(Zhang K,Liu Q,Liu K,Shen D,Tai H,Shu S,Ding Q,Fu H,Liu S,Wang Z,Li X,Liu M,Zhang X,Cui L.ANXA11 mutations prevail in Chinese ALSpatients with and without cognitive dementia.Neurol Genet.2018May 22；4(3):e237.doi:10.1212/NXG.0000000000000237.)。突变致病基因为ALS的精准治疗提供新靶点，有必要开发一种针对新突变致病基因的模型，为进一步研究机制以及针对靶点进行筛选提供小鼠模型。
发明内容
本发明目的是提供一种肌萎缩侧索硬化症的Anxa11基因的新突变致病位点c.C104G(后简称C104G)敲入小鼠模型及其构建方法，该方法基因编辑效率高，为进一步研究机制以及针对靶点进行筛选提供小鼠模型。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一种Anxa11基因的新突变致病位点C104G的敲入小鼠模型的构建方法，所述方法包括：
将sgRNA体外转录成mRNA，获得活性的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；
获得有活性的Cas9 mRNA，所述Cas9核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
将所述有活性的sgRNA、Cas9 mRNA和核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的打靶供体混合后显微注射到小鼠受精卵中，获得F0代小鼠；
选择F0代小鼠基因型鉴定结果中的F0代阳性小鼠，使其与野生型小鼠进行交配，从而获得具有稳定基因型的F1代小鼠；后筛选出发生正确重组的基因打靶小鼠，即获得Anxa11基因敲入模式小鼠。
在本发明的第二方面，提供了Anxa11基因敲入小鼠的打靶供体，所述打靶供体的核苷酸靶序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的第三方面，提供了一种用于构建Anxa11基因C104G突变小鼠模型的成套核酸分子，所述成套核酸分子包括：
(a)编码sgRNA的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示；
(b)编码Cas9的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示；
(c)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的打靶供体。
在本发明的第四方面，提供了采用所述的方法获得的Anxa11基因的新突变致病位点C104G的敲入小鼠模型。
在本发明的第五方面，提供了所述的Anxa11基因的新突变致病位点C104G的敲入小鼠模型在制备突变Anxa11蛋白或者筛选药物中的应用。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明制备得到的小鼠模型，可将基因敲进效率提高近20倍、且快速、便捷，提高了成功率，节约了成本，缩短了周期，更有利于工业化及大规模的商业应用。经检测Anxa11基因的新突变致病位点C104G的敲入小鼠模型中成功表达。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明提供的Anxa11基因C104G突变敲入小鼠模型的策略图(A)和序列图(B)；B图中红字部分为突变的104位核苷酸所在位置，灰底为制作的108位同义突变所在位置。
图2为F1代鉴定策略示意图；
图3为突变鼠的鼠尾DNA的Sanger验证图和RNA水平定量PCR验证图。其中，图3A为Sanger测序图证实杂合和纯合突变Anxa11小鼠构建成功；与野生型相比，突变鼠在C104位点出现杂合套峰(为C/G套峰)或纯合突变(G)(左箭头)；同时引入避免二次切割的核苷酸T(右箭头)。图3B为mRNA水平定量PCR结果证实Anxa11表达水平正常，制作的同义突变未引入剪接位点，没有改变Anxa11表达；野生鼠(wildtype)，杂合鼠(Anxa11+/R)，纯合鼠(Anxa11R /R)。
图4为突变鼠腰膨大脊髓切片可见前角运动神经元Tdp-43蛋白细胞质异位。Tdp-43蛋白在正常情况下位于核内(见野生型)，出现细胞质转移为肌萎缩侧索硬化症典型病理表现(突变型)。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
术语解释
Wild type allele(WT)：即野生型小鼠；
Targeted allele：即通过受精卵注射得到阳性小鼠，或者F0代阳性小鼠与野生型小鼠交配获得的F1代阳性杂合子小鼠。
为解决上述技术问题，本发明技术方案的总体思路如下：
本申请发明人在ALS队列基因筛查中检测到多个ANXA11基因突变的ALS病人，病人表现为典型的上下运动神经元损害，合并或不合并额颞叶痴呆。其中，位于该基因编码蛋白N端的low-complex结构域(LCD区)的致病突变，导致的临床表型有别于ALS其它致病基因突变表型，如SOD1基因。该区域突变的病人发病晚，进展相对慢，可以作为新的ALS研究模型。
为此，在小鼠Anxa11基因编码的LCD区选择突变靶点，以研究ANXA11基因突变导致ALS机制。申请人选择c.C104位点制作突变小鼠模型，为第104位碱基由C突变为G。选择该位点的理由：1、该位点本身可构成sgRNA的PAM序列，突变后可避免Cas 9蛋白二次识别和切割(图1B)。2、该位点具有高度种属保守性，理论上致病性强。同时，为了进一步规避二次切割的问题，本申请发明人发现在靶标doner序列中第108位核苷酸制作第二个同义突变(C108T)(图1B)，能够使得已完成基因编辑后的序列避免二次切割。
为了进一步研究ANXA11基因突变导致ALS的机制以及针对性筛选和治疗，有必要提供一种小鼠模型，基因突变敲入小鼠模型的设计方案如下：
敲入基因名称(NCBI号)：11744；
敲入基因NCBI网址链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/11744；
方案针对的转录本(Ensembl号)：Anxa11-201(ENSMUST00000022416.14)
KI片段名称及插入位置：本发明在Anxa11-201(ENSMUST00000022416.14)转录本的exon3制作C104G定点突变，第104位碱基由C突变为G，对应第35位氨基酸由P突变为R。
利用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的原理，对靶位点进行基因修饰。具体过程如下：设计并体外转录gRNA，同时构建同源重组(Donor)序列。将Cas9、gRNA、Donor序列同时注射到小鼠的受精卵中。Cas9蛋白在gRNA引导下结合到靶位点进而造成DNA双链断裂，Donor序列通过同源重组修复断裂的双链，从而实现对靶位点的基因修饰。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种Anxa11基因C104G突变敲入小鼠模型的构建方法进行详细说明。
实施例1、Anxa11基因的新突变致病位点C104G的敲入小鼠模型的构建
1、gRNA和DONER序列载体的设计、构建和纯化。
(1)gRNA的设计：使用麻省理工学院的CRISPR Design工具(http://crispr.mit.edu/)，依据Score的高低设计长度为20bp的针对靶标DNA的寡聚核苷酸链序列用于制备sgRNA，根据sgRNA序列设计一个携带靶位点同源臂以及目的敲入序列的Donor序列，并在该靶区域设计引物用于后续阳性克隆筛选以及小鼠的基因鉴定。
(2)构建和纯化：
将合成后的2条单链寡聚核苷酸sgRNA序列退火(95℃5min后自然降至室温)形成双链DNA，在T4 DNA连接酶作用下与pGK1.1线性载体链接，构建sgRNA表达载体，将重组质粒转化到DH5a感受态细胞中，通过pGK1.1线性载体的卡那霉素抗性以及靶标DNA的测序，对阳性克隆质粒进行筛选及鉴定，挑选正确的菌落克隆，扩大培养后提取质粒用于准备体外转录模板；
Donor(打靶供体)序列为直接合成(生工生物工程(上海)股份有限公司，中国)，2OD，PAGE纯化，获得的donor用于注射使用。
表1-构建小鼠模型所用序列
2、样品制备和显微注射：
(1)样品体外转录：Cas9表达质粒(Addgene No.44758)，经AgeⅠ酶切线性化，经酚氯仿抽提纯化后，溶于无核酸酶的水中作为模板用于体外转录；依照T7 Ultra Kit(Ambion，AM1345)试剂盒，体外利用T7 RNA聚合酶合成Cas 9mRNA。
(2)Cas9/sgRNA及donor的显微注射：将转录好的Cas9 mRNA，sgRNA和纯化后的donor片段混合并调整浓度为20ng/μl的Cas9 mRNA，10ng/μl的sgRNA和50ng/μl的donor片段，使用TE2000U显微注射仪将混合物显微注射到C57BL/6小鼠受精卵的原-核和细胞质中，再将受精卵移植到假孕的C57BL/6母鼠子宫中，等待F0代小鼠出生。
3、F0代小鼠的制备；
将Cas9、所述sgRNA的显微注射RNA及打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，注射后出生小鼠记为F0代。
4、F0代小鼠基因型检测：
本发明采用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法构建基因敲入小鼠；在F0代小鼠出生后5-7天时，采用剪脚趾法标记小鼠，并将剪取鼠尾组织经酚氯仿法提取DNA，在靶区域设计的引物进行鉴定，选取PCR阳性的样品进行测序。由于胚胎早期卵裂速度很快，因此得到的F0代小鼠为嵌合体；故以F0代小鼠鼠尾进行鉴定得到的F0基因型仅供参考，不能代表其一定为可遗传的基因突变型，可遗传的基因型需待F1代小鼠鼠尾检测后确定。
经受精卵显微注射，胚胎移植，获得F0小鼠。通过PCR，测序确认，共获得如下同源重组的阳性F0代小鼠。
表2
| ID | 性别 | 颜色 | 表型 | 出生日期 | 代数 |
| 14 | 雌 | B | 阳性 | 2019/4/30 | F0 |
| 17 | 雌 | B | 阳性 | 2019/4/30 | F0 |
| 19 | 雄 | B | 阳性 | 2019/4/30 | F0 |
| 23 | 雄 | B | 阳性 | 2019/4/30 | F0 |
对F0代小鼠鼠尾基因型进行鉴定，通过PCR产物和测序表明上述为阳性F0代小鼠。
5、F1代小鼠的制备；
选择F0代小鼠鼠尾基因型鉴定结果中阳性小鼠与C57BL/6N野生型小鼠交配获得具有稳定基因型的F1代小鼠。
6、F1代小鼠基因型鉴定；
依据F0代小鼠的鉴定方法对F1代小鼠进行鉴定，获得的阳性F1代杂合子小鼠即可稳定遗传。PCR引物如表3所示。测序引物如表4所示。
表3
表4
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) | 引物说明 |
| 00002090-Anxa11-W1-tF1 | ggctttgagaggaacaaagcatg | TM产物测序 |
根据PCR策略示意图，经PCR和测序确认，34#---36#小鼠为阳性F1代小鼠。阳性F1代小鼠信息如下：
表5
| ID | 性别 | 颜色 | 表型 | 出生日期 | 代数 | 编号 |
| 34 | 雌 | B | KI/wt | 2019/4/30 | F1 | C57BL/6J/17# |
| 35 | 雌 | B | KI/wt | 2019/4/30 | F1 | C57BL/6J/17# |
| 36 | 雌 | B | KI/wt | 2019/4/30 | F1 | C57BL/6J/17# |
提取上述PCR鉴定为阳性的F1代小鼠鼠尾DNA进行PCR检测及Sanger测序，检测结果如图3所示，结果表明34#---36#小鼠为正确重组，且没有随机插入，提示携带Anxa11突变型小鼠构建成功；同时，该突变鼠脊髓前角运动神经元内(Islet1阳性标记细胞)可见Tdp-43蛋白转移至胞浆中，而野生型小鼠均分布在核内(图4)，为典型ALS病理表现，提示模型构建成功。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (8)
1.一种Anxa11基因的新突变致病位点C104G的敲入小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括：
将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的sgRNA体外转录成mRNA，获得活性的sgRNA；
获得有活性的Cas9 mRNA；
将所述有活性的sgRNA、Cas9 mRNA和核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的打靶供体混合后显微注射到小鼠受精卵中，获得F0代小鼠；
选择F0代小鼠基因型鉴定结果中的F0代阳性小鼠，使其与野生型小鼠进行交配，从而获得具有稳定基因型的F1代小鼠；后筛选出发生正确重组的基因打靶小鼠，即获得Anxa11基因敲入模式小鼠。
2.根据权利要求1所述的一种Anxa11基因的新突变致病位点C104G的敲入小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述Cas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的一种Anxa11基因的新突变致病位点C104G的敲入小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述Cas9 mRNA，sgRNA和打靶供体的浓度的比值为2：1：(4-6)。
4.一种采用权利要求1-3任一所述的方法获得的Anxa11基因的新突变致病位点C104G的敲入小鼠模型。
5.Anxa11基因敲入小鼠的打靶供体，其特征在于，所述Anxa11基因敲入小鼠的打靶供体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.权利要求5所述的Anxa11基因的新突变致病位点C104G的敲入小鼠模型在制备过表达突变Anxa11蛋白或者筛选药物中的应用。
7.用于构建Anxa11基因的新突变致病位点C104G的sgRNA其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.一种用于构建Anxa11基因的新突变致病位点C104G的敲入小鼠模型的成套核酸分子，其特征在于，所述成套核酸分子包括：
(a)编码sgRNA的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示；
(b)编码Cas9的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示；
(c)权利要求1所述的Anxa11基因C104G突变敲入小鼠的打靶供体。
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