CN117821495A - 与大豆中疾病抗性相关联的新颖的抗性基因 - Google Patents

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CN117821495A CN202311837800.4A CN202311837800A CN117821495A CN 117821495 A CN117821495 A CN 117821495A CN 202311837800 A CN202311837800 A CN 202311837800A CN 117821495 A CN117821495 A CN 117821495A
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Abstract

本发明涉及使用衍生自短绒野大豆PI441001、PI441008、PI446958、PI583970、或PI483224的标记、基因和染色体区间来鉴定、选择和/或产生疾病抗性大豆植物或种质的方法和组合物。还提供了通过本发明的任何方法鉴定、选择和/或产生的大豆植物或种质。还提供了疾病抗性大豆种子、植物和种质。

Description

与大豆中疾病抗性相关联的新颖的抗性基因
本申请是申请日为2018年11月16日、申请号为201880075291.7、发明名称为“与大豆中疾病抗性相关联的新颖的抗性基因”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于使用新颖的抗性基因来鉴定、选择和产生增强的疾病和/或病原体抗性植物的组合物和方法。
关于序列表的电子提交的声明
提供ASCII文本格式的序列表作为纸质副本的替代，该序列表是根据37C.F.R.§1.821提交的，名称为“81492-WO-L-ORG-NAT-1-序列表_ST25”，大小为17.1MB，于2018年11月15日生成并经由EFS-Web提交。这个序列表特此通过引用以其披露内容并入本说明书中。
背景技术
已知植物病原体对重要作物造成相当大的损害，这导致显著的农业损失，伴随着对依赖植物材料的食物供应和其他工业的广泛的后果。同样，长期以来存在降低农业病原体对作物产生的发病率和/或影响的需要。
若干种病原体与对大豆的损害相关联，该损害在美国和全世界范围内单独地和共同地有可能造成重大的产量损失。示例性病原体包括但不限于真菌(例如，疫霉属和亚洲大豆锈菌病豆薯层锈菌)、线虫(例如，根结线虫属，特别是爪哇根结线虫)和大豆茎溃疡病。鉴于这些病原体存在对全球食物供应的显著威胁以及与处理大豆作物以预防产量损失相关联的时间和花费，需要用于产生病原体抗性大豆栽培品种的新方法。所需要的是可以引入商业大豆植物以控制大豆病原体的新颖的抗性基因(本文中，“R基因”)。
发明内容
本概述列出了本披露主题的若干实施例，并且在许多情况下列出了这些实施例的变化和排列。
提供了用于鉴定、选择和产生具有增强的疾病抗性的大豆属(Glycine)植物(包括野生大豆属(例如短绒野大豆)和大豆品系)的组合物和方法。还提供了疾病抗性大豆植物和种质。在一些实施例中，提供了产生疾病抗性大豆植物的方法。
在本发明的一个方面，提供了DNA构建体，所述DNA构建体包含在植物细胞中起作用的可操作地连接到新颖的抗性基因(“本文中的R-基因”)启动子。在本发明的又一方面，提供了含有所述DNA构建体的转基因植物，其中所述转基因植物对大豆病原体，特别是亚洲大豆锈病具有抗性。
本发明的另一方面是制备可育转基因植物的方法，所述方法包括提供包含R-基因的植物表达盒，并在允许受体细胞摄取所述植物表达盒的条件下使所述受体植物细胞与所述植物表达盒接触；并且选择含有所述植物表达盒的所述受体植物细胞；并且从所选择的受体植物细胞再生植物；并且鉴定对大豆病原体，特别是亚洲大豆锈病有抗性的可育转基因植物。
在本发明的另一方面，提供了可育转基因植物，其包含含有R-基因的植物表达盒，并且其中所述植物对大豆病原体，特别是亚洲大豆锈病具有抗性。
在本发明的另一方面，提供了在田间控制ASR的方法，所述方法包括种植来自包含本发明R-基因的植物的种子的步骤。
因此，本披露主题的一个目的是提供用于将病原体抗性传递到非抗性大豆种质或植物品系的方法。
另外，本披露主题提供了新颖的大豆(Glycine max)品系，其在其基因组中包含衍生自短绒野大豆(Glycine tomentella)并且进一步在所述新颖的大豆品系中赋予亚洲大豆锈菌病(本文中，‘ASR’)抗性的R-基因。还提供了通过本发明的方法鉴定、产生或选择的大豆植物和/或种质，以及衍生自通过这些方法鉴定、产生或选择的大豆植物或种质的任何子代或种子。
作为仍另外的方面，本发明涵盖转基因植物，所述转基因植物包含本发明的植物细胞、植物部分、核苷酸序列、表达盒、载体和/或R-基因。
作为另外的方面，涉及产生本发明的转基因植物的种子和由本发明的转基因植物产生的种子。
还提供了衍生自本发明的转基因植物的收获产物，其中所述收获产物任选地包含本发明的核苷酸序列、表达盒、载体和/或R-基因。进一步提供了衍生自本发明的收获产物的加工产物，其中所述收获产物任选地包含本发明的核苷酸序列、表达盒、载体和/或R-基因。
仍另外，本发明作为另外的方面，提供了产生对大豆病原体具有增加的抗性的转基因植物的方法。在实施例中，所述方法包括向植物中引入本发明的多核苷酸、表达盒或载体，其中所述R-基因在植物中表达，从而产生对大豆病原体具有增加的抗性的转基因植物。任选地，所述引入步骤包括：(i)用多核苷酸、表达盒或载体转化植物细胞并再生转基因植物；或者(ii)使包含多核苷酸、表达盒或载体的第一植物与第二植物杂交。在实施例中，所述方法进一步包括产生来自转基因植物的种子。在实施例中，所述方法进一步包括从转基因植物中获得子代植物，其中所述子代植物包含多核苷酸、表达盒或载体，表达R-基因，并且对大豆病原体具有增加的抗性。
作为又另一个方面，本发明提供了产生对大豆病植物病原体(例如亚洲大豆锈病)具有增加的抗性的转基因植物的方法，所述方法包括：(a)种植包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体的种子；和(b)使来自种子的转基因植物生长，其中所述转基因植物包含多核苷酸、表达盒或载体并产生R-基因，并且对大豆病病原体具有增加的抗性。在实施例中，所述方法进一步包括：(c)收获来自(b)的转基因植物的种子，其中所述收获种子包含多核苷酸、表达盒、载体和/或R-基因。
仍另外，作为另一个方面，本发明提供了产生种子的方法。在实施例中，所述方法包括：(a)提供包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体的转基因植物；和(b)收获来自(a)的转基因植物的种子，其中所述收获种子包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体和/或R-基因。
本发明进一步考虑到产生杂交植物种子的方法。在代表性实施例中，方法包括：(a)使第一近交植物(其是包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体的转基因植物)与不同近交植物(其可以包含或不包含本发明的多核苷酸、表达盒或载体)杂交；和(b)允许形成杂交种子。
本发明还涉及使用本发明的多核苷酸的方法，例如在DNA构建体或表达盒或载体中用于在生物(包括植物)中进行转化和表达。核苷酸或氨基酸序列可以是已经被设计用于在生物(如植物)中表达的天然的或合成的序列。
在实施例中，本发明提供了使用本发明的多核苷酸、表达盒或载体以产生转基因种子的方法，其中所述转基因种子生长成对大豆病原体具有增加的抗性的转基因植物。
上述的以及本发明的其他目的和方面将在以下阐述的附图和说明中进行详细解释。
附图说明
图1.差异宿主组中的真菌b-微管蛋白的qRT-PCR测量。测量结果与表型评分有很好的相关性。
图2.用于处理qRT-PCR原始读数的公式。
图3.不同构建体情况下的标准化真菌生物量，利用已知抗性基因CcRpp1来验证裂叶系统
图4.用于处理qRT-PCR原始读数的替代公式。
图5.使用CcRpp1和包含SEQ ID NO:X的构建体的裂叶测定验证显示了与对照相比疾病显著减少。
图6.SEQ ID NO:6的裂叶测定验证显示与对照相比疾病显著减少。
图7.稳定转化(T1事件)结果显示携带SEQ ID NO:21的三个事件提供约80％的疾病控制。条形图为真菌b-微管蛋白转录物的平均值
图8.稳定转化(T0事件)结果显示携带SEQ ID NO:27的两个事件赋予了对大豆锈病的抗性。
图9.与qRT测定相关的叶症状。
序列表的简要说明
SEQ ID NO:1和2是衍生自短绒野大豆品系登录号PI441001的染色体区间，其分别在本文中称为“支架46840”和“支架49652”。支架49652已经被定位到短绒野大豆染色体5，并且支架46840已经被定位到短绒野大豆染色体5。SEQ ID NO.3是衍生自短绒野大豆品系登录号PI 483224的染色体区间，其在本文中称为“支架002687F”。支架002687F已经被定位到短绒野大豆染色体5。SEQ ID NO.4是衍生自短绒野大豆品系登录号PI 583970的染色体区间，其在本文中称为“支架001084F”。支架001084F已经被定位到短绒野大豆染色体5。SEQID NO:5是衍生自短绒野大豆品系登录号PI583970的染色体区间，其在本文中称为“重叠群000819F”。重叠群000819F已经被定位到短绒野大豆染色体5。PI441001、PI483224和PI583970的遗传群体定位研究指示，短绒野大豆染色体5含有与ASR抗性高度相关联的染色体区间(例如，如对应于SEQ ID NO:1-5)。进一步的数据还表明，短绒野大豆登录号PI446958、PI499939、PI505220、PI499933、PI441008、PI505256、PI446961和PI483224可用作对应于SEQ ID NO 1-5的所述染色体区间或基因的来源。可以将这些染色体区间或其部分引入(即通过使用胚拯救和标记辅助育种(MAB)使基因渗入)到大豆品系中以产生对各种疾病如ASR具有抗性的大豆品系。SEQ ID NO 1-5中与ASR抗性相关联的单核苷酸多态性(SNP)描述于PCT申请号PCT/US2017/036712中，该申请公开为WO 2017/222827，其通过引用以其全文并入本文。
对所述区间的进一步的研究发现了致因基因，并从位于或对应于短绒野大豆染色体5上的上述一个或多个区间中鉴定了相关的天然启动子和终止子序列。
SEQ ID NO:6是来自编码蛋白质的PI441001的大豆锈病抗性基因，所述蛋白质含有Toll/白介素-1受体(TIR)、核苷酸结合位点(NBS)、富亮氨酸重复(LRR)和与Glyma.05G165800(大豆_william82_v2)同线的WKRY结构域(本文中为“TNLW”R-基因基序)；相关的天然启动子包含SEQ ID NO:7，并且终止子序列包含SEQ ID NO:8。SEQ ID NO:6编码SEQ ID NO:47的蛋白质。
SEQ ID NO:9是来自编码蛋白质的PI441001的大豆锈病抗性候选基因，所述蛋白质包含卷曲-卷曲(CC)、核苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复(LRR)结构域。所述基因与Glyma.05G165600(大豆_william82_v2)(本文中为“CNL”R-基因基序)同线；相关的天然启动子包含SEQ ID NO:10，并且终止子序列包含SEQ ID NO:11。SEQ ID NO:9编码SEQ ID NO:48的蛋白质。
SEQ ID NO:12是来自编码蛋白质的PI583970的大豆锈病抗性候选基因，所述蛋白质具有CNL R-基因基序；相关的天然启动子包含SEQ ID NO:13，并且终止子序列包含SEQID NO:14。SEQ ID NO.12编码SEQ ID NO:42的蛋白质。
SEQ ID NO:15是来自编码蛋白质的PI583970的大豆锈病抗性候选基因，所述蛋白质具有CNL R-基因基序；用于验证的相关启动子包含SEQ ID NO:16，并且终止子序列包含SEQ ID NO:17。SEQ ID NO.15编码SEQ ID NO:43的蛋白质。
SEQ ID NO:18是来自编码蛋白质的PI583970的大豆锈病抗性候选基因，所述蛋白质具有CNL R-基因基序；用于验证的相关启动子包含SEQ ID NO:19，并且终止子序列包含SEQ ID NO:20。SEQ ID NO.18编码SEQ ID NO:49的蛋白质。
SEQ ID NO:21是来自编码蛋白质的PI446958的大豆锈病抗性候选基因，所述蛋白质具有CNL R-基因基序；用于验证的相关启动子包含SEQ ID NO:22，并且终止子序列包含SEQ ID NO:23。SEQ ID NO:21编码SEQ ID NO:44的蛋白质。
SEQ ID NO:24是来自编码蛋白质的PI446958的大豆锈病抗性候选基因，所述蛋白质具有CNL R-基因基序；相关的天然启动子包含SEQ ID NO:25，并且终止子序列包含SEQID NO:26。SEQ ID NO:24编码SEQ ID NO:45的蛋白质。
SEQ ID NO:27是来自编码蛋白质的PI446958的大豆锈病抗性候选基因，所述蛋白质具有CNL R-基因基序；用于验证的相关启动子包含SEQ ID NO:28，并且终止子序列包含SEQ ID NO:29。SEQ ID NO:27编码SEQ ID NO:46的蛋白质。
SEQ ID NO:30是来自编码蛋白质的PI583970的大豆锈病抗性候选基因，所述蛋白质具有TNLW R-基因基序；相关的天然启动子包含SEQ ID NO:31，并且终止子序列包含SEQID NO:32。SEQ ID NO:30编码SEQ ID NO:50的蛋白质。
如下表1所示，在其他短绒野大豆品系中发现了另外的区间，所述区间与ASR抗性相关并对应于上述具有/包含SEQ ID NO 1-5且也位于染色体5上的区间。区间作图表明，在T1和T2短绒野大豆品系中均可发现ASR抗性。此外考虑的是，表1中列出的任何源品系都可用于通过胚拯救植物渐渗或经由转基因地表达编码具有CNL或TNLW R基因基序的蛋白质的基因或与SEQ ID NO:6、9、12、15、18、21、24、27或30中任一个具有70％-100％同源性的基因将ASR抗性引入优良大豆植物中。重叠群/支架001082F、000221F、000342F、003716F、001879F、001273F、000866F、000819F和49562分别示于SEQ ID NO:33、34、35、36、37、38、49、40和41中。考虑了具有与SEQ ID NO:6、9、12、15、18、21、24、27和30所示R-基因相关的功能性ASR抗性基因的同源序列可以位于表1的区间和相关序列中。
表1：其他来源和支架的列表被发现包括与亚洲大豆锈病抗性增加相关的区间。
基因组类型 品系 重叠群/支架 开始 结束
T1 PI505220 s49652 47,538 2,464,073
T1 PI499933 s49652 42,441 2,481,008
T1 PI441008 000207F 1,000,000 1,400,000
T1 PI441008 000819F 全重叠群 全重叠群
T1 PI441008 000866F 全重叠群 全重叠群
T1 PI441008 001273F 全重叠群 全重叠群
T1 PI441008 001879F 全重叠群 全重叠群
T1 PI441008 003716F 全重叠群 全重叠群
T2 PI449658 000342F 108,327 重叠群结束
T2 PI449658 000221F 全重叠群 全重叠群
T2 PI449658 001082F 重叠群开始 629,163
T2 PI446961 000342F 全重叠群 全重叠群
T2 PI446961 000221F 全重叠群 全重叠群
T2 PI446961 001082F 重叠群开始 369,453
T2 PI505256 000342F 203,123 重叠群结束
T2 PI505256 000221F 全重叠群 全重叠群
T2 PI505256 001082F 重叠群开始 326,515
具体实施方式
本公开的主题涉及用于将新颖抗性基因(本文中，“R-基因”)引入商业大豆植物以控制大豆病原体的组合物和方法。所述方法涉及用编码本发明R-基因的核苷酸序列转化生物体。本发明的核苷酸序列可用于制备表现出对大豆病原体，特别是亚洲大豆锈病(本文中，“ASR”)增加的抗性的植物。因此，提供了转化的植物、植物细胞、植物组织和种子。组合物包括与大豆病原体抗性植物以及转化的植物、植物组织和种子有关的核酸和蛋白质。公开了R-基因的核苷酸序列和由此编码的蛋白质的氨基酸序列。所述序列可用于构建表达载体以随后转化到目的植物中，作为分离其他R-基因的探针等。
通过将提供抗性的DNA分子插入植物基因组中，有可能产生大豆病原体抗性植物(Cook等人,2012年，关于SCN抗性；Kawashima等人，2016年，关于来自木豆的大豆锈病抗性)。
本说明不旨在是可以实施本发明的所有不同方式，或可以添加到本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以并入其他实施例中，并且关于一个特定实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。因此，本发明考虑了，在本发明的一些实施例中，可以排除或省略在此陈述的任何特征或特征的组合。此外，鉴于本披露内容，在此建议的不同实施例的众多变化以及附加对于本领域技术人员是显而易见的，这不脱离本发明。因此，以下说明旨在阐述本发明的一些特定实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。
下面列出的所有参考文献、以及在即时披露中引用的所有参考文献，包括但不限于所有专利、专利申请及其出版物、科学杂志上的文章以及数据库条目(例如，数据库条目及所有在其中可获得的注释)，将其全部内容通过引用并入本文，其并入程度是它们补充、解释、提供一种针对(或传授)本文采用的方法、技术和/或组合物的背景。
在此提供的核苷酸序列以5'至3'方向从左至右表示，并且使用代表核苷酸碱基的标准代码表示，如37CFR§§1.821-1.825和世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25中所述，例如：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、以及鸟嘌呤(G)。
氨基酸同样是使用WIPO标准ST.25来指示，例如：丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酰胺(Gln；Q)、谷氨酸(Glu；E)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；1)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)、以及缬氨酸(Val；V)。
定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本披露主题所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意义。
尽管认为以下术语可以很好地为本领域的普通技术人员所理解，但是提出以下定义是为了使本披露主题容易理解。
如在本发明的说明书和所附的权利要求中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述(the)”旨在也包括复数形式，除非上下文清楚地另外指示。
如在此使用的，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关的列出项的任何及全部可能组合，连同当以可替代性(“或”)解释时组合的缺少。
如在此使用的，术语“约”当是指一个可测量的值如剂量或时间段等时意在涵盖±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％、或甚至±0.1％的指定量的变化。如在此使用的，短语如“在约X和Y之间”意指“在约X和约Y之间”，并且短语如“从约X至Y”意指“从约X至约Y”。
除非上下文另有说明，如本文所使用的，例如“在约X和Y之间”、“在约X和约Y之间”、“从X至Y”和“从约X至约Y”(以及类似短语)的短语应被解释为包括X和Y。
“编码序列”是转录成RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA或反义RNA)的核酸序列。在实施例中，所述RNA随后被翻译以产生蛋白质。
如在此使用的，“密码子优化的”核苷酸序列意指重组的、转基因的、或合成的多核苷酸的核苷酸序列，其中这些密码子被选择以反映宿主细胞或生物可以具有的特定的密码子偏好性。这典型地是以这样一种方式来完成，所述方式是为了保持由密码子优化的核苷酸序列所编码的多肽的氨基酸序列。在某些实施例中，针对所述构建体有待在其中进行表达的细胞(例如，动物、植物、真菌或细菌细胞)对核苷酸序列进行密码子优化。例如，有待在植物细胞中表达的构建体可以使其全部或部分序列进行密码子优化用于在植物中表达。参见例如，美国专利号6,121,014。在实施例中，本发明的多核苷酸被密码子优化用于在植物细胞(例如，双子叶植物细胞或单子叶植物细胞)或细菌细胞中表达。
术语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”当用于本说明书中时指示所说明的特征、整数、步骤、操作、要素、或组分的存在，但并不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分、和/或其组的存在或添加。
如本文使用的，过渡短语“基本上由……组成”(以及语法变体)意指，权利要求书的范围有待被解读为涵盖权利要求书中所列举的指定材料或步骤以及不实质上改变所要求的发明的一个或多个基本和新颖特征的那些。因此，当用于本发明的权利要求中时，术语“基本上由……组成”并不旨在被解释为等同于“包含(comprising)”。
如在此使用的“表达盒”意指能够在适当的宿主细胞中指导至少一种目的多核苷酸(如编码本发明的蛋白的R-基因多核苷酸)的表达的核酸分子，所述核酸分子包含可操作地连接至目的多核苷酸(其可操作地连接至终止信号)的启动子。“表达盒”还典型地包含另外的多核苷酸以促进目的多核苷酸的正确翻译。所述表达盒还可以包含与目的多核苷酸的表达无关的但是由于用于从表达载体去除表达盒的方便限制位点而存在的其他多核苷酸。在实施例中，表达盒中的至少一种组分相对于至少一种其他组分(例如，与目的多核苷酸可操作相关联的异源启动子)可以是异源的(即外来的)。所述表达盒还可以是天然存在的但已经是以对于异源表达有用的重组形式而获得的表达盒。然而，典型地，所述表达盒相对于宿主是异源的，即所述表达盒(或甚至目的多核苷酸)不是天然存在于宿主细胞中的，并且已经通过转化方法或育种方法引入到所述宿主细胞或其祖先细胞中。该表达盒中的一个或多个目的多核苷酸的表达通常是在启动子的控制下。在多细胞生物(如植物)的情况下，启动子还可能对于特定组织、或器官、或者发育阶段是特异性的或优先的(如在此更详细描述的)。当被转化进植物中时，表达盒或其片段也可被称为“插入的多核苷酸”或者“插入多核苷酸”。
“基因”在此定义为包含一个或多个多核苷酸的遗传单位，该遗传单位占据染色体或质粒上特定位置并且含有用于生物中的特定特征或性状的遗传指令。
如本文使用的，关于植物的术语“引入”意指以任何方式完成，该方式包括但不限于：基因渗入、转基因、规律成簇的间隔短回文重复修饰(CRISPR)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)(Feng等人2013,Joung和Sander 2013)、兆核酸酶或锌指核酸酶(ZFN)。
如本文使用的，术语“野生大豆属”是指多年生大豆属植物，例如灰毛大豆(G.canescens)、银毛大豆(G.argyrea)、澎湖大豆(G.clandestine)、G.latrobeana、白色大豆(G.albicans)、G.aphyonota、沙生大豆(G.arenaria)、弯大豆(G.curvata)、弯裂片大豆(G.cyrtoloba)、扁豆荚大豆(G.dolichocarpa)、镰状大豆(G.falcate)、G.gracei、密毛大豆(G.hirticaulis)、乳绿大豆(G.lactovirens)、阔叶大豆(G.latifolia)、小叶大豆(G.microphylla)、蒙蒂-道格拉斯大豆(G.montis-douglas)、G.peratosa、G.pescadrensis、G.pindanica、G.pullenii、黄紫大豆(G.rubiginosa)、G.stenophita、G.syndetika、或短绒野大豆中任一种。
如本文使用的，术语“等位基因”是指在特定基因座处出现的两个或更多个不同核苷酸或核苷酸序列中的一个。
当标记与性状连锁并且当标记的存在指示了所希望的性状或性状形式是否会和/或会以什么程度发生在包含标记的植物/种质中时，则该标记与该性状“相关联”。类似地，当标记与等位基因连锁并且当标记的存在指示了等位基因是否存在于包含标记的植物/种质中时，则所述标记与所述等位基因“相关”。例如，“与增强的病原体抗性相关联的标记”是指其存在或不存在可用于预测植物是否和/或在何种程度上显示病原体抗性表型的标记(例如，与大豆植物中的ASR抗性“相关联的”如表1-5中描述的任何有利SNP等位基因)。
如本文使用的，术语“回交”和“回交的”是指一种方法，凭借该方法将子代植物反复与其亲本之一回交。在回交方案中，“供体”亲本是指具有待基因渗入的所期望的等位基因或基因座的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或更多次)是指基因或基因座被基因渗入其中的亲本植物。例如，参见Ragot,M.等人，Marker-assisted Backcrossing:A Practical Example,in Techniques et Utilisations desMarqueurs Moleculaires Les Colloques[标记辅助回交：实践范例，分子标记技术和应用专题讨论会]第72卷，第45-56页(1995)；以及Openshaw等人，Marker-assisted Selectionin Backcross Breeding,in Proceedings of the Symposium“Analysis of MolecularMarker Data,”[回交育种中的标记辅助选择，专题讨论会会议记录“分子标记数据分析”]，第41-53页(1994)。初始杂交产生F1代。术语“BC1”是指第二次使用轮回亲本，“BC2”是指第三次使用轮回亲本，以此类推。
厘摩(“cM”)是重组频率的度量单位。一个cM等于有1％的机会，一个遗传基因座处的标记会由于单代中的交换而与第二基因座处的标记分离。
如本文使用的，关于特定基因座和/或等位基因使用的术语“由……定义并包括其的染色体区间”是指由所述基因座/等位基因限定并涵盖所述基因座/等位基因的染色体区间。
如本文所使用的，术语“杂交(cross)”或“经杂交的(crossed)”是指通过授粉融合配子以产生子代(例如，细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一个植物由另一个授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠是来自相同的植物时)两者。术语“使杂交(crossing)”是指通过授粉使配子融合以产生子代的行为。
如本文使用的，术语“栽培品种”和“品种”是指可以通过结构或遗传特点和/或表现与相同物种内的其他品种区别开的一组相似的植物。
如本文使用的，术语“所希望的等位基因”、“有利等位基因”和“目的等位基因”可互换使用以指与所希望的性状(例如ASR抗性)相关联的等位基因。
如本文使用的，术语“增强的病原体抗性”或“增强的疾病抗性”是指与一种或多种对照植物(例如，亲本中的一个或两个、或缺乏与针对对应的病原体/疾病的增强的病原体抗性相关联的标记的植物)相比，尽管感染了疾病(例如亚洲大豆锈病)，植物的耐受和/或繁殖能力的改善、增强或增加。增强的疾病抗性包括减少指示对应的疾病(如亚洲大豆锈病、大豆胞囊线虫、疫霉菌等)感染的症状的表达的任何机制(除了全株植物免疫或抗性)。
“优良品系”或“优良品种”是农艺学上有优势的品系，该品系是从针对有优势的农艺学表现的许多个周期的选育而产生的。众多的优良品系是可获得的并且对于大豆育种领域的普通技术人员是已知的。“优良群体”是一类优良个体或品系，其可以用来代表在给定作物物种(如大豆)的农艺学上有优势的基因型方面的现有技术。类似地，“优良种质”或种质的优良品种是农艺学上有优势的种质，通常源自和/或能够产生具有有优势的农艺学表现的植物，例如现有的或新开发的大豆优良品系。
“优良”植物是来自优良品系的任何植物，因此优良植物是来自优良品种的代表性植物。农民或大豆育种者可商购的优良大豆品种的非限制性实例包括：AG00802、A0868、AG0902、A1923、AG2403、A2824、A3704、A4324、A5404、AG5903、AG6202、AG0934；AG1435；AG2031；AG2035；AG2433；AG2733；AG2933；AG3334；AG3832；AG4135；AG4632；AG4934；AG5831；AG6534；和AG7231(阿斯格罗种子公司(Asgrow Seeds)，德梅因(Des Moines)，爱荷华州，美国)；BPR0144RR、BPR 4077NRR和BPR 4390NRR(生物植物研究所(Bio Plant Research)，营点(Camp Point)，伊利诺伊州，美国)；DKB17-51和DKB37-51(迪卡白遗传公司(DeKalbGenetics)，迪卡尔布(DeKalb)，伊利诺伊州，美国)；DP 4546RR,、和DP 7870RR(三角洲和松树陆地公司(Delta&Pine Land Company)，卢博克市(Lubbock)，德克萨斯州，美国)；JG03R501、JG 32R606C ADD和JG 55R503C(JGL有限公司(JGL Inc.)，格林卡斯尔(Greencastle)，印第安纳州，美国)；NKS13-K2(先正达种子公司NK部门(NK Division ofSyngenta Seeds)，黄金谷(Golden Valley)，明尼苏达洲(Minnesota)，美国)；90M01、91M30、92M33、93M11、94M30、95M30、97B52、P008T22R2；P16T17R2；P22T69R；P25T51R；P34T07R2；P35T58R；P39T67R；P47T36R；P46T21R；和P56T03R2(先锋良种国际有限公司(Pioneer Hi-Bred International)，庄士敦(Johnston)，爱荷华州，美国)；SG4771NRR和SG5161NRR/STS(大豆遗传学有限责任公司(Soygenetics,LLC,)，拉斐特(Lafayette)，印第安纳州，美国)；S00-K5、S11-L2、S28-Y2、S43-B1、S53-A1、S76-L9、S78-G6、S0009-M2；S007-Y4；S04-D3；S14-A6；S20-T6；S21-M7；S26-P3；S28-N6；S30-V6；S35-C3；S36-Y6；S39-C4；S47-K5；S48-D9；S52-Y2；S58-Z4；S67-R6；S73-S8；和S78-G6(先正达种子公司，亨德森市(Henderson)，肯塔基州(Ky.)，美国)；Richer(北极星种业有限责任公司(Northstar SeedLtd.)，亚伯达省(Alberta)，加拿大)；14RD62(斯汀种子公司(Stine Seed Co.)，爱荷华州，美国)；或Armor 4744(阿莫尔种子有限责任公司(Armor Seed,LLC)，阿拉斯加州，美国)。
如本文使用的，术语“农艺学上优良的”意指具有许多可区分性状(例如出苗、活力、营养活力、疾病抗性、结实(seed set)、可立性、产量和脱粒性)的基因型，其允许生产者收获具有商业意义的产物。
如本文使用的，术语“商业上显著的产量”或“农艺学上可接受的产量”是指商业对比(check)品种如AG2703或DKB23-51的至少100％的谷物产量。
“天然”或“野生型”核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列是指天然存在的或内源性的核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列。因此，例如，“野生型mRNA”是天然存在于生物体中的或对生物体来说是内源性的mRNA。
术语“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”、“寡核苷酸”以及“多核苷酸”在此可以互换地使用，除非上下文另外指示，并且是指核苷酸的杂聚物。这些术语包括但不限于DNA和RNA分子，包括cDNA、基因组DNA、合成的(例如，化学合成的)DNA和RNA、质粒DNA、mRNA、反义RNA和RNA/DNA杂交体，其中的任一项都可以是线状的或分支的、单链的或双链的、或其组合。当合成地产生dsRNA时，较少见的碱基，如肌苷，5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤和其他也可以用于反义、dsRNA和核酶配对作用。例如，已经显示含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸以高亲和力结合RNA并且是基因表达的强力反义抑制剂。也可以作出其他修饰，如修饰磷酸二酯主链或RNA的核糖基团中的2'-羟基。在实施例中，“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”、“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指DNA。
如在此使用的“可操作地连接”或“可操作地相关联”意指所指定的元件是彼此功能上相关的，并且还通常是物理相关的。因此，如此处使用的术语“可操作地连接的”或“可操作地关联的”是指在功能上关联的一个单一核酸分子上的核苷酸序列。因此，可操作地连接至第二核苷酸序列的第一核苷酸序列是指当所述第一核苷酸序列被放入与所述第二核苷酸序列的功能关系中时的情况。例如，如果启动子影响核苷酸序列的转录或表达，则所述启动子与所述核苷酸序列可操作地关联。本领域普通技术人员将理解，控制序列(例如启动子)不需要和与其可操作地相关联的核苷酸序列邻接，只要所述控制序列能发挥指导其表达的功能。因此，例如，介入未翻译的、已转录的序列可以存在于启动子与核苷酸序列之间，并且所述启动子仍可以被认为“可操作地连接至”所述核苷酸序列上或与所述核苷酸序列“可操作地相关联”。
如本文使用的，术语“疾病耐受性”和“疾病抗性”是指尽管感染了对应的疾病，植物的耐受和/或繁殖能力。当关于种质使用时，这些术语是指尽管感染了对应的疾病，由该种质产生的植物的耐受和/或繁殖能力。在一些实施例中，感染的疾病抗性大豆植物可以与未感染的大豆植物一样(或几乎同样)产生。通常，如果植物或种质显示“增强的病原体抗性”，则标记为“疾病抗性”。
如本文所用，术语“内源的”是指来源于生物体内或细胞内的材料。“外源的”是指来源于生物体外或细胞外的材料。这典型地适用于用于产生转化的或转基因的宿主细胞和植物的核酸分子。
如本文所使用的，术语“外来的”、“外来的品系”和“外来的种质”是指不是优良的任何植物、品系或种质。通常，外来的植物/种质不是衍生自任何已知的优良植物或种质，而是选择的以将一个或多个所希望的遗传元件引入育种程序(例如，将新颖的等位基因引入育种程序中)。
如本文使用的，“遗传图谱”是对给定物种内的一个或多个染色体上的基因座之间的遗传连锁关系的描述，通常以图表或表格形式描绘。对于每个遗传图谱，基因座之间的距离是通过它们之间的重组频率来测量的。基因座之间的重组可以使用各种标记来检测。遗传图谱是定位群体、所用标记的类型以及不同群体之间每个标记的多态性潜力的产物。一个遗传图谱与另一个遗传图谱的基因座之间的顺序和遗传距离可以不同。
如本文使用的，术语“基因组”应用于植物细胞时不仅包括发现于细胞核内的染色体DNA，而且包括发现于细胞的亚细胞组分内的细胞器DNA。术语“基因”是指包含染色体DNA、质粒DNA、cDNA、人工DNA多核苷酸或转录成RNA分子的其他DNA的多核酸，其中所述RNA可以编码肽、多肽或蛋白质，以及位于所述编码序列侧翼的参与本发明的mRNA或多肽的表达调节的遗传元件。基因的“片段”是全长多核酸分子的一部分，其至少具有能够转录成RNA、翻译成肽或用作DNA检测方法中的探针或引物的最小长度。
如本文使用的，术语“基因型”是指与可观察到的和/或可检测的和/或所表现的性状(表型)形成对照，在一个或多个遗传基因座处的个体(或个体组)的遗传组成。基因型由个体遗传自其亲本的一个或多个已知基因座的一个或多个等位基因定义。术语基因型可以用来指单一基因座处、多个基因座处的个体的遗传组成，或者更普遍地，术语基因型可以用来指其基因组中所有基因的个体遗传构成。可以例如使用标记来间接表征基因型和/或通过核酸测序来直接表征基因型。
如本文所使用的，术语“种质”是指属于或来自个体(例如，植物)、个体群体(例如，植物品系、品种或家族)、或来源于品系、品种、物种或培养物的克隆的遗传物质。种质可以是生物体或细胞的部分，或可以从该生物或细胞中分离。通常，种质提供了具有特定分子构成的遗传物质，该分子构成提供了对于生物体或细胞培养物的一些或所有遗传品质而言的物理基础。如本文使用的，种质可以是指可以从中生长新植物的种子、细胞(包括原生质体和愈伤组织)、或组织，以及可以培养成全株植物的植物部分(例如，茎、芽、根、叶等)。
如本文所用，“异源DNA”序列是指源自外来来源或物种的多核苷酸序列，或者如果来自相同来源，则从其原始形式修饰的多核苷酸序列。
如本文所用，“同源DNA”是指来自与受体细胞相同来源的DNA。
如本文使用的，术语“杂种”是指当至少两个遗传上不相同的亲本杂交时产生的种子和/或植物。
如本文所用，术语“同一性”是指两个多核酸或蛋白质序列之间的相似程度。通过合适的算法执行两个序列的比对。用于进行序列比对的一种被广泛使用和接受的计算机程序是CLUSTALW v1.6(Thompson等人Nucl.Acids Res.[核酸研究],22:4673-4680,1994)，尽管其他的也是常用的。将匹配的碱基或氨基酸的数目除以碱基或氨基酸的总数目并乘以100，以获得百分比一致性。例如，如果两个580个碱基对序列具有145个匹配的碱基，则它们会是25％相同的。如果两个进行比较的序列具有不同的长度，则将匹配的数目除以这两个长度中较短的一个。例如，如果在200个氨基酸的蛋白质与400个氨基酸的蛋白质之间存在100个匹配的氨基酸，则相对于较短的序列而言这两个蛋白质是50％相同的。如果该较短的序列在长度上小于150个碱基或50个氨基酸，则将匹配的数目除以150(对于核酸碱基而言)或50(对于氨基酸而言)并乘以100，获得百分比一致性。除了同一性位置，共有位置也通常计分。共有氨基酸是那些已知具有类似氨基酸性质(例如电荷、大小、极性和芳香性)的氨基酸。
如本文所使用的，术语“近交”是指基本上纯合的植物或种类。术语可以是指在整个基因组中基本上纯合的植物或品种，或者相对于特别感兴趣的基因组部分是基本上纯合的植物或植物品种。
如本文使用的，术语“indel”是指在一对核苷酸序列中的插入或缺失，其中第一序列可被称为具有相对于第二序列的插入，或第二序列可被称为具有相对于第一序列的删除。
如本文所使用的，术语“基因渗入(introgression)”、“使基因渗入(introgressing)”和“经基因渗入的(introgressed)”是指使一个或多个遗传基因座的所期望的等位基因或所期望的等位基因的组合从一个遗传背景到另一个遗传背景的自然和人工传送。例如，可以通过相同物种的两个亲本之间的有性杂交将指定基因座处的所希望的等位基因传送给至少一个子代，其中这些亲本中的至少一个在其基因组内具有该所希望的等位基因。可替代地，例如，等位基因的传送可以通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合的原生质体中，其中至少一个供体原生质体在其基因组中具有所希望的等位基因。所希望的等位基因可以是标记的经选择的等位基因、QTL、转基因等。包括所希望的等位基因的后代可以重复地与具有一个所希望的遗传背景的品系回交，并且对于所希望的等位基因进行选择，其中结果是所希望的等位基因变得在一个所希望的遗传背景中是固定的。例如，与增强的ASR耐受性相关联的标记可以从供体基因渗入到不具有疾病抗性的轮回亲本中。然后可以将得到的子代重复回交并选择，直到该子代在轮回亲本背景中具有一个或多个ASR耐受性等位基因。
如本文所用，“分离的”核酸分子基本上与所述核酸通常与之相关联的其他核酸序列分离开来，例如与所述核酸天然存在的细胞的染色体或染色体外DNA分离开来。当核酸分子包含存在于另一生物体基因组中的转基因或转基因的一部分时，它是分离的核酸分子。所述术语还包括经生物化学纯化以基本上除去污染核酸和其他细胞组分的核酸。术语“转基因”是指转化到细胞或生物体中的对所述细胞或所述生物体而言规范的任何多核酸分子。“转基因”还包括通过定向重组或位点特异性突变插入规范性多核酸分子而修饰的天然植物基因的组成部分。
如果一种多肽是从天然伴随它的细胞成分(核酸、脂质、碳水化合物和其他多肽)中分离出来的，或者是化学合成或重组的，则所述多肽称为“分离的”。当多肽分子在另一个生物体中从转基因表达时，所述多肽分子是分离的多肽分子。当样品中至少60重量％、优选90重量％或更多、更优选95重量％或更多、最优选99重量％以上由单体多肽构成时，所述单体多肽是分离的。蛋白质纯度或均一性例如通过以下来指示：蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后在聚丙烯酰胺凝胶染色后可视单个多肽条带；高压液相色谱法；或其他常规方法。蛋白质可以通过本领域中已知的任何方法纯化，例如如描述于Guide to ProteinPurification[蛋白质纯化指南],编辑Deutscher,Meth.Enzymol.[酶学方法]185,学术出版社(Academic Press),圣地亚哥,1990；和Scopes,Protein Purification:Principlesand Practice,Springer Verlag[蛋白质纯化:原理与实践],纽约,1982。
使用公知的方法，本领域技术人员可以容易地产生提供经修饰的基因产物的基因和蛋白质的核苷酸和氨基酸序列变体。核酸的化学合成可以例如在自动化寡核苷酸合成仪上进行。这样的变体优选不改变核酸的蛋白质编码区的阅读框。本发明还包括缺乏全长蛋白质的至少一个残基，但基本上保持所述蛋白质的活性的蛋白质片段。
“基因座”是基因或标记或等位基因所在的染色体上的位置。在一些实施例中，基因座可以涵盖一个或多个核苷酸。
“非天然存在的大豆品种”是自然界中不存在的任何品种的大豆。可以通过本领域已知的任何方法产生“非天然存在的大豆品种”，该方法包括但不限于转化大豆植物或种质、转染大豆植物或种质并将天然存在的大豆品种与非天然存在的大豆品种杂交。在一些实施例中，“非天然存在的大豆品种”可以包含一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施例中，“非天然存在的大豆品种”可以包含天然存在的核苷酸序列的一个或多个非天然存在的拷贝(即天然存在于大豆中的基因的外来拷贝)。在一些实施例中，“非天然存在的大豆品种”可以包含两种或多种天然存在的核苷酸序列的非天然组合(即，在同一大豆中不天然存在的两种或多种天然存在的基因，例如在大豆品系中未发现的基因)。
如本文使用的，术语“表型”、“表型性状”或“性状”是指生物体的一种或多种性状和/或表现。表型是对于裸眼或通过本领域已知的任何其他评价手段(例如，显微术、生物化学分析、或电子机械测定)可以观察的表现。在一些情况中，表型或性状直接由单一基因或遗传基因座控制，即，“单基因性状”。在其他情况下，表型或性状是多个基因的结果。应当指出，如本文使用的，术语“疾病抗性表型”考虑了可能影响对应的疾病的环境条件，这样使得该效应是真实且是可重复的。
如本文所使用的，术语“植物”可以是指全株植物、其任何部分、或从植物衍生的细胞或组织培养物。因此，术语“植物”可以指以下任一个：全株植物、植物组分或器官(例如，根、茎、叶、芽、花、豆荚等)、植物组织、种子和/或植物细胞。植物细胞是从植物取得的植物细胞，或者是通过培养从取自植物的细胞衍生的植物细胞。因此，术语“大豆植物”可以是指整株大豆植物、大豆植物的一个或多个部分(例如，根、根尖、茎、叶、芽、花、豆荚、种子、子叶等)、大豆植物细胞、大豆植物原生质体和/或大豆植物愈伤组织。
“植物细胞”是植物的结构和生理单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以处于分离的单个细胞或培养细胞的形式，或者是作为较高级的组织单位(如例如，植物组织、植物器官、或全株植物)的一部分。在实施例中，植物细胞是不繁殖的和/或不能再生整个植物。
“植物细胞培养物”意指植物单元(如例如，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。
“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物。
“植物器官”是植物的独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。
如在此使用的，术语“植物部分”包括但不限于，胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎秆、根、根尖、花药、和/或植物细胞(包括在植物和/或植物的部分中完整的植物细胞)、植物原生质体、植物组织、植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团(plantclumps)等。
如本文所使用的“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。这个术语包括但不限于：全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构或功能单元的任何植物细胞群组。这个术语与如以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何具体类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。
“多聚腺苷酸化信号”或“聚A信号”是指位于编码区3'的核酸序列，其导致在从编码区转录的mRNA的3'末端添加腺苷酸核苷酸。
“聚合酶链式反应(PCR)”是指DNA扩增方法，其使用酶促技术来产生一个核酸序列(扩增子)的多个拷贝。DNA分子的拷贝是通过在两个扩增物之间穿梭DNA聚合酶来制备的。这种扩增方法的基础是多个循环的温度变化以变性，然后使扩增物(DNA引物分子)重新退火，接着是延伸，在位于侧翼扩增物之间的区域中合成新的DNA链。核酸扩增可以通过本领域已知的各种核酸扩增方法中的任何一种来完成，包括聚合酶链式反应(PCR)。多种扩增方法在本领域中是公知的，并且特别描述于美国专利号4,683,195和4,683,202以及PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications[PCR方案：方法和应用指南],编辑Innis等人,学术出版社,圣地亚哥,1990年。已经开发了PCR扩增方法，以扩增多达22kb基因组DNA和多达42kb的噬菌体DNA(Cheng等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]91:5695-5699,1994)。这些方法以及DNA扩增领域中已知的其他方法可用于本发明的实践。
如本文使用的，术语“引物”是指当置于诱导合成引物延伸产物的条件(例如在核苷酸和用于聚合的试剂(如DNA聚合酶)的存在下并且在合适的温度和pH)下时能够退火至核酸靶并用作DNA合成的启动点的寡核苷酸。为了在延伸和/或扩增中获得最大效率，在一些实施例中，引物(在一些实施例中是延伸引物，并且在一些实施例中是扩增引物)是单链的。在一些实施例中，引物是寡脱氧核苷酸。引物通常足够长以在用于聚合的试剂存在下引发延伸和/或扩增产物的合成。引物的最小长度可以取决于许多因素，包括但不限于该引物的温度和组成(A/T对比G/C含量)。在扩增引物的情况下，这些扩增引物通常作为由一个正向和一个反向引物组成的一对双向引物提供，或作为DNA扩增领域中(例如在PCR扩增中)常用的一对正向引物提供。如此，应该理解的是，如本文使用的术语“引物”可以指超过一种引物，特别是在关于待扩增的靶区域的一个或多个末端序列的信息中存在一些歧义的情况下。因此，“引物”可以包括含有代表该序列中的可能变异的序列的引物寡核苷酸的集合，或包括允许典型的碱基配对的核苷酸。可以通过任何本领域已知的合适的方法来制备引物。用于制备特异性序列的寡核苷酸的方法是本领域已知的，并且包括例如适当的序列的克隆和限制以及直接化学合成。化学合成方法可以包括例如美国专利号4,458,066中披露的磷酸二酯或三酯法、二乙基氨基磷酸酯法和固相支持体法。若需要，可以通过并入可检测部分，例如光谱部分、荧光部分、光化学部分、生物化学部分、免疫化学部分或化学部分来标记引物。可以对如表1-5中任一个中描述的任何有利SNP产生诊断ASR抗性(即能够基于ASR抗性等位基因的存在来鉴定或选择)的引物。PCR方法在手册中已经很好地描述，并且是本领域技术人员已知的。通过PCR扩增后，可以通过与探针多核苷酸杂交来检测靶多核苷酸，所述探针多核苷酸在严格至中度严格的杂交和洗涤条件下与靶序列形成稳定的杂交体。如果预期探针与靶序列基本上完全互补(即，约99％或更多)，则可以使用严格条件。如果预期有一些错配，例如如果预期变体品种会导致探针不完全互补，则可以降低杂交的严格性。在一些实施例中，选择条件以排除非特异性/偶然结合。影响杂交的条件和针对非特异性结合选择的条件是本领域已知的，并且描述于例如Sambrook和Russell(2001)中。MolecularCloning:ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，第三版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港实验室，纽约，美国。通常，较低的盐浓度和较高温度的杂交和/或洗涤增加了杂交条件的严格性。
如本文所使用的，术语“子代”和“子代植物”是指从一个或多个亲本植物通过无性或有性繁殖产生的植物。子代植物可以通过克隆或单一亲本植物自交，或者通过两种亲本植物杂交来获得。
术语“启动子”或“启动子区”是指起调节元件作用的多核酸分子，通常在编码序列的上游(5')发现，所述多核酸分子通过提供RNA聚合酶的识别位点和/或在正确位点开始转录所必需的其他因子来控制信使RNA(mRNA)的产生来控制编码序列的表达。如本文所设想的，启动子或启动子区域包括通过连接到各种调节序列、随机或受控突变以及增强子序列的添加或重复而衍生的启动子的变化。本文公开的启动子区域及其生物学功能等价物在作为合适的重组DNA构建体的一部分引入宿主时负责驱动在其控制下的编码序列的转录，如其产生mRNA的能力所证明的。
“重组”核酸是由核酸序列的两个在其他情况下分开的片段组合而成的，例如，通过化学合成或通过基因工程技术操纵多核酸的分离片段。术语“重组DNA构建体”是指任何试剂，例如质粒、粘粒、病毒、自主复制序列、噬菌体、或线性或环状单链或双链DNA或RNA核苷酸序列，其衍生于任何来源，能够基因组整合或自主复制，包含一个或多个DNA序列已经以功能性操作方式连接的DNA分子。这样的重组DNA构建体能够将用于所选基因产物的5'调节序列或启动子区和DNA序列以一种方式引入细胞，所述方式使得即所述DNA序列被转录成功能性mRNA，所述功能性mRNA被翻译并因此被表达。重组DNA构建体可以构建成能够表达反义RNA或稳定的双链反义RNA。
在两个核酸或两个氨基酸序列的上下文中，短语“基本上相同的”是指当针对最大对应性进行比较和比对时具有至少约50％核苷酸或氨基酸残基同一性(如使用序列比较算法或通过目测检查所测量的)的两个或更多个序列或子序列。在某些实施例中，基本上相同的序列具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的核苷酸或氨基酸残基同一性。在某些实施例中，相对于蛋白质序列或编码其的核苷酸序列，在序列至少约50个氨基酸残基、100个氨基酸残基、150个氨基酸残基、200个氨基酸残基、250个氨基酸残基、300个氨基酸残基、350个氨基酸残基、400个氨基酸残基、450个氨基酸残基、500个氨基酸残基、525个氨基酸残基、526个氨基酸残基、527个氨基酸残基、528个氨基酸残基、529个氨基酸残基、530个氨基酸残基、531个氨基酸残基、532个氨基酸残基、533个氨基酸残基、534个氨基酸残基、535个氨基酸残基、536个氨基酸残基的区域中存在基本同一性。在另外的实施例中，当这些序列在编码区的整个长度上是相同的时，这些序列是基本上相同的。
“同一性”或“同一性百分比”是指在两种核酸或氨基酸序列之间的同一性的程度。对于序列比较，典型地，一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中(如有必要，指定子序列坐标)，并且指定序列算法程序的参数。然后，该序列比较算法基于所指定的程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
对于序列比较，典型地，一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中(如有必要，指定子序列坐标)，并且指定序列算法程序的参数。然后，该序列比较算法基于所指定的程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
用于比较的序列的最佳比对可以按照以下方式进行，例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443(1970)的同源比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444(1988)的相似性方法的搜索，通过这些算法的计算机化实施(威斯康星州遗传学分析软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，遗传学计算机组(Genetics Computer Group),科学街575号(575ScienceDr.),麦迪逊,威斯康星州)，或通过目测检查(总体上参见，)。
适合于确定序列一致性百分比以及序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，其描述于以下文献中：Altschul等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410(1990)。执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开地获得(在the world wide web atncbi.nlm.nih.gov/)。这种算法涉及首先通过鉴定查询序列中具有长度W的短字码而鉴定得分高的序列对(HSP)，这些得分高的序列对当与数据库序列中具有相同长度的字码(word)进行比对时匹配或满足一些正值阈值的得分T。T被称为邻近字码得分阈(Altschul等人.,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410(1990))。这些初始的邻近字码命中充当种子用于起始搜索以发现含有它们的较长的HSP。然后，将这些字码命中在两个方向上沿着每个序列延伸直到累积的比对得分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(对于一对匹配残基的奖赏得分；总是>0)和N(对于错配残基的罚分；总是<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当累积的比对得分从它的最大达到值降低了数量X；由于累积一个或多个负得分的残基比对使累积得分趋于零或零以下；或者到达任一序列的末端时，停止这些字码命中在每个方向上的延伸。BLAST算法的参数W、T、以及X决定了比对的灵敏度与速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、截止值(cutoff)为100、M＝5、N＝-4、以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10、以及BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915(1989))。
除了计算序列同一性百分之外，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(参见，例如Karlin和Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小概率总和(P(N))，它提供了在两个核苷酸或氨基酸序列之间会偶然发生匹配的概率的指示。例如，若在测试核酸序列与参考核酸序列的比较中最小概率总和小于约0.1、更优选地小于约0.01、并且最优选地小于约0.001，则该测试核酸序列被认为是与该参考序列相似的。
用于进行序列比对的另一种被广泛使用和接受的计算机程序是CLUSTALW v1.6(Thompson,等人Nuc.Acids Res.[核酸研究],22:4673-4680,1994)。将匹配的碱基或氨基酸的数目除以碱基或氨基酸的总数目并乘以100，以获得百分比一致性。例如，如果两个580个碱基对序列具有145个匹配的碱基，则它们会是25％相同的。如果两个进行比较的序列具有不同的长度，则将匹配的数目除以这两个长度中较短的一个。例如，如果在200个氨基酸的蛋白质与400个氨基酸的蛋白质之间存在100个匹配的氨基酸，则相对于较短的序列而言这两个蛋白质是50％相同的。如果该较短的序列在长度上小于150个碱基或50个氨基酸，则将匹配的数目除以150(对于核酸碱基而言)或50(对于氨基酸而言)并乘以100，获得百分比一致性。
当两个核苷酸序列在严格条件下彼此杂交时，这两个核苷酸序列也可以被认为是基本上同一的。在代表性实施例中，被认为基本上相同的两个核苷酸序列在高严格条件下彼此杂交。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指核酸与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于非靶序列)的条件，并且任选地可以基本上排除与非靶序列的结合。严格条件是序列依赖性的并且在不同的情形下将会改变。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格度，可以鉴定可以与参考核苷酸序列高达100％互补的靶序列。可替代地，可以使用中等或甚至低严格条件来允许序列中的一些不匹配，从而检测到较低程度的序列相似性。例如，本领域技术人员将理解，为了起到引物或探针的作用，核酸序列仅需要与靶序列充分互补以基本上与其结合，从而在采用的条件下形成稳定的双链结构。因此，可以在高、中等或甚至低严格条件下使用引物或探针。类似地，低或中等严格条件可以有利于检测同源物、直向同源物和/或旁系同源序列，所述同源物、直向同源物和/或旁系同源序列具有与在高严格条件下鉴定的较低的序列同一性程度。
如在此使用的，术语“互补的(complementary)”或“互补性(complementarity)”(和类似术语)是指多核苷酸在容许性盐条件和温度条件下通过碱基配对发生天然结合。例如，序列“A-G-T”与互补序列“T-C-A”结合。两单链分子之间的互补性可以是部分的，其中这些核苷酸中仅一些结合，或者当这些单链分子之间存在完全互补性时，这种互补性可以是完全的。核酸链之间的互补性程度对于分子之间杂交的效率和强度具有显著影响。如在此使用的，术语“基本上互补的”(和类似术语)意指两个核酸序列是至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多互补的。可替代地，术语“基本上互补的”(和类似术语)可以意指两个核酸序列在高严格条件(如在此描述的)下可以杂交在一起。
如在此使用的，“特异性”或“选择性”杂交(和类似术语)是指分子在严格条件下与特定的核酸靶序列结合、双链化或杂交，这是在所述序列存在于复合混合物(例如，总细胞的DNA或RNA)中时进行的，以致于基本上排除非靶核酸，或甚至与非靶序列没有可检测的结合、双链化或杂交。特异性或选择性杂交序列典型地是至少约40％互补的并且任选地是基本上互补的或甚至完全互补的(即，100％相同的)。
对于DNA-DNA杂交物，Tm可以从Meinkoth和Wahl,Anal.Biochem.[分析生物化学]138:267-84(1984)的等式中进行估计：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是杂交体的碱基对长度。Tm是50％的互补靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度及pH下)。对于每1％错配，Tm降低约1℃；因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件以便杂交至所希望的程度的同一性的序列。例如，如果寻找具有>90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。一般来说，将严格条件选择为比特定序列及其补体在限定的离子强度及pH下的热熔点(Tm)低约5℃。然而，高严格条件可以在热熔点(Tm)或比热熔点(Tm)低1℃、2℃、3℃或4℃下利用杂交和/或洗涤；中度严格条件可以在比热熔点(Tm)低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下利用杂交和/或洗涤；低严格条件可以在比热熔点(Tm)低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下利用杂交和/或洗涤。如果所希望的不匹配程度导致Tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则任选地可以增加SSC浓度，从而可以使用更高的温度。有关核酸杂交的详尽指南见于以下文献：Tijssen，生物化学与分子生物学实验室技术-与核酸探针杂交(Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes)，第I部分，第2章，“杂交原理概述和核酸探针测定策略(Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays)”Elsevier,New York(1993)；现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology)，第2章，Ausubel等人编著，GreenePublishing与Wiley-Interscience，纽约(1995)；以及Green和Sambrook,In:MolecularCloning,A Laboratory Manual[分子克隆，实验手册],第4版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约(2012)。
典型地，严格条件是这些：其中盐浓度小于约1.5M Na离子、典型地在约pH 7.0至pH 8.3下大约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)温度为至少约30℃而对于长探针(例如，大于50个核苷酸)至少约60℃。通过添加不稳定剂如甲酰胺或Denhardt's(在500ml水中的5g聚蔗糖(Ficoll)、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)也可以达到严格条件。示例性的低严格条件包括用30％至35％的甲酰胺、1MNaCl、1％ SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液中在37℃下杂交，并且在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M枸橼酸钠)中在50℃至55℃下洗涤。示例性的中等严格条件包括在40％至45％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS中在37℃下杂交，并且在0.5X至1X SSC中在55℃至60℃下洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS中在37℃下杂交，并且在0.1X SSC在60℃至65℃下洗涤。高严格条件的另外的非限制性实例包括在4X SSC、5XDenhardt's、0.1mg/ml煮沸鲑鱼精子DNA下杂交，并在25mM磷酸Na在65℃下洗涤，并在0.1XSSC、0.1％ SDS在65℃下洗涤。另一个高严格杂交条件的阐述包括在7％ SDS、0.5M NaPO4、1mM EDTA中在50℃下杂交，在2X SSC、0.1％ SDS中在50℃下洗涤，可替代地在1X SSC、0.1％ SDS中在50℃下洗涤，可替代地在0.5X SSC、0.1％ SDS中在50℃下洗涤，或可替代地在0.1X SSC、0.1％ SDS中在50℃下洗涤，或甚至在0.1X SSC、0.1％ SDS中在65℃下洗涤。本领域技术人员将会理解特异性典型地是杂交后的洗涤的作用，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度以及温度。
如果在严格条件下彼此不杂交的核酸所编码的蛋白质是基本上相同的，则它们仍然是基本上相同的(例如，由于遗传密码的简并性)。
两个核酸序列或蛋白质基本上相同的另一个指示是由第一核酸编码的蛋白质与由第二核酸编码的蛋白质进行免疫性交联反应。因此，蛋白质典型地是与第二蛋白质基本上相同的，例如其中这两种蛋白质仅在保守性取代上不同。
术语“载体”是指用于将一种核酸(或多种核酸)转移、递送或引入到细胞中的组合物。载体包含核酸分子，所述核酸分子包含有待被转移、递送或引入的一个或多个核苷酸序列。
R-基因编码序列在植物中的表达
制备DNA构建体，其含有在植物中表达R-基因编码序列所必需的各种遗传元件。“DNA构建体”是指构成重组DNA分子的可操作地彼此连接的异源遗传元件，并且可以包括提供DNA多核苷酸分子在宿主细胞中表达的元件和提供构建体在宿主细胞中的维持的元件。植物表达盒包含遗传元件的可操作连接，所述遗传元件在转入植物细胞时提供所需基因产物的表达。“植物表达盒”是指嵌合DNA片段，所述嵌合DNA片段包含可操作地连接以提供转基因产物在植物中的表达的调节元件。启动子、前导序列、内含子、编码多核酸的转运肽、3'转录终止区都是植物分子生物学领域的技术人员可操作地连接以向本发明的R-基因提供所需水平的表达或功能的遗传元件。DNA构建体可以包含表达本发明的DNA分子或在作物植物基因工程中使用的其他DNA分子的一个或多个植物表达盒。
在营养组织如叶、茎、根和块茎中特异性活性的多种启动子可用于表达本发明的R-基因多核酸分子。
翻译前导序列是指位于基因启动子和编码序列之间的DNA分子。翻译前导序列存在于完全加工的mRNA中的翻译起始序列上游。翻译前导序列可影响初级转录物至mRNA的加工、mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的实例包括玉蜀黍和矮牵牛热休克蛋白前导序列、植物病毒外壳蛋白前导序列，植物二磷酸核酮糖羧化酶(rubisco)基因前导序列等(Turner和Foster,Molecular Biotechnology[分子生物技术]3:225,1995)。
“3'非翻译序列”是指位于结构多核苷酸序列下游的DNA序列，并且包括编码多聚腺苷酸化和能够影响mRNA加工或基因表达的其他调节信号的序列。多聚腺苷酸化信号在植物中的作用是导致多聚腺苷酸核苷酸添加到mRNA前体的3’末端。多聚腺苷酸化序列可源自天然基因、源自各种植物基因、或源自T-DNA。多聚腺苷酸化序列的实例是胭脂碱合酶3'序列(nos 3′；Fraley等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:4803-4807,1983)。不同3'非翻译序列的使用例示于Ingelbrecht等人,Plant Cell[植物细胞]1:671-680,1989。
本文使用的重组DNA技术中的实验室程序是本领域中公知的和通常采用的那些程序。标准技术用于克隆、DNA和RNA分离、扩增和纯化。通常，涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等的酶促反应根据制造商的规范进行。这些技术和各种其他技术通常根据Sambrook等人(1989)执行。
本发明的DNA构建体可通过本领域技术人员公知的各种常规转化技术引入所需植物宿主的基因组中。“转化”是指将外源多核酸分子(例如DNA构建体，重组多核酸分子)引入细胞或原生质体，且所述外源多核酸分子并入宿主细胞基因组或细胞器基因组(例如叶绿体或线粒体)或能够自主复制。“转化的”或“转基因的”是指外来多核酸例如DNA载体或重组多核酸分子进入的细胞、组织、器官或生物体。“转基因的”或“转化的”细胞或生物体还包括所述细胞或生物体的子代和从育种程序产生的子代，所述育种程序采用所述“转基因的”植物作为杂交中的亲本，并且所述从育种程序产生的子代表现出由于外来多核酸分子的存在而导致的改变的表型。
植物细胞或组织的转化方法包括但不限于农杆菌介导的转化方法和生物射弹或粒子枪介导的转化方法。用于农杆菌介导转化的目的的合适植物转化载体包括-衍生自根癌农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒的那些元件，例如右边界(RB)区域和左边界(LB)区域，以及Herrera-Estrella等人,Nature[自然]303:209(1983)；Bevan,Nucleic Acids Res.[核酸研究]12:8711-8721(1984)；Klee等人,Bio-Technology[生物技术]3(7):637-642(1985)公开的其他元件。除了衍生自农杆菌Ti或根诱导(Ri)质粒的植物转化载体外，可使用替代方法将本发明的DNA构建体插入植物细胞。这些方法可以涉及但不限于例如脂质体的使用、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学物质、通过微射弹轰击的游离DNA递送、以及使用病毒或花粉的转化。
可以制备并入本发明的R-基因编码序列的DNA构建体，用于指导直接从宿主植物细胞质粒表达所述序列。适用于此目的的此类构建体的实例和方法是本领域已知的并且通常描述于例如Svab等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]87:8526-8530,(1990)和Svab等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:913-917(1993)和美国专利号5,693,507。
当获得足够数量的含有编码本发明多肽的外源多核酸分子的细胞时，可以培养所述细胞，然后将其再生为整株植物。“再生”是指从植物细胞(例如，植物原生质体或外植体)生长出植物的过程。这种再生技术依赖于组织培养生长培养基中某些植物激素的操纵，典型地依赖于已与所需核苷酸序列一起引入的杀生物剂和/或除草剂标记。再生步骤方法学的选择不是关键，参见例如Ammirato等人,Handbook of Plant Cell Culture—CropSpecies.[植物细胞培养手册－作物物种]麦克米伦出版社公司(Macmillan Publ.Co.)(1984)；Shimamoto等人,Nature[自然]338:274-276(1989)；Fromm,UCLA Symposium onMolecular Strategies for Crop Improvement[作物改良分子策略研讨会],四月16-22,1990.Keystone,Colo.(1990)；Vasil等人,Bio/Technology[生物技术]8:429-434(1990)；Vasil等人,Bio/Technology[生物技术]10:667-674(1992)；Hayashimoto,Plant Physiol.[植物生理学]93:857-863(1990)；和Datta等人,Bio-technology[生物技术]8:736-740(1990)。这样的再生技术一般描述于Klee等人,Ann.Rev.Plant Phys.[植物生理学年度综述]38:467-486(1987)。
含有编码目的多肽的外源多核酸分子的转基因植物的发育或再生是本领域公知的。优选地，再生的植物自花授粉以提供纯合转基因植物，如上所述。另外，从再生的植物获得的花粉与重要农艺品系的种子生长植物杂交。相反，来自这些重要品系植物的花粉被用来为再生的植物授粉。
疾病抗性大豆植物和种质
本发明提供了疾病抗性大豆植物和种质。疾病抗性大豆植物或种质可以通过任何方法产生，借这些方法将R-基因引入大豆植物或种质中，这些方法包括但不限于转化、原生质体转化、或融合，双单倍体技术，胚拯救，基因编辑，和/或通过任何其他核酸转移系统产生。
在一些实施例中，大豆植物或种质包含非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，大豆植物或种质的基因组与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。
疾病抗性大豆植物或种质可以是优良大豆品种和包含用于增强的疾病(例如ASR)耐受性的R-基因的大豆品种之间的杂交的子代，其中所述R-基因选自由以下组成的组：编码具有CNL或TNLW R-基因基序的蛋白质的基因或与SEQ ID NO：6、9、12、15、18、21、24、27或30具有70％-100％同源性的基因。
疾病抗性大豆植物或种质可以是渗入的子代，其中轮回亲本是优良大豆品种，并且供体包含与增强的疾病耐受性和/或抗性相关的R-基因，其中所述供体携带以下：编码具有CNL或TNLW R-基因基序的蛋白质的基因或与SEQ ID NO：6、9、12、15、18、21、24、27或30具有70％-100％同源性的基因。
疾病抗性大豆植物或种质可以是第一优良大豆品种(例如，测试品系)之间的杂交的子代，和第二优良大豆品种(例如，轮回亲本)与包含R-基因的大豆品种之间的杂交的子代。
本发明的疾病抗性大豆植物和种质可包含本发明的一个或R-基因(例如SEQ IDNO:6、9、12、15、18、21、24、27或30中的任何一个)。
疾病抗性大豆种子
本发明提供了疾病抗性大豆种子。如上所述，本发明的方法可用于鉴定、产生和/或选择疾病抗性大豆种子。除了上述方法，疾病抗性大豆种子可以通过任何方法产生，借这些方法将R-基因引入大豆种子中，这些方法包括但不限于转化、原生质体转化或融合，双单倍体技术，胶原蛋白拯救，基因编辑(例如CRISPR或TALEN或兆核酸酶)，和/或通过任何其他核酸转移系统产生。
在一些实施例中，疾病抗性大豆种子包含非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，大豆种子与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。
疾病抗性大豆种子可以由通过本发明的方法鉴定、产生或选择的疾病抗性大豆植物产生。
本发明的疾病抗性大豆种子可以包含来自本发明的一种或多种R-基因、通过使用其选择或通过使用其产生。
本发明的实施例包括以下：
实例
以下实例不旨在是一个本发明得以实施的所有不同方式或可以加入本发明中的所有特征的详细目录。本领域的技术人员将理解到可以在不偏离本发明的情况下对不同实施例作出众多变化和添加。因此，以下说明旨在阐述本发明的一些特定实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。
实例1.ASR抗性野生大豆属品系鉴定
针对在各种环境中收集的十六种锈菌株的ASR抗性，评估多种野生大豆属(短绒野大豆菌)品系。使用来自USDA-ARS(FL Q09、FL Q12、LABR13、FLQ11)的单个脓包衍生的分离物和田间群体(FL Q15、FLQ16、RTP1、RTP2、Vero、BR01、BR02和BR03)单个脓包衍生的分离株生成锈病数据，在封闭的设施中进行筛选。针对ASR抗性筛选短绒野大豆品系，以下短绒野大豆品系显示针对所有测试的ASR菌株的广泛抗性：PI441001、PI483224、PI583970、PI446958、PI499939、PI505220、PI499933、PI441008、PI505256或PI446961。
在多天的感染过程中评估每个短绒野大豆品系，并使用基于Burdon和Speer,TAG,1984修改的分组的锈病评定量表，在不同时间点评级(参见图6)。使用锈病分离株的大量不同的组，将每个短绒野大豆登录号筛选>2次，每次约4个植物。
实例2.针对PI441001、PI441008、PI446958、PI583970、或PI483224 ASR基因座的 等位基因挖掘和关联
将抗性亲本品系(即PI441001、PI441008、PI446958、PI583970和PI483224)与易感的短绒野大豆品系杂交并产生F1植物(参见表2)。F1植物自花受精以产生F2种子。从自交F1植物收获F2种子。播种大约200个F2种子并收集来自每株植物的叶组织用于基因分型研究。每个品系用豆薯层锈菌孵育以确定每个F2个体的抗性/易感表型。将来自50个抗性F2和50个易感F2的组织在分开的库中组合，并从每个库制备基因组DNA。针对这些库中的每个，从DNA制备Illumina测序文库，并且在两个Illumina HiSeq2000 2x100bp配对末端(PE)泳道中对每个文库进行测序。每个样品的平均产量为3.83亿读段对，这相当于每个文库77千兆碱基(gigabase)的序列。调整测序读数以除去PHRED质量分数<15的碱基。
使用GSNAP(WU和NACU 2010)作为配对末端片段，将质量调整的读数与PI441001、PI441008、PI583970和PI483224参比基因组序列进行比对。如果一对读数不能一起比对，则将它们作为单体处理以进行比对。如果读数唯一地定位到参考，则将它们用于随后的分析(每36bp≤2个错配，并且每75bp少于5个碱基作为尾部)。
基于读段深度，在BSA分析之前过滤SNP，其中保留具有40至200x读段深度的SNP。使用卡方检验(Chi-square)来选择两个库中两个等位基因之间具有显著不同读数的SNP。使用经验贝叶斯方法(LIU等人,2012)来估计在抗性库和易感库两者中每个SNP标记与因果基因座(causal locus)之间不存在重组的条件概率。SNP和因果基因之间连锁的概率是这两个条件概率的几何平均值。发现大约1000个SNP可能与靶基因座连锁。使用表型F2个体，将这些假定连锁的SNP的子集用于精细定位基因座。参见参考文献：LIU,S.,C.-T.YEH,H.M.TANG,D.NETTLETON和P.S.SCHNABLE,2012Gene Mapping via Bulked Segregant RNA-Seq(BSR-Seq)[经由混合集群RNA-Seq(BSR-Seq)进行基因定位].PLoS ONE[公共科学图书馆期刊]7:e36406和Wu,T.D.以及S.Nacu,2010Fast and SNP-tolerant detection ofcomplex variants and splicing in short reads[快速和SNP耐受的复杂变体检测和短读段中的剪接].Bioinformatics[生物信息学]26:873-881。
表2：植物杂交和研究类型
1.PI441001 Data2Bio LLC(埃姆斯公司(Ames)，爱荷华州(Iowa))用于四倍体大 豆的gBSA-Seq分析的实验室方法。
使用Data2Bio的基因组群体分离分析(gBSA)技术进行四倍体大豆群体(PI441001)中的因果基因座的染色体发现。理论上，ASR抗性由单个显性等位基因控制。从两个易感组织库和两个抗性组织库中提取的DNA样品产生四个文库。然后在八(8)个Illumina HiSeq20002x100bp配对末端(PE)泳道中对这些库进行测序。在图1-5中针对群体441001展示了用于随后的分析、从原始数据到质量调整的读段处理、比对、SNP发现和SNP影响的参比基因组的概述。在各种过滤步骤之后，在PI441001基因组中鉴定出110,503个信息性SNP与ASR抗性显著相关联。然后使用贝叶斯方法计算性状相关联概率。接下来，创建了顶部重叠群(top contig)的性状相关联SNP(概率截止值为0.01)的物理图谱(图1)。在PI441001中鉴定了两个支架46840和49652(分别为SEQ ID NO:1和2)。来自这些富集支架的SNP被定位到公开大豆基因组。在两个群体中，来自顶部支架的大多数SNP聚集在Chr05和Chr08的小部分上(参见图4)。
2.PI583970 Data2Bio LLC(埃姆斯公司(Ames)，爱荷华州(Iowa))用于四倍体大 豆的gBSA-Seq分析的实验室方法
使用Data2Bio的基因组群体分离分析(gBSA)技术进行四倍体大豆群体(PI583970)中的基因座的染色体发现。从一个易感组织库和一个抗性组织RNA库中提取的RNA样品产生两个文库。在各种过滤步骤之后，在PI583970基因组中鉴定出与ASR抗性显著相关联的59,014个信息性SNP。然后使用贝叶斯方法计算性状相关联概率。接下来，创建了重叠群上性状相关联的SNP的物理图谱。这些SNP的聚类表明抗性基因座位于支架000819F中或其附近(参见图7；支架001084F是SEQ ID NO:4)。将与这些SNP相关联的背景序列也与公开大豆基因组比对，以产生对定位区间的染色体水平的理解。然后以图形方式显示性状(ASR抗性)相关联的SNP的染色体位置。来自支架001084F的大多数SNP定位并聚集在Chr05的小区域上(参见图8)。数据表明负责ASR抗性的基因座在支架001084F上的0.11至0.30Mbp区间内或附近定位(图9)。
3.PI483224 Data2Bio LLC(埃姆斯公司(Ames)，爱荷华州(Iowa))用于四倍体大 豆的gBSA-Seq分析的实验室方法
使用Data2Bio的基因组群体分离分析(gBSA)技术进行四倍体大豆群体(PI483224)中的因果基因座的染色体发现。
从一个易感组织库和一个抗性组织库(PI483224)中提取的DNA样品产生两个文库。在各种过滤步骤之后，在PI483224基因组中鉴定出428,263个信息性SNP与ASR抗性显著相关联。然后使用贝叶斯方法计算性状相关联概率。接下来，创建了重叠群上性状相关联的SNP的物理图谱。这些SNP的聚类指示ASR抗性基因座位于支架002687F上或其附近。将与这些SNP相关联的背景序列也与公开大豆基因组比对，以产生对定位区间的染色体水平的理解。以图形方式显示性状(ASR抗性)相关联的SNP的染色体位置。来自支架002687F的大多数SNP定位到Chr05的小区域上。数据指示ASR基因座可以在支架002687F上在0.17至0.36MB的区间内或其附近定位(参见SEQ ID NO:3)。
实例3.胚拯救和将R基因区间基因渗入到大豆品系中
进行胚拯救(如下所述)并施加化学处理以诱导染色体加倍以产生双二倍体枝条。如果所述双二倍体植物是可育的，则将它们用于与大豆进行回交。需要进行与大豆进行回交并随后进行胚拯救持续若干代，以逐步消除多年生短绒野大豆染色体，最终导致ASR抗性大豆植物。
使用优良先正达(Elite Syngenta)大豆(大豆)品系(RM 3.7至4.8)进行远缘杂交。将优良大豆品系用作雌性(花粉接种者)，并将短绒野大豆的多种登录用作雄性或花粉供体。在适当的发育阶段从含有花药的短绒野大豆植物中选择花是重要的。新鲜、全开、鲜艳的花朵保持具有成熟花粉的花药。花粉应呈现松散的黄色尘状。将这些花从短绒野大豆植物中除去并与优良大豆植物杂交以进行授粉。来自短绒野大豆植物的花粉应在除花后30分钟内使用。鉴定和选择可供授粉的优质大豆花芽也很重要。当与未成熟的芽相比时，当大豆花芽的尺寸较大时，其通常是可供使用的(ready)。大豆花的萼片颜色较浅，并且花瓣刚刚开始出现。首先，使用一对细尖的镊子小心地从花芽上分离萼片，露出外层花瓣。然后，轻轻地抓住并去除花上的花瓣(总共5篇)，露出雌蕊周围的雄蕊环。由于在花药开始脱落花粉前1天，柱头受到花粉，因此认识到“雌性可供使用，雄性未能供使用(not ready)”的阶段性发育是很重要的。当在这个发育阶段授粉大豆花时，没有必要去除雌花。找到优良大豆花上的柱头。然后使用1朵雄花，小心地剥离花瓣以暴露花药，并将花粉粒轻轻地撒在大豆花的柱头上。在此过程中，应随时注意不要损害柱头。在授粉后的第二天开始，将激素混合物喷洒在授粉的花上，并且最终每天发育F1豆荚1X直至收获。授粉的花或豆荚充满了激素混合物的轻雾，注意不要使花/豆荚过早地从植物上脱落。该混合物含有100mg GA3，25mg 1-萘乙酸(NAA)和5mg激动素/L蒸馏水。这些激素的应用有助于保持豆荚发育和增加的豆荚生长。上述远缘杂交方法导致成功率显著高于文献中报道的成功率。另外，雌性花不需要去雄，这节省了时间并降低了对柱头损害的风险。
收获：在授粉后大约14至16天收获来自远缘杂交的豆荚。(文献中的收获日期显示19至21天，然而上述方法允许更快的收获时间和更强健的豆荚)。收集豆荚并根据远缘杂交组合进行计数以确定杂交成功。多个大豆雌性和短绒野大豆的5个不同的登录的平均杂交成功率大约为40％。远缘杂交豆荚可以含有1至3个种子，但通常在每个F1荚中发现2个种子。上述方法允许在授粉后14至16天收获豆荚，比文献中描述的早约5天。
胚拯救：将收获的豆荚收集并带回实验室进行灭菌。首先用70％EtOH冲洗豆荚2至3分钟，然后在平台振荡器上以大约130RPM将其置于10％ Clorox漂白剂中持续另外30分钟。最后，用无菌水冲洗豆荚多次以除去任何残留的漂白剂。在豆荚灭菌后可以立即开始胚分离，或者在胚分离之前豆荚可以在4℃储存长达24小时。接下来，将灭菌的豆荚放入层流净化罩中，在其中可以拯救胚。将个体豆荚置于无菌培养皿中并使用手术刀和镊子打开。沿着远缘杂交豆荚的长度远离种子做一个切口。然后可以容易地打开豆荚以暴露种子。可替代地，可以使用两对镊子来分离豆荚壳。小心地从豆荚中取出种子，并在解剖显微镜下放入无菌培养皿中。需要非常精细的镊子将胚与种子分离。用一只手握住镊子，轻轻地将种子的一侧远离胚，使脐带朝上。另一只手使用另一对镊子从含有胚的种子一侧除去种皮。剥掉胚周围的膜，并将胚从底部向上推。胚应该经过球状发育阶段，并且优选地经过早期心(heart)发育阶段(中期到晚期心阶段、子叶阶段和早期成熟阶段胚是所希望的)。将分离的胚转移至胚拯救培养基，如大豆ER1-1(即，3.1g B5基础盐，Gamborg的1ml B5维生素1000X，40g蔗糖[C12H22O11]，0.25g酪蛋白水解物，0.25ml BAP，0.75gMgCl2*6H20，20ml谷氨酰胺25mg/ml，0.1g丝氨酸[C3H7NO3]，4ml天冬酰胺25mg/ml以及0.05ml的IBA 1mg/ml)。Murashige和Skoog培养基(MS)以及Gamborg的B-5培养基(Bridgen,1994))也可用作胚拯救培养基。此时可以处理胚以诱导染色体加倍。(有关染色体加倍的详细信息，参见下文)将分离的胚在24℃在胚拯救培养基上保留21至30天。胚可以在ER1-1的整个孵育中保持在黑暗中，它们也可以在黑暗中孵育，并且然后在光照下完成孵育，或者可以在光照下进行整个孵育。在该方案中没有愈伤组织诱导阶段，枝条直接从胚发育，这允许更快的周转时间、小植株存活和更好的质量结果。上述胚拯救方法涉及从胚直接枝条再生，而不是通过胚发生再生，从而使植物恢复更快(与文献中报道的长达1年时间线相比，枝条在大约2-3个月内恢复)。另外，以下方案在转移至萌发培养基后不需要在黑暗中培养，上述方案也不需要转移至生根培养基。
染色体加倍处理：秋水仙碱或氟乐灵可用于诱导染色体加倍。理想地，对晚期心阶段远缘杂交胚(或更大)进行化学处理以在分离长达1周后的任何时间紧接分离进行诱导染色体加倍。双倍剂可以在固体或液体培养基中混合并施用数小时或长达几天。氟乐灵在固体或液体培养基中以10-40uM浓度使用。可替代地，秋水仙碱在固体或液体培养基中以0.4-1mg/ml的浓度使用。化学处理后，将胚转移到新鲜胚拯救培养基中。
枝条再生：将发育中的胚从拯救培养基转移至萌发培养基，如Soy ER GSMv2(即3.2g Schenk和Hilderbrandt基础盐混合物，1g肌醇[C6H12O6]，5ml硫胺素1mg/ml，0.5ml吡哆醇1mg/ml，10g蔗糖[C12H22O11]以及7.5g纯化琼脂)，在24℃光照下持续大约3至5周。可替代地，可以将发育中的胚从拯救培养基转移至伸长培养基，如大豆E1 0No TCV(即4.3gMS基础盐混合物[MSP01]，5ml MS铁200X，30g蔗糖[C12H22O11]，1g MES[C6H13NO4S]，8g纯化琼脂，1ml B5维生素100X，2ml谷氨酰胺25mg/ml，0.50ml玉米素核苷，反式异构体1mg/ml，0.1ml IAA 1mg/ml，0.2ml GA3 5mg/ml，1.5ml特美汀100mg/ml，0.3ml头孢噻肟250mg/ml，0.5ml万古霉素100mg/ml)。在24℃光照下，可将枝条保持在培养基上约3至5周。发育中的枝条可以从培养基平板转移到含有萌发或伸长培养基的Phytocons中，用于进一步枝条发育。将具有合适根的已建立的枝条移至土壤中。
倍性分析：使用流式细胞仪进行倍性分析。从培养物中或在土壤中建立后的小枝条中收集用于倍性分析的叶组织。将组织在干冰上收集并储存在-80℃直至分析，或在湿冰上收集并在同一天进行分析。0.5cm2的样品尺寸是足够的。根据Sysmex试剂盒(希森美康有限公司(Sysmex Inc.)，日本神户(Kobe Japan))中的说明书制备样品。每个样品组含有未处理的F1植物(未处理以诱导染色体加倍)作为对照。
实例4.ASR抗性性状基因渗入
将从远缘杂交(即短绒野大豆与大豆杂交)以及随后如实例3描述的胚拯救而产生的双二倍体品系与轮回优良大豆品系回交多次。本领域已知需要多次回交以产生可育的杂种品系，特别是文献表明BC3代是必需的。在这种情况下，确定需要另外的回交，在短绒野大豆x大豆以产生可育的杂种植物的情况下，需要BC4。通过如上所述的方法产生的F1杂种植物由包含PI441001、PI441008、PI446958、PI583970和PI483224的远缘杂交产生。接下来将F1植物作为雌性与雄性轮回大豆植物杂交，以进行第一次回交(BC1子代)。将BC1子代进一步回交多代(例如BC2)。评估BC植物的ASR抗性、染色体数目，并且在一些情况中，通过使用如本文所述的分子标记对品系进行基因分型，以检测对应于SEQ ID NO 1-5的染色体区间的存在或表1-5中鉴定的任何标记。
实例5.鉴定位于短绒野大豆染色体5区间内的两个致因基因。
对各种短绒野大豆区间的进一步基因分型导致发现了位于染色体5上的所公开区间内的两个针对ASR抗性的致因基因。第一基因类型编码TNLW R-基因基序，并在分别位于PI441001和PI583970的SEQ ID NO 6和30中描述。位于所发现的区间中的第二基因类型编码CNL R-基因基序，并在SEQ ID NO 9、12、15、18、21、24和27中描述。预期这些基因或其同系物中的任何一个可用于如上所述利用胚拯救的转基因方法、基因编辑方法或育种方法中，以产生对ASR具有增强抗性的植物。
实例6.构建包含R-基因的载体
生成包含上述实例5中描述的每一个R-基因的构建体。
a)包含SEQ ID NO:6的R-基因的载体构建体
载体类型：二元载体
构建体大小(bp)：30,982
功能描述：用于在ALS选择情况下大豆转化的二元载体，其具有gGtoRG1-01，一种编码蛋白质的大豆锈病抗性候选基因，所述蛋白质含有Toll/白介素-1受体(TIR)、核苷酸结合位点(NBS)、富亮氨酸重复(LRR)和与Glyma.05G165800(大豆_william82_v2)同线的WKRY结构域。
克隆方法：金斯瑞公司(GenScript)将RG1合成为四个片段RG1-部分I、RG1-部分II、RG1-部分III和RG1-部分IV[U9490BJ270-1(23950)、U9490BJ270-2(23952)、U9490BJ270-3(23953)、和U9490BJ270-4(23954)]。通过SanDI/ScaI、ScaI/RsrII分别将第一个和最后2个片段克隆到桥载体21177中，得到中间体21177-部分I+II和21177部分-III+IV。然后通过在22296的SanDI位点进行三向连接，将两种中间体中的部分I+II(SanDI/ScaI)，部分III+IV(ScaI/RsrII)一次全部克隆到22296中。通过用Alw44I/NheI/SalI消化并通过克隆接头上的测序来确认阳性克隆(SYN04455:65-78)。
使用的序列包括SEQ ID NO.6(编码序列)、SEQ ID NO.7(启动子)和SEQ ID NO.8(终止子)。SEQ ID NO:6编码SEQ ID NO:47的蛋白质。
b)包含SEQ ID NO:9的R-基因的载体构建体
载体类型：二元载体
构建体大小(bp)：17,713
功能描述：用于在ALS选择情况下大豆转化的二元载体，其具有编码蛋白质的大豆锈病抗性候选基因，所述蛋白质含有卷曲-卷曲(CC)、核苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复(LRR)结构域。所述基因与Glyma.05G165600(大豆_william82_v2)同线。
克隆方法：金斯瑞公司将RG2合成为两个片段部分I(SanDI/SacI，U1935CD120-1,24076)和部分II(SacI/RsrII，U1935CD120-2,24077)，并在SanDI处连接到22296上。通过用Alw44I/EcoRI消化并通过克隆接头上的测序来确认阳性克隆(SYN04455:151-153)
使用的序列包括SEQ ID NO.9(编码序列)、SEQ ID NO.10(启动子)和SEQ IDNO.11(终止子)。SEQ ID NO:9编码SEQ ID NO:48的蛋白质。
c)包含SEQ ID NO:12的R-基因的载体构建体
载体类型：二元载体
功能描述用于在草甘膦(EPSPS)选择情况下大豆转化的二元载体，其具有编码蛋白质的来自短绒野大豆PI583970的大豆锈病抗性候选基因，所述蛋白质含有卷曲-卷曲(CC)、核苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复(LRR)结构域，用短绒野大豆天然启动子和终止子(基因组DNA)表达。所述基因与Glyma.05G165600(大豆_william82_v2)同线。
使用的序列包括SEQ ID NO.12(编码序列)、SEQ ID NO.13(启动子)和SEQ IDNO.14(终止子)。SEQ ID NO.12编码SEQ ID NO:42的蛋白质。
d)包含SEQ ID NO:15的R-基因的载体构建体
载体类型：二元载体
构建体大小(bp)：14,706
功能描述：用于在草甘膦选择(EPSPS)情况下大豆转化的二元载体，其具有编码蛋白质的来自短绒野大豆(PI583970)的大豆锈病抗性候选基因cGtoRG13-01，所述蛋白质含有卷曲-卷曲(CC)、核苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复(LRR)结构域并且由大豆GmUbi启动子和拟南芥终止子加大豆科扎克序列驱动。所述候选基因与Glyma.05G165600(大豆_william82_v2)同线。
克隆方法：位点诱变U3962BF220-1(prGmUBI1)，以便可以使用SanDI和BamHI切割启动子片段(金斯瑞公司的U1466CH300_6)。作为BamHI-SacI片段来合成cGtoRG13(金斯瑞公司的GS19921，U1466CH300_6)，切出所述片段。在SanDI和SacI位点之间通过三向连接进入23899，以获得VC21449新(SYN03277:183)。通过使用SalI和ApaLI以及单独的HincII进行消化来验证构建体，然后进行测序(SYN03277:184-185)。
使用的序列包括SEQ ID NO.15(编码序列)、SEQ ID NO.16(来自大豆的prGmUbi1-01天然遍在蛋白1启动子；登录号D16248.1)和SEQ ID NO.8(终止子tAtUBQ3-02 A，距tAtUbq3-01(拟南芥Ubq33'-UTR)328bp。SEQ ID NO:15编码SEQ ID NO:43的蛋白质。
e)包含SEQ ID NO:18的R-基因的载体构建体
载体类型：二元载体
功能描述用于在草甘膦(EPSPS)选择情况下大豆转化的二元载体，其具有编码蛋白质的来自短绒野大豆PI583970的大豆锈病抗性候选基因，所述蛋白质含有卷曲-卷曲(CC)、核苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复(LRR)结构域，用蒺藜苜蓿启动子和拟南芥终止子加上大豆科扎克序列表达。所述基因与Glyma.05G165600(大豆_william82_v2)同线。
克隆说明参见VC21449...用prMt51186-03启动子替换prGmUbi1-01。将SanDI/RsrII基因盒连接到23614的SanDI位点。或者如果可能的话，直接从在VC21449中制造的二元(SanDI/BamHI)载体交换启动子。
使用的序列包括SEQ ID NO.18(编码序列)，SEQ ID NO.19(启动子prMt51186-03，通过基因芯片探针ID Mtr.51186.1.S1鉴定的来自蒺藜苜蓿基因的启动子)和SEQ IDNO.20(终止子拟南芥遍在蛋白UTR)。SEQ ID NO:18编码SEQ ID NO:49的蛋白质。
f)包含SEQ ID NO:21的R-基因的载体构建体
载体类型：二元载体
构建体大小(bp)：16,801
功能描述：用于在草甘膦选择(cmEPSPS)情况下大豆转化的二元载体，其具有衍生自短绒野大豆(PI446958)gGtoRG11-01的基因组片段，gGtoRG11-01表达编码蛋白质的大豆锈病抗性候选基因，所述蛋白质含有卷曲螺旋、核苷酸结合位点和富亮氨酸重复结构域(CC-NBS-LRR)。所述大豆锈病抗性基因与Glyma.05G65600(大豆_williams82 v2)同线。
克隆方法：用SanDI/SacI消化U8867CG170-1获得RG11-部分I片段(4899bp)，用SacI/RsrII/Eam1105I消化U8867CG170 -2获得RG11-部分II片段(2609bp)，将这两个片段在SanDI位点连接到20660上。通过用Alw44I/EcoRI/Bsp119I消化并通过克隆接头上的测序来确认所得到的构建体VC21209。(SYN04456:102-105)。所得到的构建体是24160。
使用的序列包括SEQ ID NO.21(编码序列)、SEQ ID NO.22(启动子)和SEQ IDNO.23(终止子)。SEQ ID NO:21编码SEQ ID NO:44的蛋白质。
g)包含SEQ ID NO:24的R-基因的载体构建体
载体类型：二元载体
功能描述用于大豆转化的二元载体，表达编码蛋白质的大豆锈病抗性候选基因cGtoRG11Ver221F，所述蛋白质含有卷曲螺旋、核苷酸结合位点和富亮氨酸重复结构域(CC-NBS-LRR)。该基因与Glyma.05G65600(大豆_williams82 v2)同线并衍生自短绒野大豆(PI446958)重叠群221F等位基因gGtoRG11-01。表达由大豆Ubi1启动子和拟南芥Ubq3终止子驱动。载体利用草甘膦选择(cmEPSPS)。
克隆说明用BamHI/SacI消化合成的编码序列(去除内部SacI位点)，并连接至二元载体24171的BamHI/SacI位点，以替换当前的CNL基因。
注：启动子和终止子与构建体24171相同
使用的序列包括SEQ ID NO.24(编码序列)、SEQ ID NO.25(启动子)和SEQ IDNO.26(终止子)。SEQ ID NO:24编码SEQ ID NO:45的蛋白质。
h)包含SEQ ID NO:27的R-基因的载体构建体
载体类型：二元载体
与在构建体24160中发现CNL是等位基因。通过PI446958基因组DNA的高保真PCR扩增鉴定。手册参考SY04474:53
正向引物：GGATTATGTTTATATTCGAGTACATGCTATTGC
反向引物：
GGGATTCAAAGGCATCTTAGATTAGTCAAACATCC
熔融温度：98℃
退火温度：58℃
延伸温度：72℃
35个循环
通过琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物，然后亚克隆到TOPO克隆(PCR Blunt)载体中。在卡那霉素-LB选择培养基上分离单个大肠杆菌菌落。制备质粒制备物，并对插入物进行测序。
功能描述用于大豆转化的二元载体，表达编码蛋白质的大豆锈病抗性候选基因cGtoRG11Ver1F，所述蛋白质含有卷曲螺旋、核苷酸结合位点和富亮氨酸重复结构域(CC-NBS-LRR)。该基因与与Glyma.05G65600(大豆_williams82 v2)同线并衍生自短绒野大豆(PI446958)重叠群1F等位基因(与gGtoRG11-01的等位基因相似)。表达由大豆Ubi1启动子和拟南芥Ubq3终止子驱动。载体利用草甘膦选择(cmEPSPS)。
使用的序列包括SEQ ID NO.27(编码序列)、SEQ ID NO.28(启动子)和SEQ IDNO.29(终止子)。SEQ ID NO:27编码SEQ ID NO:46的蛋白质。
i)包含SEQ ID NO:30的R-基因的载体构建体
载体类型：二元载体
功能描述：用于在ALS选择情况下大豆转化的二元载体，其具有编码蛋白质的大豆锈病抗性候选基因，所述蛋白质含有Toll-白介素样受体(TIR)、核苷酸结合位点(NBS)、富亮氨酸重复(LRR)、与Glyma.05G165800(大豆_william82_v2)同线的WKRY结构域。
克隆方法：金斯瑞公司(GenScript)将RG5合成为四个片段RG5-部分I、RG5-部分II、RG5-部分III和RG5-部分IV[U9490BJ270-5(23955)、U9490BJ270-6(23956)、U9490BJ270-7(23957)、和U9490BJ270-8(23958)]。将前3个片段分别以SanDI+Kpn2I克隆到桥载体21177中，以获得中间体21177-部分I+II+III。然后通过在22296的SanDI位点进行三向连接，将来自该中间载体的部分I+II+III(SanDI/Kpn2I)和部分IV(Kpn2I/RsrII)一次全部克隆到22296中。通过用NcoI/HindIII消化并通过克隆接头上的测序来确认阳性克隆(SYN04455:65-78)。
使用的序列包括SEQ ID NO.30(编码序列)、SEQ ID NO.31(启动子)和SEQ IDNO.32(终止子)。SEQ ID NO:30编码SEQ ID NO:50的蛋白质。
实例7.针对ASR的R-基因的验证
使用真菌b-微管蛋白转录物作为抗性测量的分子测定的验证
在我们的表型分型工作中，我们使用了症状评估和分子测定来进行锈病抗性或易感性评级。症状评估是Burdon和Speer(TAG，1984)的锈病评级量表的修订版。分子测定是基于先正达公司科学家鉴定的真菌管家基因b-微管蛋白，b-微管蛋白探针靶向大豆锈病的特定区域，而不是其他病原体或植物物种。此外，我们验证了这种结合表型症状观察的分子测定，如图9和图1所示。图9，从左到右，从上到下，描绘了完全抵抗(Rpp1品系)、少数无孢子形成的病变(Rpp5品系)、许多有很少孢子形成的病变(Rpp6品系)、很多有一些棕褐色病变加孢子形成的病变(Rpp2品系)、到很多有大量孢子形成的棕褐色病变(Rpp4、Rpp1b和Jack)。由于本实例中使用的锈病对Rpp4和Rpp1b是剧毒的，这2个品系表现出与易感对照Jack一样严重的易感性。
与这些观察一致的是，使用图1的曲线图所示的真菌b-微管蛋白转录物进行的测量，从左到右，未检测到转录物(完全抗性，Rpp1品系)、几乎检测不到水平的转录物(少数无孢子形成的病变，Rpp5和Rpp6品系)、低水平的转录物(许多有很少孢子形成的病变，Rpp6品系)、中等水平的转录物(很多有一些棕褐色病变/孢子形成的病变，Rpp2品系)、高水平的转录物(很多有大量孢子形成的棕褐色病变，Rpp4、Rpp1b和Jack(CK)品系)。
从这些数据集中，我们已经表明，使用真菌b-微管蛋白或其他管家基因的分子测定与表型症状评级一样可靠和具有指示性，并且提供了比基于症状的表型评级更高的分辨率。
利用已知大豆锈病R基因的瞬时叶基因表达系统的验证
开发了一种瞬时分离裂叶测定来验证锈病抗性。这是通过以下来实现：使用易感大豆的叶或其野生近缘种的叶，在叶的一侧瞬时表达GUS对照载体并且在叶的另一侧瞬时表达含有R-基因的载体(即，叶中脉是分隔线，此外，除了各自的CDS(GUS或R-基因)之外，对照和实验载体是相似的)。浸润2-3天后，用锈病菌喷施叶。在约10-17天时，选择浸润的叶，用中脉分割器将其切成两半。切出仅具有浸润的区域的每个叶片左侧(顶视图)，并填充在96孔块中的1个孔中，标记为构建体左侧-1。切出叶的右侧(顶视图)并填充在一个孔中，右半叶填充另一个，8对孔/构建体。在每个实验中，叶的右侧浸润含有GUS的构建体，而左侧浸润目的构建体。对于GUS对照，这意味着叶的两侧都浸润了含有GUS的结构体。利用真菌b-微管蛋白转录物的定量聚合酶链式反应对它们所有进行了真菌生物量测量分析。
首先，使用作为阴性对照的GUS(在构建体17282中)和CcRpp1(来自木豆的大豆锈病R基因，在构建体23677中)对所述系统进行验证。当处于纯合状态且蛋白质水平达到一定水平(对于来自木豆的大豆锈病抗性，Kawashima等人,2016for soy rust resistancefrom pigeon pea)时，CcRpp1在稳定的转基因大豆中显示出接近100％的疾病控制。它适合用作系统验证的阳性对照。GUS和CcRpp1构建体与构建体18515(其是用于转化效率度量的CFP构建体)共浸润。
在定量逆转录聚合酶链式反应中，三种方法来利用真菌b-微管蛋白和CFP的转录物处理数据。可以使用CFP作为转化效率度量。在此设置中，使用了图2中的公式。
如图3所示，在95％置信度下，与含有GUS构建体相比，含有CcRpp1的构建体具有显著更低的标准化的真菌生物量积累，而GUS对照与1没有显著差异，这意味着从用GUS浸润的两侧积累的真菌生物量没有统计学差异。而与含有GUS的构建体浸润的一侧相比，含有CcRpp1的构建体浸润的半叶产生显著更低的量。这个实验重复了一次，并且得到了相似的结果。在所有实验中，使用先正达优良品系或灰色大豆(Glycine canescens)品系。从这个实验中，普通技术人员可以认为其他大豆品系或近缘豆科植物也可以使用。
我们还在没有CFP转化效率对照的情况下对系统进行了测试。在本实验中，我们比较了来自583970的包含GUS、CcRpp1和CNL的构建体(构建体24230)。24230衍生自基因组DNA，所述基因组DNA使用从包含卷曲-卷曲核苷酸结合和富亮氨酸重复(CNL)的重叠群819F设计的引物扩增。在这个实验中，我们测试了CFP转化效率对照是否可以跳过。因为在这个实验中没有CFP，所以使用图4中的公式来处理任何给定构建体的转录物数据。
如图5所示，当与GUS阴性对照相比时，CcRpp1和24230(SEQ ID NO:X)都显示出锈病抗性功效。但令人惊讶的是，24230似乎比CcRpp1更有效。这可能是由于CcRpp1的表达水平不足够高，不能像在稳定的转基因中那样赋予完全的抗性。然而，它确实加强了裂叶的叶表达足以检测抗性功能的观察。
我们进一步测试了作为阴性对照的其他GUS构建体。在该实验中，使用构建体21349(GUS)和24230(来自PI 583970的CNL R基因，SEQ ID NO:X)。如图6所示，衍生自24230的两组样品在真菌生物量方面低于21349。在此设置中，我们比较了直接用目的构建体浸润的一侧的真菌b-微管蛋白与用包含GUS的构建体浸润的另一侧的真菌b-微管蛋白，但没有标准化，除了转录物读段的值用Log2处理。同样，用构建体24230浸润的一侧显示出显著低于用包含GUS的构建体浸润的一侧的真菌生物量。
我们还测试了另一个构建体23969和GUS对照。23969在染色体5区间中含有另一个候选基因，其编码Toll白介素间核苷酸结合和富亮氨酸重复具WRKY结构域蛋白(TNLW)。由该构建体中的基因赋予的这种抗性是明显的，如显著低于GUS阴性对照的真菌生物量水平所示(图6)。
ASR候选基因载体的稳定转化
将根癌农杆菌菌株(含有带有PAT、ALS或EPSPS选择标记基因和一个或多个大豆锈病抗性候选基因的单个二元载体)转化进入通过此处描述的方法从吸胀的大豆种子制备的外植体(Khan 2004,美国专利申请公开号20040034889)。大豆种子选自Jack、Williams 82或先正达优良品种如06KG 218440。图7和8显示了稳定转化体在T1阶段(SEQ ID NO:21)和T0阶段(SEQ ID NO:27)的数据。
从以上数据集，我们有理由相信，在区间内的两个基因，CNL和TNLW，都赋予了对大豆锈病的抗性。将它们叠加在一起检验这两个基因所赋予的抗性是合理的，可以预期有更强的抗性。
以上实例清楚地说明本发明的优点。虽然已经参考某些实施例的具体细节描述本发明，但不希望此类细节被视为对本发明范围的限制，除非它们被包括在所附权利要求书中或到它们被包括在所附权利要求书中的程度。
在整个申请中，引用了各种专利、专利出版物和非专利出版物。这些专利、专利出版物和非专利出版物的披露内容通过引用以其整体在此并入本申请中，以便更全面地描述本发明所属领域的现状。
从以上数据集，我们有理由相信，在区间内的两个基因，CNL和TNLW，都赋予了对大豆锈病的抗性。将它们叠加在一起检验这两个基因所赋予的抗性是合理的，可以预期有更强的抗性。
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本发明的一些实施方案如下：
1.一种载体，所述载体包含编码CNL或TNLW R基因基序的R-基因，其中所述R-基因衍生自短绒野大豆(例如来自公开可获得的登录号品系PI441001、PI483224、PI583970、PI446958、PI499939、PI505220、PI499933、PI441008、PI505256或PI446961中的任一个)。
2.一种载体，所述载体包含可操作地连接到启动子的R-基因，其中所述R-基因是在任一处与SEQ ID NO:6、9、12、15、18、21、24、27或30中任一个具有70％-100％序列同一性的核苷酸序列。
3.一种载体，所述载体包含可操作地连接到启动子的R-基因，其中所述R-基因编码与SEQ ID NO:42、43、44、45、46、47、48、49或50中的任一个具有至少90％序列同一性的蛋白质。
4.如实施方案1-3中任一项所述的载体，其中所述启动子包含SEQ ID NO:7、10、13、16、19、22、25、28或31中的任一个。
5.一种植物细胞和/或植物，所述植物细胞和/或植物包含如实施方案1-4中任一项所述的载体。
6.如实施方案5所述的植物细胞，其中所述植物细胞和/或植物是大豆。
7.一种制备大豆病原体抗性植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.使受体植物细胞与如实施方案1-4中任一项所述的载体接触，其中将所述载体并入所述受体植物细胞的基因组中；
b.将所述受体植物细胞再生为植物；和
c.测定所述植物对大豆病原体的抗性。
8.如实施方案9所述的方法，其中所述载体包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码选自由以下组成的组的蛋白质序列：SEQ ID NO.42、43、44、45、46、47、48、49或50。
9.如实施方案9所述的方法，其中所述载体包含选自由以下组成的组的多核苷酸序列：SEQ ID NO:6、9、12、15、18、21、24、27或30。
10.一种大豆病原体抗性植物，所述大豆病原体抗性植物通过如实施方案7-9中任一项所述的方法获得。
11.一种优良大豆植物，所述优良大豆植物包含选自由以下组成的组的蛋白质序列：SEQ ID NO.42、43、44、45、46、47、48、49或50。
12.如实施方案11所述的大豆植物，其中将选择的序列进行转基因引入。
13.如实施方案10-12中任一项所述的优良大豆植物，其中所述大豆植物对以下中的任一个具有增加的抗性：大豆胞囊线虫、细菌性脓疱、根结线虫、大豆灰斑病、疫霉菌、褐茎腐病、线虫、亚洲大豆锈病、黑粉病、二孢白粉菌、菊科白粉菌、小麦白粉菌、瓜类单囊壳(Podosphaera xanthii)、黄瓜白粉菌、终极腐霉菌、葡萄钩丝壳、豌豆球腔菌、稻瘟菌、稻平脐蠕孢、稻瘟菌、立枯丝核菌、大豆疫霉菌、麦二叉蚜、烟粉虱、玉米蚜、网纹野蛞蝓、小蔗螟、麦二叉蚜或桃蚜。
14.如实施方案10-13中任一项所述的优良大豆植物，其中所述植物对亚洲大豆锈病具有抗性。
15.一种在田间控制亚洲大豆锈病的方法，所述方法包括种植来自实施方案10-14中描述的植物中任一个的种子的步骤。
16.一种核酸分子，所述核酸分子包含可操作地连接到异源启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码选自由以下组成的组的多肽：
a.SEQ ID NO.42、43、44、45、46、47、48、49或50；或者
b.与(a)的至少一种多肽具有至少90％同一性的多肽。
17.如实施方案16所述的核酸分子，其中所述异源启动子是植物可表达型启动子。
18.一种载体，所述载体包含如实施方案16或17所述的核酸分子。
19.一种转基因细胞，所述转基因细胞包含如实施方案16或17所述的核酸或如实施方案18所述的载体。
20.如实施方案19所述的转基因细胞，其中所述细胞为转基因植物细胞。
21.如实施方案20所述的转基因植物细胞，其中所述植物细胞是：
a.单子叶植物细胞，任选地是大麦细胞、玉蜀黍细胞、燕麦细胞、水稻细胞、高粱细胞、甘蔗细胞或小麦细胞；或者
b.双子叶植物细胞，任选地是大豆细胞、向日葵细胞、番茄细胞、芸苔属作物细胞、棉花细胞、糖用甜菜细胞或烟草细胞。
22.如实施方案21所述的转基因植物细胞，其中所述植物细胞是大豆细胞。
23.一种转基因植物，所述转基因植物包含如实施方案21或22所述的转基因植物细胞。
24.一种如实施方案23所述的转基因植物的转基因种子。
25.一种收获产物，所述收获产物衍生自如实施方案23所述的转基因植物或如实施方案24所述的转基因种子。
26.一种加工产物，所述加工产物衍生自如实施方案25所述的收获产物，其中所述加工产物是粉、粕、油、淀粉、或衍生自前述任一项的产物。
27.一种产生转基因植物的方法，所述转基因植物对大豆病原体具有增加的抗性并且包含R-基因，所述方法包括将如实施方案16或实施方案17所述的核酸分子或如实施方案18所述的载体引入植物，其中所述R-基因在所述植物中表达，从而产生对大豆病原体具有增加的抗性的转基因植物。
28.如实施方案27所述的方法，其中所述引入步骤包括：
i.用所述核酸分子或载体转化植物细胞并再生转基因植物；或者
ii.使包含所述核酸分子或载体的第一植物与第二植物杂交。
29.如实施方案27或实施方案28所述的方法，其中所述方法进一步包括从所述转基因植物获得一个或多个世代的子代植物，其中所述子代植物包含所述核酸分子或所述载体并且对大豆病原体具有增加的抗性。
30.一种测定对ASR的抗性的方法，所述方法包括：
a.获得大豆品种的叶或来自相关野生大豆属植物的叶；
b.在所述叶的一侧瞬时表达GUS或其他报告基因对照载体；
c.在所述叶的另一侧瞬时表达R-基因；
d.用ASR孢子喷施所述叶；
e.约10-17天后，用中脉分割器将所述叶切成两半；以及
f.分析每一半叶的真菌生物量。

Claims (5)

1.分离的DNA构建体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸编码SEQ ID NO:47的多肽，可操作地连接到包含SEQ ID NO:7的植物可表达型启动子，并且可操作地连接到包含SEQ IDNO:8的终止子。
2.如权利要求1所述的分离的DNA构建体，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:6。
3.分离的DNA构建体，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:6，可操作地连接到包含的植物可表达型启动子，并且可操作地连接到包含SEQ ID NO:8的终止子。
4.核酸分子，其包含可操作地连接到异源启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码由下述序列组成的多肽：
a.SEQ ID NO:42；
b.SEQ ID NO:43；
c.SEQ ID NO:44；
d.SEQ ID NO:45；
e.SEQ ID NO:46；
f.SEQ ID NO:48；
g.SEQ ID NO:49；或
h.SEQ ID NO:50。
5.如权利要求4所述的核酸分子，其中
(i)编码(a)的多肽的多核苷酸由SEQ ID NO:12组成；
(ii)编码(b)的多肽的多核苷酸由SEQ ID NO:15组成；
(iii)编码(c)的多肽的多核苷酸由SEQ ID NO:21组成；
(iv)编码(d)的多肽的多核苷酸由SEQ ID NO:24组成；
(v)编码(e)的多肽的多核苷酸由SEQ ID NO:27组成；
(vi)编码(f)的多肽的多核苷酸由SEQ ID NO:9组成；
(vii)编码(g)的多肽的多核苷酸由SEQ ID NO:18组成；并且
(viii)编码(h)的多肽的多核苷酸由SEQ ID NO:30组成。
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