CN117844665A - 一种重组酵母工程菌株及其制备和在降解pet塑料中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组酵母工程菌株及其制备和在降解PET塑料中的应用，所述重组酵母工程菌株能够胞内表达耐热塑料水解酶，且耐热塑料水解酶在≥70℃的环境下具有降解PET塑料的活性；本发明重组酵母工程菌株生产的塑料水解酶在高温环境下更为稳定，故可直接利用该菌在高温环境下对PET塑料进行降解，不仅降解效率高且成本低、操作简单，为PET塑料废弃物的工业化绿色循环利用提供了新的策略。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高效重组表达PET塑料水解酶的酵母工程菌株及其制备方法，并利用该重组酵母的全细胞直接降解PET(Polyehyleneterephthalate)塑料。
背景技术
PET塑料是由对苯二甲酸(TPA)和乙二醇组成的线性聚合物，强度高，易制成纤维和薄膜，主要用于制作一次性水瓶、食品和药品的包装材料等，还广泛用作柔性电路板、电容器膜等电器绝缘材料。PET塑料的优良性能让其被应用在生活中的方方面面，极大地便利了人们的生活，2018年的全球PET塑料生产量为3.59亿吨，2019年增长到3.68亿吨。但是，PET塑料稳定难分解的性质又让它的回收利用变得极端困难，其在自然环境中不能有效降解，而是经过各种因素作用逐渐崩解成细小碎片，经由地下水地表河流等汇聚海洋，对土壤和海洋造成严重污染。目前对于塑料废弃物的处理方法主要是焚烧和填埋，产生的有害物质(如二噁英等)会造成严重的二次环境污染，如何通过绿色环保的方式处理塑料废弃物一直是世界难题。
近年来，PET塑料的生物降解已经取得了令人瞩目的进展。PET作为人工合成的高分子聚合物，在地球上存在的时间不到百年，自然界还没有进化出能够能特异性降解PET塑料的酶。2005年，Muller等人从PET分子里大量存在的酯键入手，首次利用Thermobifidafusca来源的角质酶TfPETase实现了PET塑料的水解，随后通过序列比对陆续发现多种具有PET降解能力的酶，如LCC(leaf-branch compost cutinase)、IsPETase(Ideonella sakaiensis201-F6)、PHL7等，这些酶都是水解酶，能够在常温或者高温条件下将PET降解为单(2-羟乙基)对苯二甲酸酯(MHET)、对苯二甲酸(TPA)和乙二醇。同时，通过机器学习和理性设计的方式对这些PET塑料水解酶进行改造，已产生多种稳定性和活性均显著提高的突变体。其中，LCC是一种从堆肥的宏基因组中找到的PET塑料水解酶，其最适反应温度65℃，具有较好的耐热性。通过理性设计和引入二硫键获得的突变体ICCG、WCCG的PET塑料水解活性大幅提升，热稳定性也显著提高，反应温度达到72℃，适应PET塑料解聚所需要的高温条件。
随着这些酶资源的挖掘和改造，如何高效重组表达PET塑料水解酶及其突变体，并建立相关水解工业成为亟待解决的问题。大肠杆菌重组表达LCC突变体ICCG(即LCCICCG)的产量低，不能满足工业化生产的要求。毕赤酵母是常用的重组表达宿主，具有遗传背景清楚，操作简单，可高密度发酵、发酵成本低等特点。在之前的研究中，发明人团队已经成功实现了IsPETase在毕赤酵母中的分泌表达(CN115927248A)，但是采用毕赤酵母进行重组表达时并没有规律，即并不是所有的PET塑料降解酶都可以通过毕赤酵母实现高表达。目前尚未见利用毕赤酵母胞高效表达LCCICCG的报道，也未见利用重组毕赤酵母全细胞水解PET塑料的技术。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提供一种能够高效表达PET塑料水解酶的重组酵母菌株，为PET塑料水解酶的工业生产和PET塑料的绿色循环利用提供新的途径。
本发明的技术方案具体如下：
本发明第一方面提供了一种能够降解PET塑料的重组酵母工程菌株，具体地，所述重组酵母工程菌株能够胞内表达耐热塑料水解酶，所述耐热塑料水解酶在≥70℃的环境下具有降解PET塑料的活性。
优选地，在上述重组酵母工程菌株中，所述耐热塑料水解酶为LCCICCG。
优选地，在上述重组酵母工程菌株中，所述酵母为毕赤酵母。
发明人发现虽然不能通过毕赤酵母分泌表达的方式实现PET塑料水解酶LCCICCG的高表达，但是可以通过毕赤酵母胞内表达的方式实现该基因的高水平表达。更重要的是，发明人发现在高温(如72℃)条件下处理含有目的蛋白的重组毕赤酵母菌体和重组大肠杆菌菌体时，重组毕赤酵母中的LCCICCG的稳定性显著高于重组大肠杆菌中的LCCICCG，这更有利满足PET塑料解聚所需要的高温条件。
本发明第二方面提供了本发明所述重组酵母工程菌株的制备方法，具体为：构建携带有一个或多个目的基因拷贝的重组质粒，将重组质粒转化至酵母细胞中即得。
优选地，在上述制备方法中，所述重组酵母工程菌株胞内高水平表达PET塑料水解酶LCCICCG,且所述目的基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，在上述制备方法中，所述重组质粒的制备方法为：按照T5核酸外切酶介导的克隆方法，对耐热塑料水解酶编码基因和表达载体pHBM905M分别进行PCR扩增，产物分别回收后混合，加入T5核酸外切酶后冰浴孵育，然后转化大肠杆菌，鉴定获取重组载体，再通过生物砖的方法构建携带有两个及以上目的基因拷贝的重组质粒。
在本发明一实施例中，目的基因的序列如SEQ ID NO.1所示，且目的基因的拷贝数为3，将得到的重组质粒pHBM905M-ICCG-3转化至毕赤酵母GS115菌株中得到了PET塑料水解酶LCCICCG重组表达的工程菌株，通过甲醇诱导，即可实现PET塑料降解酶LCCICCG在毕赤酵母中的高效表达，且SDS-PAGE检测结果显示其为胞内表达。
本发明第三方面提供了本发明所述重组酵母工程菌株在PET塑料降解中的应用，具体为：将重组酵母工程菌株诱导发酵后，取发酵后的菌体直接在≥70℃的环境下进行PET塑料降解，且降解产物包括TPA和MHET。
优选地，在上述应用中，所述诱导采用甲醇进行。
本发明提供的重组酵母工程菌株虽然不能分泌表达PET塑料水解酶，但鉴于其胞内表达的PET塑料水解酶具有优异的热稳定性而酵母内源蛋白在达到一定高温条件后变性失活的特点，本发明可直接利用重组酵母工程菌株全细胞在高温条件(如72℃)下对PET塑料进行降解，而且该方法无需蛋白质纯化、浓缩过程，生产成本低，操作简便。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明首次利用毕赤酵母细胞高效表达了PET塑料水解酶LCCICCG，且其表达方式为胞内表达；实验数据表明，相对于大肠杆菌胞内表达的LCCICCG，本发明利用重组毕赤酵母菌体生产的LCCICCG具有良好的热稳定性，在48h内未见明显的变性失活，而大肠杆菌胞内表达的LCCICCG并不稳定，短时间内会迅速变性。
(2)本发明利用重组毕赤酵母菌体生产的LCCICCG具有良好热稳定性的特点，以及毕赤酵母内源蛋白酶不耐热的特点，开发了一种直接利用发酵后的重组毕赤酵母菌体在高温下水解PET塑料的方法；在该方法中，毕赤酵母在高温环境下细胞受热裂解，释放胞内蛋白(包括LCCICCG)，其内源蛋白酶被加热变性除去，而外源蛋白LCCICCG却能在该高温环境中长时间保持活性，从而实现PET塑料的高效降解，降解产物主要是TPA和MHET。
(3)本发明提供了利用含有重组PET塑料降解酶LCCICCG的毕赤酵母全细胞进行PET塑料制品水解的方法，该方法无需蛋白质纯化、浓缩过程，生产成本低，操作简便；本发明一实施例数据表明，24h内1.25g菌体可以完全降解5.87gPET塑料托盘；可见，本发明为PET塑料的绿色循环利用提供了可能，具有工业应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1构建的重组载体pHBM905M-ICCG的图谱。
图2为本发明实施例1中毕赤酵母工程菌发酵过程中每12h取样菌体的SDS-PAGE检测图。
图3为本发明是实施例2中含有LCCICCG的毕赤酵母和大肠杆菌菌体在72℃处理后上清的SDS-PAGE检测结果对比图。
图4为本发明实施例2中含有LCCICCG的毕赤酵母菌体在72℃处理48h的上清SDS-PAGE检测图。
图5为本发明实施例3中毕赤酵母工程菌全细胞降解处理PET塑料托盘的过程图。
图6为本发明实施例3中毕赤酵母工程菌全细胞降解处理PET塑料托盘过程中的TPA和MHET生成情况。
具体实施方式
下面将结合实施例和附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
以下实施例中未注明具体技术或条件的，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1重组毕赤酵母工程菌的制备
本例通过以下步骤制备能高效胞内表达PET塑料降解酶LCCICCG的毕赤酵母工程菌，具体如下：
(1)PET塑料水解酶LCCICCG重组表达载体的构建。
由金开瑞公司合成LCCICCG编码基因(序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，按照T5核酸外切酶介导的克隆方法，对塑料水解酶LCCICCG编码基因和表达载体pHBM905M分别进行PCR扩增，产物经过琼脂糖凝胶回收后，用Nanodrop 8000分光度计测定核酸浓度，基因片段和载体片段按照3:1的摩尔比混合，加入T5核酸外切酶后于冰水混合物中反应5min，然后转化大肠杆菌DH5α。
分别挑取单菌落至3mL添加有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养数小时，通过全细胞PCR鉴定，阳性克隆送公司测序鉴定，所得重组载体命名为pHBM905M-ICCG，其图谱如图1所示。
随后通过生物砖的方法构建携带有三个目的基因拷贝的重组载体，命名为pHBM905M-ICCG-3。
(2)塑料水解酶LCCICCG的诱导表达。
将重组载体pHBM905M-ICCG-3转化到毕赤酵母GS115菌株中，筛选鉴定后，将重组酵母接种到5L发酵罐中进行高密度发酵，用1％的甲醇连续诱导5天。每隔12h取5mL发酵上清，5000rpm离心收集菌体，将菌体重悬于等体积的100mM KH2PO4-NaOH缓冲液(pH 8.0)中，并在72℃水浴3h，然后离心取上清，加入等体积2×loadingbuffer，在95℃孵育5-10min，然后取10μL上样到15％的聚丙烯酰胺凝胶，通过SDS-PAGE检测结果表明目的蛋白获得成功表达，结果如图2。
实施例2重组毕赤酵母工程菌内LCCICCG的热稳定性检测
参照实施例1，构建重组表达载体pET23a-LCCICCG并将其转化至大肠杆菌BL21C43中，获得含有LCCICCG的大肠杆菌工程菌。
通过摇瓶发酵的形式分别获得含有LCCICCG的毕赤酵母和大肠杆菌菌体，5000rpm离心收集菌体，将菌体重悬于等体积的100mM KH2PO4-NaOH缓冲液(pH 8.0)中。然后在72℃水浴中处理含有LCCICCG的毕赤酵母和大肠杆菌菌体，每3h取样并且离心取上清，加入等体积2×loadingbuffer，在95℃孵育5-10min，然后取10μL进行SDS-PAGE。
结果显示，大肠杆菌中的LCCICCG并不稳定，迅速变性；毕赤酵母内源蛋白被加热变性去除，而LCCICCG却能够耐受高温，仍然保持可溶状态(图3)。其原因可能在于，大肠杆菌的最适生长温度在37℃左右，其内源蛋白酶比较耐热，而毕赤酵母的最适生长温度在28℃左右，其内源的蛋白酶不耐热，所以在加热过程中，毕赤酵母内源蛋白酶对于LCCICCG的影响比较小。
进一步延长处理时间，毕赤酵母表达的LCCICCG显示出良好的热稳定性，在48h内未见明显的变性失活(图4)。
实施例3重组毕赤酵母工程菌全细胞降解PET塑料制品
在1L蓝盖瓶中加入1L 100mM KH2PO4-NaOH缓冲液(pH 8.0)、1.25g重组菌体(实施例1制备)和1个PET塑料托盘(5.87g)，在72℃孵育。
结果如图5所示，24h后塑料制品可以完全降解。
对反应液进行HPLC检测，结果表明PET塑料在重组菌体的作用下转化成为TPA和MHET；反应液中上述单体产物随时间的生成结果如图6所示。
综上所述，本发明构建了PET塑料水解酶LCCICCG的毕赤酵母表达载体和工程菌株，通过甲醇诱导，实现LCCICCG在毕赤酵母中的高效表达；同时，本发明直接利用含有LCCICCG的毕赤酵母悬液实现了高温下PET塑料的高效水解，且成本低、操作简便，为PET塑料物的绿色化处理提供了新的策略。
需要说明的是，以上实施例仅是本发明一部分实施例而不是全部的实施例，仅用以说明本发明的技术方案而非限制；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
Claims (10)
1.一种能够降解PET塑料的重组酵母工程菌株，其特征在于，所述重组酵母工程菌株能够胞内表达耐热塑料水解酶，所述耐热塑料水解酶在≥70℃的环境下具有降解PET塑料的活性。
2.根据权利要求1所述的重组酵母工程菌株，其特征在于，所述耐热塑料水解酶为LCCICCG。
3.根据权利要求1所述的重组酵母工程菌株，其特征在于，所述酵母为毕赤酵母。
4.一种权利要求1～3任一项所述重组毕赤酵母工程菌株的制备方法，其特征在于，具体为：构建携带有一个或多个目的基因拷贝的重组质粒，将重组质粒转化至酵母细胞中即得。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述目的基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述重组质粒的制备方法为：对耐热塑料水解酶编码基因和表达载体pHBM905M分别进行PCR扩增，产物回收后混合，加入T5核酸外切酶后冰浴孵育，然后转化大肠杆菌，鉴定获取重组载体，再通过生物砖的方法构建携带有两个及以上目的基因拷贝的重组质粒。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述目的基因的拷贝数为3，所述酵母细胞为毕赤酵母。
8.如权利要求1-3任一项所述的重组酵母工程菌株在PET塑料降解中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将重组酵母工程菌株诱导发酵后，取发酵后的菌体直接在≥70℃的环境下进行PET塑料降解，且降解产物包括TPA和MHET。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述诱导采用甲醇进行。
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