CN111885913B - 抵抗芸薹根肿菌(根肿病)的芸薹属植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及芸薹属(Brassica)中的根肿病抗性。更具体地，本发明涉及CRT抗根肿病基因，以及涉及产生抗根肿病芸薹属植物的方法。

Description

抵抗芸薹根肿菌(根肿病)的芸薹属植物
技术领域
本发明涉及十字花科(Brassicacea)中疾病控制的领域。提供了通过在植物基因组中引入抗根肿病基因产生抗根肿病植物的方法。还提供了在其基因组中包含一个或多个根肿病抗性基因座的欧洲油菜(B.napus)植物和种子。还提供了用于检测欧洲油菜植物、组织或种子中一个或多个抗性等位基因存在情况的检测工具，以及用于将一个或多个抗性等位基因转移至其他芸薹属植物的方法和将不同抗性基因座组合在杂交种子和植物中的方法。还提供增强对芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)抗性的耐久性的方法，以及本发明植物和种子和方法或试剂盒的用途。
发明背景
根肿病是一种由芸薹根肿菌引起的疾病，其侵袭十字花科(Brassicaceae)植物，包括许多重要的蔬菜和广亩作物。全部十字花科成员均被认为是芸薹根肿菌的潜在宿主(Dixon,2009,J Plant Growth Regul 28:194)。易感的栽培作物包括如下者的全部变种：甘蓝(B.oleracea)、西方甘蓝蔬菜类(Occidental Cole vegetables)(抱子甘蓝、卷心菜、西兰花/绿花茎甘蓝、花椰菜、烹饪用和饲用羽衣甘蓝、球茎甘蓝)；芜青(B.rapa)(同义词：菜心(B.campestris))(包括蔓青、芜菁、野油菜(sarson))，和为数众多提供叶用和根用蔬菜的东方变体如大白菜(Brassica rapa var.pekinensis)和小白菜(Brassica rapavar.chinensis)(白菜)；欧洲油菜，包括瑞典芜菁(swede)(芜菁甘蓝(rutabaga))、欧洲油菜和饲用油菜；和种子、调味品(芥末)及从埃塞俄比亚芥(B.carinata)、黑芥(B.nigra)和芥菜(B.juncea)衍生的蔬菜作物。相关的属，诸如萝卜(萝卜属(Raphanus))，十字花科杂草，例如，白芥属(Sinapis)，以及装饰性观赏植物，包括紫罗兰(紫罗兰属物种(Matthiolaspp))和壁花(桂竹香(Cheiranthus cheiri))，可被感染。科学上的模式植物拟南芥(Arabidopsis)也是易感的(Dixon，2009，上文)。
根肿病症状发展以受累植物的根上形成棒形瘿为特征。结果是，感染根对养分和水的摄取被抑制。地上部分症状包括萎蔫、生长迟缓、黄化和早衰(Hwang等人,2012,MolPlant Pathol 13:105)。
在其中栽培有宿主植物的全部区域中，估计大约10％有根肿病的存在(Diederichsen等人,2009,J Plant Growth Regul 28:265)。根肿病很大程度上已经是在上个世纪的蔬菜作物疾病。然而，在2003年，在阿伯塔省的中央部分发现了12块根肿病侵染的商业田块。此后，确认肿病侵染的田块数稳定增长，并且，截止2010年，已经在阿伯塔省发现超过560块田地(超过35,000公顷)遭受芸薹根肿菌根肿菌(P.brassicae)侵染(Hwang等人,2012，上文)。在采用魁北克境内根肿病侵染田块上培育的卡诺拉油菜的研究中报道产量损失80％-91％。种子库质量也明显降低，含油量下降4.7％-6.1％并且千粒重下降13％-26％(Hwang等人,2012，上文)。
植物抗性是对抗根肿病的强有力工具。根肿病抗性育种如今在日本和韩国聚焦于白菜(大白菜(B.rapa spp.Pekinensis))、在德国和瑞士聚焦于菜籽油菜，及聚焦于几种甘蓝蔬菜。最近公开的抗性栽培品种属于三个芸薹属物种(Brassica sp.)：欧洲油菜、甘蓝和芜青(Diederichsen等人,2009，上文)。
已经鉴定了欧洲饲用蔓青(B.rapa ssp,rapifera)的抗性来源，其已经用于向白菜转移根肿病抗性基因。根肿菌赋予对芸薹根肿菌的特定致病型的差异(小种专化或垂直)抗性的至少三个独立的显性基因似乎存在于多个蔓青基因型(Piao等人,2009,J PlantGrowth Regul 28:252)中。已经通过QTL作图鉴定到芜青中存在的八个可能的根肿病抗性基因：来自抗性源ECD02的CRa、来自Gelria R的CRb、来自Siloga的Crr1、Crr2和Crr4、来自Milan White的Crr3和来自Debra的CRk和CRc。Crr1、Crr2、Crr3、Crr4和CRc分别定位至染色体R8、R1、R3、R6和R2。CRa、CRb和CRk连同Crr3定位在相同的连锁群R3上，但是它们并不位于相同的染色体区域，CRk和Crr3例外(Piao等人,2009，上文；Sakamoto等人,2008,TheorAppl Genet 117:759)。
在甘蓝中，几乎没有鉴定到完全抗性种质。甘蓝中的根肿病抗性遗传似乎为多基因性并且受控于许多显性等位基因并以不完全显性的加性效应主导。还已经提出的是，研究的抗性之一受两个互补基因控制(Piao等人,2009，上文)。已经在甘蓝中发现了至少22个QTL，表明了甘蓝中根肿病抗性的复杂遗传基础。由于不同定位研究使用不同的根肿病抗性源及不同的芸薹根肿菌分离株，不可能比较这些QTL(Piao等人,2009，上文)。
还已经在几个欧洲油菜栽培变种中观察到根肿病抗性。已经在欧洲油菜中鉴定到至少22个根肿病抗性QTL。一个主基因，Pb-Bn1，已经定位到连锁群DY4上，并且已经分别在染色体DY4和DY15上鉴定到至少两个加性QTL。此外，九个区域之间的上位互作(有或无加性效应)已经得到定位。已经在双单倍体群体中鉴定到一个主基因和两个衍生自ECD04的隐性基因。在通过将栽培变种
Figure BDA0002682374190000031
(甘蓝)和ECD-04(芜青)杂交所形成的再合成欧洲油菜中，八条染色体上检出十九个对七个分离株表达抗性的QTL，其中四者在染色体N03上彼此紧密连锁，以及三者在染色体N08上连锁。基因CRk和Crr3位于N03上的相似区域PbBn-k-2、PbBn-1-1和PbBn-01:60-1。CRa和CRb独立于它们之外。PbBn-01.07-2、PbBn-l-2和PbBn-a-1与欧洲油菜中染色体N08上的BRMS088连锁，其还与芜青中R8上的Crr1连锁。PbBn-k-1位于染色体N02上。位于N03和N19上的QTL起到强烈效果并赋予广谱抗性(Piao等人,2009，上文；和Werner等人,2008,Theor Appl Genet 116:363)。最近也已经鉴定到涉及抵抗多种芸薹根肿菌致病型(包括致病型5x)的根肿病抗性基因座(WO2016/176358)。
芜青CRa基因已经精细定位并且已经将TIR-NBS-LRR基因鉴定为CRa基因(Ueno等人,2012,Plant Mol Biol 80:621)。Crr1基因已经定位并从芜青种欧洲饲用蔓青“Siloga”分离。Crr1a还编码一种TIR-NB-LRR抗病性蛋白(Hatakeyama等人,2013,PLOS one 8:e54745和WO2012/039445)。
来自芜青的CRb基因已经精细定位到一个140kb基因组区域。在该区域内，其中预测了十四种功能性蛋白质，其中有Rho家族蛋白和两种TIR-NBS-LRR蛋白，它们可能是CRb的候选基因(Kato等人,2013,Breeding Science 63:116)。
为了增加根肿病抗性栽培变种的持久性，不同根肿病抗性基因组合到单个品系中将是繁育对更宽范围生理小种具有抗性的栽培变种的重要手段。因此，为了使用标记辅助选择和转基因方案在无连锁累赘情况下堆叠基因，仍需要开发与根肿病抗性基因连锁的分子标记。本发明提供来自欧洲油菜(Brassica napus)抗性系的抗根肿病基因座的序列，如下文在不同实施方案、实施例和权利要求中所述。
发明简述
在一个方面，本发明提供一种能够赋予根肿病抗性的蛋白质，包含选自由以下氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列：a)SEQ ID NO:3的氨基酸序列和b)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。进一步提供了包含编码本发明蛋白质的核苷酸序列的分离的核酸分子，其选自由以下核酸序列组成的组：a)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列的核酸；b)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列；和c)与a)或b)的核酸具有互补序列的核酸。
本发明的另一个目的是提供一个重组基因，包含与编码本发明蛋白质的核酸序列有效连接的植物可表达启动子和任选地，转录终止及多聚腺苷酸化序列，优选地在植物中有功能的转录终止及多聚腺苷酸化区。在另一个目的中，所述核酸选自a)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列的核酸；b)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列；和c)与a)或b)的核酸具有互补序列的核酸。在另一个实施方案中，所述植物可表达启动子选自组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子。植物可表达启动子可以是CaMV35S启动子。
本发明进一步提供包含根据本发明的重组基因的植物或植物细胞和种子。所描述的植物可以是十字花科植物，其可以选自欧洲油菜(Brassica napus)、芥菜(Brassicajuncea)、甘蓝(Brassica oleracea)、芜青(Brassica rapa)、黑芥(Brassica nigra)和埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)组成的组，并且可以进一步包含至少一个选自由根肿病抗性基因、黑胫病抗性基因、抗核盘菌(Sclerotinia)基因、抗轮枝菌(Verticillium)条斑病基因、抗镰刀菌(Fusarium)萎蔫病基因、抗翠菊黄化支原体(Aster Yellows)基因、抗链格孢(Alternaria)基因和抗灰茎病基因组成的组的其他疾病的抗性基因。
本发明还提供一种获得抗根肿病十字花科植物的方法，所述方法包含a)向十字花科植物细胞引入或提供编码本发明蛋白质的抗根肿病基因，以产生十字花科细胞，和b)从所述细胞再生植物。所述十字花科植物可以选自由欧洲油菜(Brassica napus)、芥菜(Brassica juncea)、甘蓝(Brassica oleracea)、芜青(Brassica rapa)、黑芥(Brassicanigra)和埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)组成的组。在另一个实施方案中，通过向十字花科植物细胞提供或引入根据本发明的重组基因，向十字花科植物细胞引入或提供抗根肿病基因。仍然在另一个实施方案中，本发明提供获得抗根肿病十字花科植物的另一种方法，所述方法包括a)提供包含本发明抗根肿病序列的第一芸薹属植物；b)提供缺少本发明抗根肿病序列的第二芸薹属植物；c)将第一芸薹属植物与第二芸薹属植物杂交以提供后裔芸薹属植物；和d)选择对本发明抗根肿病序列的存在检验呈阳性的后裔芸薹属植物作为已经向其中引入本发明抗根肿病序列的芸薹属植物。
本发明的另一个目的是提供通过根据本发明的方法获得的十字花科植物。在另一个方面，十字花科植物包含本发明的抗根肿病序列和至少一个其他抗病性基因，所述其他抗病性基因选自由抗核盘菌(Sclerotinia)基因、抗轮枝菌(Verticillium)条斑病基因、抗镰刀菌(Fusarium)萎蔫病基因、抗翠菊黄化支原体(Aster Yellows)基因、抗链格孢(Alternaria)基因和抗灰茎病基因组成的组。这种十字花科植物可以是欧洲油菜。还提供这种十字花科植物的种子并且它们可以是杂交种子。采用这类杂交种子，其为欧洲油菜杂交种子并发育成植物，种子的固态成分，按每克晾干的无油固形物，可以含有小于30微摩尔的以下任一者或其任何混合物：3-丁烯基芥子油苷，4-戊烯基芥子油苷，3-羟基-3丁烯基芥子油苷和2-羟基-4-戊烯基芥子油苷。
其他实施方案公开了一种检测芸薹DNA样品中CRT抗根肿病基因座的试剂盒，其中所述试剂盒包含一个或多个能够扩增与CRT连锁的DNA标记的PCR引物对。公开的试剂盒可以包含两种识别CRT且不识别SEQ ID NOs:4、5、7或8的核苷酸序列的引物。
仍然另一个实施方案提供一种产生食品、饲料或工业产品的方法，包含获得根据本发明的植物或其部分并从这种植物或其部分制备食品、饲料或工业产品。在又一目的中，所述食品或饲料是油、饼粕、籽粒、淀粉、面粉或蛋白质；或所述工业产品是生物燃料、纤维、工业化学品、药物或营养制剂。
附图简述
图1.CRT基因(SEQ ID NO:2)与CRS基因(SEQ ID NO:5和8)的核苷酸序列比对结果。在CRT和至少一个CRS之间保守的核苷酸由星号指示。
图2.CRT蛋白(SEQ ID NO:3)与CRS蛋白(SEQ ID NO:6和9)的氨基酸序列比对结果。全部蛋白质中均保守的氨基酸残基由星号指示，在CRT和至少一个CRS之间保守的氨基酸置换由分号指示，在CRS之一中存在、但从CRT和其他CRS二者中缺失的氨基酸以虚线指示。SEQ ID NO:3中的TIR结构域由灰色阴影指示，NB-ARC结构域由框指示，并且LRR结构域由下划线指示。
图3.在60dpi(感染后天数)对的三个表达CRT的转基因系(事件)(A)及其各自的无效分离子(B)进行根肿病抗性测定的结果。
发明详述
本发明基于芸薹属(Brassica)中CRT抗根肿病基因的鉴定。
在一个方面，本发明提供一种能够赋予根肿病抗性(抗根肿病)的蛋白质，所述蛋白质包含选自由以下氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列：a)SEQ ID NO:3的氨基酸序列和b)与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。进一步提供了包含编码本发明蛋白质的核苷酸序列的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自由以下组成的组：a)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列的核酸；b)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列；和c)与a)或b)的核酸具有互补序列的核酸。
如本文所用的“根肿病”指由病原体芸薹根肿菌引起的疾病。
如本文所用的“根肿病抗性”指针对一个或多个芸薹根肿菌分离株的抗性，诸如，但不限于，针对对应于致病型5x的芸薹根肿菌菌株CR11或CR6的抗性(Yu等人,2017,SciRep 7:4516)。所述抗性指与对照植物上造成的损伤相比，根肿病感染引起的损伤减少。可以将损伤评定为例如根上形成棒形瘿、出现萎蔫、生长迟缓、黄化、早衰等等。特别地，损伤减少表现为，当植物在田间疾病压力下培育时，与对照植物相比，产量损失减少。这种产量损失减少可以例如归因于以下事实：具有增强的抗性的植物中减少或阻止了病原的感染、繁殖、扩散或存活。所述抗性还可以指有完全抗性的植物，即，其上未发现疾病症状的植物。
可以使用0至3的标度，评估根肿病抗性：0：无棒状，1：<25％的根系呈棒状；2：25至50％的根系呈棒状；3：>50％的根系呈棒状(Humpherson-Jones,1989,Tests Agro Cult10:36)。可以使用以下等式计算疾病指数(ID)：
[(#类0中的植物*0)+([(#类1中的植物*1)+(#类2中的植物*2)+(#类3中的植物*3)]/总植物数*3
(Strelkov等人,2006,Can J Plant Pathol 28:467)。
可以理解，环境条件，诸如位置、天气状况和疾病压力，以及评估疾病症状的人的个体感知，可能影响根肿病抗性评定。因此，对比试验中这些因素的变异应当最小化。可以依照本发明应用本领域已知的任何其他抗性等级以将本发明的植物与对照植物比较。
如本文所用，“能够赋予根肿病抗性的蛋白质”和编码能够赋予根肿病抗性的蛋白质的基因分别是赋予芸薹根肿菌菌株抗性的蛋白质和基因。CRT抗性基因例如存在于欧洲油菜栽培变种Tosca中。“CRT抗根肿病基因”、“CRT抗性基因”或“CRT基因”可以足够抵抗对应于如Yu等人,2017,Sci.Rep 7:4516所描述的致病型5x的芸薹根肿菌菌株CR11或CR6。也可能需要“CRT抗根肿病基因”或“CRT基因”连同另一个CRT抗根肿病抗性基因，以抵抗对应于致病型5x的芸薹根肿菌菌株CR11或CR6。
CRT抗根肿病基因或CRT基因可以编码与SEQ ID NO:3具有至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性且包含下文所述保守结构域的CRT氨基酸序列。CRT抗根肿病基因或CRT基因可以包含编码与SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:2具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少92％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的核苷酸序列并且包含编码下文所述保守结构域的核苷酸序列。
出于本发明目的，两个相关核苷酸序列或氨基酸序列的“序列同一性”(表述为百分数)指两个最佳比对的序列中具有相同残基的位置的数目(x 100)除以比较的位置的数目。空位(即，比对结果中这样的位置，其中一个残基存在于一个序列中，但不存在于另一个序列中)视为具有不相同残基的位置。根据欧洲分子生物学开放软件包(The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite)(EMBOSS,Rice等人,2000,Trends inGenetics 16(6):276-277；例如参见http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)中的Needleman和Wunsch全局比对算法(Needleman和Wunsch,1970,J Mol Biol 48(3):443-53)，使用默认设置(空位开放罚分＝10(用于核苷酸)/10(用于蛋白质)和空位延伸罚分＝0.5(用于核苷酸)/0.5(用于蛋白质))，通过在整个长度范围内比对两个序列，找到这两个序列的“最佳比对”。对于核苷酸，所用的默认计分矩阵是EDNAFULL，并且用于蛋白质的默认计分矩阵是EBLOSUM62。应当清楚，每逢RNA分子的核苷酸序列通过参照相应DNA分子的核苷酸序列定义时，该核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)都应当被替换为尿嘧啶(U)。是否指DNA分子或RNA分子将从本申请的上下文中显而易见。
根据本发明的CRT蛋白包含保守的Toll-白介素受体结构域(TIR-结构域，从SEQID NO:3的氨基酸位置15至氨基酸位置149)、NB-ARC结构域(SEQ ID NO:3上从氨基酸位置190至氨基酸位置453；van der Biezen和Jones,1998,Current Biology,Vol 8,7:R226-R228)，和具有一个或多个LRR基序(xxLxLxx)的LRR结构域(富亮氨酸重复序列)(从SEQ IDNO:3的氨基酸位置612至氨基酸位置867)。
图1中显示本发明CRT蛋白中的保守结构域。
另外，很清楚，其中已经缺失、取代或插入一个或多个氨基酸残基的CRT蛋白的变体，，也可以在根据本发明的方法中以相同效果使用，条件是CRT结构域未受氨基酸缺失、置换或插入影响。这些变体CRT蛋白可以与本文中提到CRT蛋白的任一者具有约95％序列同一性。
置换的实例是保守性置换，即一个氨基酸由具有相似物理化学属性的另一者置换。已知这些置换不影响蛋白质的结构。通过将一个氨基酸替换为属于如下相同组的另一个氨基酸，实现这类置换：
组1：半胱氨酸(C)；
组2：苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)；
组3：组氨酸(H)、赖氨酸(K)和精氨酸(R)；
组4：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；
组5：异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)；
组6：丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。
如本文所用的“分离的核酸”或“分离的DNA”指不在其天然基因组背景下出现的DNA，无论其长度和序列是什么。分离的DNA可以例如指与其基因组背景物理分离的DNA，如基因组DNA的片段。分离的DNA也可以是人工产生的DNA，如化学合成的DNA，或如经由扩增反应(如本领域公知的聚合酶链反应(PCR))产生的DNA。分离的DNA还可以指在其不天然存在其中的DNA背景中存在的DNA。例如，分离DNA可以指质粒中存在的一段DNA。另外，分离的DNA可以指另一个与它天然存在的背景相异的染色体背景下(诸如例如在基因组中异于天然位置的另一个位置、在另一个与它天然存在的物种相异的物种的基因组中或在人工染色体中)存在的一段DNA。
本发明的另一个目的是提供一个重组基因，包含可操作地连接到编码本发明蛋白质的核酸序列的植物可表达启动子，编码本发明蛋白质的核酸序列和任选地，转录终止及多聚腺苷酸化序列，优选地在植物中有功能的转录终止及多聚腺苷酸化区。在另一个目的中，所述核酸选自由以下组成的组：a)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列的核酸；b)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列；和c)与a)或b)的核酸具有互补序列的核酸。在另一个实施方案中，所述植物可表达启动子选自由组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子组成的组。植物可表达启动子可以是CaMV35S启动子。
如本文所用，“重组基因”指植物物种中通常不出现的核酸构建体。重组核酸构建体可以是DNA或RNA。“重组DNA构建体”和“重组基因”可互换地使用，以指示这样的基因，其中启动子或一个或多个其他基因调节区在自然界中不与部分或全部转录DNA区域关联，或存在于不天然存在于其中的植物基因组的基因座中的基因。
短语“可操作地连接”指两个或更多个核酸区域或核酸序列的功能性空间排列。例如，启动子区可以相对于核酸序列如此安置，从而核酸序列的转录受启动子区指导。从而，启动子区“可操作地连接于”核酸序列。“功能性连接”是等同术语。
如本文中所用，术语“植物可表达启动子”意指能够在植物细胞中控制(启动)转录的DNA序列。这包括植物来源的任何启动子，还包括能够在植物细胞中指导转录的任何非植物源启动子，即，某些病毒或细菌来源启动子，诸如CaMV35S(Harpster等人(1988)Mol GenGenet.212(1):182-90，地三叶病毒启动子No 4或No 7(WO9606932)或T-DNA基因启动子，还包括组织特异性或器官特异性启动子，包括但不限于种子特异性启动子(例如，WO89/03887)、器官原基特异性定启动子(An等人(1996)Plant Cell 8(1):15-30)、茎特异性启动子(Keller等人(1988)EMBO J.7(12):3625-3633)、叶特异性启动子(Hudspeth等人(1989)Plant Mol Biol.12:579-589)、叶肉特异性启动子(如光诱导型核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子)、根特异性启动子(Keller等人(1989)Genes Dev.3:1639-1646)、块茎特异性启动子(Keil等人(1989)EMBO J.8(5):1323-1330)、维管组织特异性启动子(Peleman等人(1989)Gene 84:359-369)、雄蕊选择性启动子(WO 89/10396、WO 92/13956)、开裂区特异性启动子(WO 97/13865)等。
合适用于本发明的合适的启动子是组成型植物可表达启动子。组成型植物可表达启动子是本领域公知的并且包括CaMV35S启动子(Harpster等人(1988)Mol Gen Genet.212(1):182-90)、肌动蛋白启动子，诸如，例如，来自稻肌动蛋白基因的启动子(McElroy等人,1990,Plant Cell 2:163)、木薯脉花叶病毒启动子(Verdaguer等人,1996PlantMol.Biol.31:1129)、GOS启动子(de Pater等人,1992,Plant J.2:837)、组蛋白H3启动子(Chaubet等人1986,Plant Mol Biol 6:253)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合酶(Nos)启动子(Depicker等人,1982,J.Mol.Appl.Genet.1:561)，或泛素启动子，诸如，例如，玉米泛素1基因的启动子(Christensen等人,1992,Plant Mol.Biol.18:675)。
适于本发明的又一启动子是驱动编码CRT蛋白的基因表达的内源启动子。
如本文所用的“转录终止和多聚腺苷酸化区”是驱动新生RNA的切割的序列，此后在所产生的RNA 3’末端添加植物细胞中有功能的多聚(A)尾。植物细胞中有功能的转录终止和多聚腺苷酸化信号包括但不限于3’nos、3’35S、3’his和3’g7。
本发明进一步提供包含根据本发明的重组基因的植物或植物细胞和种子。本发明还提供包含异源CRT基因的植物或植物细胞和种子，该异源CRT基因编码本发明的蛋白质，但不包含SEQ ID NOs:11和12的序列中至少一者。所描述的植物可以是可以是十字花科植物，并且可以进一步包含至少一个选自由根肿病抗性基因、黑胫病抗性基因、抗核盘菌基因、抗轮枝菌基因、抗镰刀菌萎蔫病基因、抗翠菊黄化支原体基因、抗链格孢基因和抗灰茎病基因组成的组的其他抗病性基因。
如本文所用的“十字花科”或“十字花科植物”，指属于十字花科(也称作十字花科(Cruciferae)或芥菜科)的植物。十字花科植物的实例为，但不是限于，芸薹属物种(Brassica sp.)，如欧洲油菜、甘蓝、芜青、埃塞俄比亚芥、黑芥和芥菜；萝卜属(Raphanus)物种，如鼠尾萝卜(Raphanus caudatus)、野萝卜(Raphanus raphanistrum)和萝卜(Raphanus sativus)；紫罗兰属(Matthiola)物种；桂竹香属(Cheiranthus)物种；亚麻荠属(Camelina)物种，如亚麻荠(Camelina sativa)；两节荠属(Crambe)物种，如深海两节荠(Crambe abyssinica)和西班牙两节荠(Crambe hispanica)；芝麻菜属(Eruca)物种，如芝麻菜(Eruca vesicaria)；白芥属(Sinapis)物种如白芥(Sinapis alba)；二行芥属(Diplotaxis)物种；独行菜属(Lepidium)物种；豆瓣菜属(Nasturtium)物种；诸葛菜属(Orychophragmus)物种；辣根属(Armoracia)物种、山萮菜属(Eutrema)物种；独行菜属(Lepidium)物种；和拟南芥属物种。
“芸薹属植物”指异源四倍体或双二倍体欧洲油菜(AACC，2n＝38)、芥菜(AABB，2n＝36)、埃塞俄比亚芥(BBCC，2n＝34)，或指二倍体芜青(同义词：菜心(B.campestris))(AA，2n＝20)、甘蓝(CC，2n＝18)或黑芥(BB，2n＝16)。
本发明还提供一种获得抗根肿病十字花科植物的方法，所述方法包含a)向十字花科植物细胞引入或提供编码根据本发明的蛋白质的抗根肿病基因，以产生十字花科细胞，和b)从所述细胞再生植物。所述十字花科植物可以选自欧洲油菜、芥菜、甘蓝、芜青、黑芥和埃塞俄比亚芥组成的组。在另一个实施方案中，通过向十字花科植物提供或引入细胞根据本发明的重组基因，向十字花科植物细胞引入或提供抗根肿病基因。仍然在另一个实施方案中，向十字花科植物细胞引入或提供抗根肿病基因，通过a)提供包含根据本发明的抗根肿病序列的第一芸薹属植物；b)提供缺少根据本发明的抗根肿病序列的第二芸薹属植物；c)将第一芸薹属植物与第二芸薹属植物杂交以提供后裔芸薹属植物；以及d)选择对本发明抗根肿病序列的存在检验呈阳性的后裔芸薹属植物作为已经向其中引入本发明抗根肿病序列的芸薹属植物。
可以使用本领域公知的方法向植物或植物细胞提供转基因。向植物细胞中引入基因以产生转基因植物的方法对本发明不被认为是关键的，并且可以使用向植物细胞提供适于特定植物物种的转基因的任何方法。此类方法是本领域公知的并且包括农杆菌介导的转化法、粒子枪递送法、微量注射法、完好细胞的电穿孔法、聚乙二醇介导的原生质体转化法、原生质体的电穿孔法、脂质体介导的转化法、硅晶须介导的转化法等。所述转基因可以稳定整合入所述植物细胞的基因组，产生转化的植物细胞。以这种方式获得的转化植物细胞随后可以再生成成熟能育的转化植物。
如本文所用，“分子标记”或“标记”指多态性基因座，即多态性核苷酸(所谓的单核苷酸多态性或SNP)或多态性DNA序列(其可以是特定DNA序列在某个特定基因座处的插入或缺失，或多态性DNA序列)。标记指在基因组中具有固定位置的可测量遗传特征，其通常以孟德尔方式遗传并且可以用于对目的性状作图。因而，分子标记可以是短DNA序列，诸如围绕单个碱基对即单核苷酸多态性或SNP的序列，或是长DNA序列，诸如微卫星或简单序列重复(SSR)。标记的本质取决于所用的分子分析法并可以在DNA、RNA或蛋白质水平检测。可以使用分子标记，诸如但不限于RFLP(限制性片段长度多态性；Botstein等人(1980),Am J HumGenet 32:314-331；Tanksley等人(1989),Bio/Technology7:257-263)、RAPD[随机扩增的多态性DNA；Williams等人(1990),NAR18:6531-6535],AFLP[扩增片段长度多态性；Vos等人(1995)NAR23:4407-4414]、SSR或微卫星[Tautz等人(1989),NAR 17:6463-6471]进行遗传作图。适宜的引物或探针由所用作图方法决定。
术语
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是KeyGene N.V.(Wageningen，荷兰)的注册商标)、“AFLP分析”和“AFLP标记”根据标准术语学使用[Vos等人(1995),NAR 23:4407-4414；EP0534858；http://www.keygene.com/keygene/techs-apps/]。简而言之，AFLP分析是通过PCR扩增方式检测多个DNA限制性片段的DNA指纹技术。AFLP技术通常包括以下步骤：(i)用两种限制酶、优选六碱基切割酶和四碱基切割酶如EcoRI、PstI和MseI限制性消化DNA；(ii)将双链接头诸如EcoRI、PstI和MseI接头连接至限制性片段的末端；(iii)使用互补于所述接头和限制位点序列的两条引物扩增所述限制性片段的子集并通过一至三个“选择性”核苷酸在其3’末端延伸，即，通过使用延伸入限制性片段的引物实现选择性扩增，仅扩增那些其中引物延伸匹配限制性位点侧翼核苷酸的片段。AFLP引物因而具有特定序列并且每条AFLP引物具有专门代码(引物代码及其序列可以在Keygene网站：http://www.keygene.com/keygene/pdf/PRIMERCO.pdf找到；所述文献通过引用方式并入本文)；(iv)扩增的限制性片段在变性凝胶板或毛细管上进行凝胶电泳；(v)借助放射自显影、磷成像术或其他方法可视化DNA指纹。使用这种方法，可以在不知道核苷酸序列的情况下通过PCR可视化限制性片段集合。如本文中所用，AFLP标记是具有特定大小的DNA片段，其通过实施AFLP分析生成并在凝胶上作为条带可视化。每个AFLP标记通过用来扩增该标记的引物组合而特指，后附所扩增DNA片段的近似大小(以碱基对计)。可以理解这些片段的大小可以根据实验室条件和所用设备略微变动。本文中每次通过提到引物组合和片段的具体大小提到AFLP标记时，应理解这种大小是近似的并且包含或意在包括不同实验室中观察到的轻微变动。每个AFLP标记代表基因组中的某个基因座。
术语“SSR”指简单序列重复或微卫星[Tautz等人(1989),NAR17:6463-6471]。短的简单序列段作为高度重复性元件出现于全部真核基因组中。简单序列基因座通常显示广泛的长度多态性。这些简单序列长度多态性(SSLP)可以通过聚合酶链反应(PCR)分析法检出并用于真伪检验、群体研究、连锁分析和基因组作图。
可以理解分子标记可以转换成其他类型的分子标记。当本发明中谈到特定分子标记时，可以理解，该定义包括用于检测最初通过该特定分子标记鉴定的遗传变异的其他类型分子标记。例如，如果使用已知方法将AFLP标记转换成另一种分子标记，则这种其他标记纳入本定义。例如，使用如Meksem等人[(2001),Mol Gen Genomics 265(2):207-214]、Negi等人[(2000),TAG101:146-152]、Barret等人(1989),TAG 97:828-833]、Xu等人[(2001),Genome44(1):63-70]、Dussel等人[(2002),TAG 105:1190-1195]或Guo等人[(2003),TAG103:1011-1017]中所述的标准技术，AFLP标记可以转换成序列特异性标记，诸如，但不限于STS(测序-标记-位点)或SCAR(序列-表征-扩增-区域)标记。例如,Dussel等人[(2002),TAG105:1190-1195]将与抗性连锁的AFLP标记转换成基于PCR的序列加标签的位点标记诸如indel(插入/缺失)标记和CAPS(切割的扩增的多态性序列)标记。
合适的分子标记例如是SNP标记(单核苷酸多态性)、AFLP标记、微卫星、小卫星、随机扩增多态性DNA(RAPD)标记、RFLP标记、序列表征的扩增区域(SCAR)标记，和其他标记，诸如Hu等人,2007,Genet Resour Crop Evol 54:1667-1674)描述的TRAP标记。
用于标记检测或用于分析基因组DNA的标记存在情况的方法和测定法是本领域广泛知晓的。可以例如在使用Taqman的基于杂交的方法(例如，等位基因特异性杂交)、基于PCR的方法、基于寡核苷酸基于的方法或基于测序的方法中检出标记的存在情况。
检测SNP标记的可用测定法例如是KBioscience竞争性Allele-特异性PCR。为了开发KASP-测定法，选择SNP上游的70个碱基对和其下游的70个碱基对下游并且设计两个等位基因特异性正向引物和一个等位基因特异性反向引物。参见，例如Allen等人,2011,PlantBiotechnology J.9,1086-1099，尤其KASP测定法第1097-第1098页(所述文献通过引用方式并入本文)。
如本文所用的“与CRT抗根肿病基因连锁的分子标记”，或“与CRT抗根肿病基因的存在连锁的分子标记”指基因组的区域中在至少50％情况下作为单一遗传单位随CRT抗根肿病基因一起继承的分子标记。因此，在这个方面，术语连锁可以是约50cM、或更小诸如约40cM、约30cM、约20cM、约10cM、约7.5cM、约6cM、约5cM、约4cM、约3cM、约2.5cM、约2cM或甚至更小的分离。所述“与CRT抗根肿病基因连锁的分子标记”因此是与CRT抗根肿病基因连锁的标记。所述标记可以基于CRT抗根肿病基因本身，如CRT抗根肿病基因的存在或不存在。
合适的是，可以使用本领域已知的方法开发与CRT抗根肿病基因连锁的标记。可以基于CRT序列开发适于本发明的新标记。可以理解，可以通过以下方式开发这类标记：比较来自十字花科抗性系的CRT抗根肿病基因的序列与自十字花科易感系中相同基因的序列；鉴定相应的十字花科易感系基因中不出现的CRT抗根肿病基因中特定序列区域。与CRT抗根肿病基因连锁的分子标记因此可以是检测CRT抗根肿病基因存在情况的标记，或可以是直接检测SEQ ID NOs:1或2的序列存在情况的标记。与CRT抗根肿病基因连锁的分子标记也可以是在侧置于CRT抗根肿病基因的序列中的标记，所述标记在包含CRT抗根肿病基因的株系和缺少CRT抗根肿病基因的株系之间有多态性，但在至少50％情况下作为单一遗传单位随CRT抗根肿病基因一起继承。
可以通过不存在与CRT抗根肿病基因存在连锁的标记等位基因(CRT根肿病抗性标记等位基因)，确定CRT抗根肿病基因不存在。另外，合适确定CRT抗根肿病基因不存在的标记可以是与CRS根肿病易感性基因连锁的标记等位基因。
可以用第一引物和第二引物和任选地用探针分析根据本发明的标记的存在，选自由根据本发明CRT根肿病抗性基因的15至30个核苷酸、或15至25个核苷酸、或18至22个核苷酸的序列组成的第一引物，与根据本发明CRT根肿病抗性基因的15至30个核苷酸、或15至25个核苷酸或18至22个核苷酸的序列互补的第二引物，并且其中CRT抗根肿病基因上所述第一和所述第二引物之间的距离介于1和400个碱基之间、或1和150个碱基之间，并且其中相对于CRT编码性序列，第一引物位于所述第二引物上游，以及与在所述第一和所述第二引物之间的CRT根肿病抗性基因序列的至少15个核苷酸，或至少18个核苷酸，但不多于25个核苷酸，或不多于22个核苷酸相同的探针，条件是第一引物的序列或第二引物的序列或所述探针的序列不存在于十字花科易感植物相应基因座中。所述探针可以是标记过的，诸如例如在美国专利5,538,848中描述的。
可以用识别CRT序列和十字花科易感株系中相应基因的如上文所述的第一和第二引物、识别如上文所述的CRT抗根肿病基因序列、但不识别十字花科易感株系中所述第一引物和所述第二引物之间序列的第一探针以及识别十字花科易感株系中所述第一引物和所述第二引物之间序列、但不识别CRT抗根肿病基因序列的第二探针，分析根据本发明的标记的存在，并且其中第一探针的所述标签物异于第二探针的标签。
分析根据本发明的标记的存在情况的其他合适引物是如上文所述的识别CRT序列和十字花科易感株系中相应基因二者的第一引物的标记、识别CRT序列但不识别十字花科易感株系中相应基因的第二引物和识别十字花科易感株系中相应基因座但不识别CRT序列的第三引物。所述第二和第三引物可以如上文所示那样标记，并且所述第二引物可以含有异于所述第三引物的标签。
可以例如通过以下方式鉴定对CRT根肿病抗性基因特异和对十字花科易感株系中相应基因特异的PCR产物：凝胶电泳或毛细管电泳后估计大小(例如，对于包含许多插入或缺失的核苷酸的CRT抗根肿病基因和十字花科易感株系中相应基因，其导致从CRT抗根肿病基因和对十字花科易感植物中相应基因扩增的片段之间的大小的差异，从而所述片段可以在凝胶上肉眼可见地分开)；凝胶电泳或毛细管电泳后评估这两个不同片段的存在或不存在，因而CRT抗根肿病基因的诊断性PCR扩增可以任选地与易感株系中相应基因的诊断性PCR扩增无关地进行；对扩增的片段直接测序；或基于荧光的检测方法。
与本申请有关的“引入”或“提供”可以涉及通过人工手段将遗传信息置于植物细胞或植物中。这可以通过本领域已知的向植物细胞、组织、原生质体或完整植株引入RNA或DNA的任何方法实现。
本发明的另一个目的是提供通过本发明方法获得的十字花科植物。在另一个方面，十字花科植物包含本发明的抗根肿病序列和至少一个其他抗病性基因，所述其他抗病性基因选自由根肿病抗性基因、黑胫病抗性基因、抗核盘菌基因、抗轮枝菌基因、抗镰刀菌基因、抗翠菊黄化支原体基因、抗链格孢基因和抗灰茎病基因组成的组。这种十字花科植物可以是欧洲油菜。还提供这种十字花科植物的种子并且它们可以是杂交种子。采用这类杂交种子，其为欧洲油菜杂交种子并发育成植物，种子的固态成分，按每克晾干的无油固形物，可以含有小于30微摩尔的以下任一者或其任何混合物：3-丁烯基芥子油苷，4-戊烯基芥子油苷，3-羟基-3丁烯基芥子油苷和2-羟基-4-戊烯基芥子油苷。
所述抗根肿病基因可以是Crr2、Crr4、Crr3、CRk、CRc、CR2a、CR2b、pb-3、pb-4、Pb-Bo1、Pb-Bo2、Pb-Bo3、Pb-Bo4、Pb-Bo5a、Pb-Bo5b、Pb-Bo8、Pb-Bo9a、Pb-Bo9b、Pb-Bn1、PbBn-01:60-1、PbBn-01:60-2、PbBn-01:60-3、PbBn-01:60-4、PbBn-01:07-1、PbBn-01:07-2、PbBn-01:07-3、PbBn-e4x04-1、PbBn-a-1、PbBn-l-1、PbBn-l-2、PbBn-k-1、PbBn-k-2、PbBn-k-3、PbBn-Korp-1、PbBn-Korp-2、PbBn-Korp-3、PbBn-Korp-4、PbBn-Korp-5，如上文Piao等人,2009所描述的，或可以是如上文Ueno等人,2012所描述的CRa基因、如上文Hatakeyama等人,2013及在WO2012/039445中所描述的Crr1基因，或如上文Kato等人,2013所描述的CRb基因、如WO2017/102923中所述CRL基因。
所述黑胫病抗性基因可以例如是BLMR1和BLMR2(WO2011/044694)、LepR3(Larkan等人,2013,New Phytol 197:595和WO2008/101343)或Lem-08-syl(EP 1547462和US 2005/0142122)。所述抗核盘菌基因可以是如WO 2005/090578中所述的抗核盘菌基因。
所述其他抗病性基因可以存在于其天生染色体位置中。例如，可以在本发明植物中通过渗入从栽培变种或衍生它们的物种引入所述其他抗病性基因。
抗根肿病的植物指当根肿病病原体天然感染时按零分或一分评估的植物，或指当根肿病病原体天然感染时按零分、一分或两分评估的植物。抗根肿病群体是疾病指数(ID)小于30％的群体。根肿病抗性增加的植物是这样的植物，其中呈棒状的根系的百分数降低至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少70％、或至少95％或100％，即无棒状，或指这样的植物群体，其中疾病指数降低至少3％、或至少5％、或至少8％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少70％、或至少95％或100％，即该群体的全部植物均划分为类0(无棒状)。
可以通过使两个近交亲本系杂交，产生本发明植物的杂交种子，其中近交亲本系中至少之一包含根据本发明的CRT根肿病抗性基因。为了产生纯杂交种子，亲本系之一是雄性不育的并且用另一系的花粉授粉。通过成行培育亲本系并仅收获雄性不育亲本的F1种子，产生纯杂交种子。可以使用如EP0,344,029或US 6,509,516中所述的系统以产生雄性不育亲本系，其中编码植物毒性蛋白(barnase)的基因在绒毡层特异性启动子如TA29控制下表达，确保选择性破坏绒毡层细胞。用嵌合基因pTA29:barnase转化植物产生了其中完全阻止花粉形成过程的植物[Mariani等人,(1990),Nature 347:737-741]。De Block和DeBrouwer[(1993),Planta 189:218-225]描述了包含嵌合pTA29-barnase基因的欧洲油菜植物的花药发育过程的细胞化学和组织化学分析。为了恢复雄性不育植物的后裔中能育性，将雄性不育植物(MS亲本)与携带能育性恢复基因的转基因植物(RF亲本)杂交，所述能育性恢复基因在表达时能够抑制或阻止雄性不育基因的活性[美国专利号5,689,041；5,792,929；De Block和De Brouwer，上文]。WO96/26283中描述了共调节基因在产生雄性不育植物中用来增加具有良好农艺学性能的转化体的频率的用途。通常，当不育性DNA编码barnase时，共调节性DNA将编码barstar，优选地使用优化的barstar基因，如公开的PCT专利申请WO98/10081中描述。可以理解，不同启动子可以用来驱动barnase表达，旨在使得植物雄性不育。同样，barstar可以可操作地连接于不同的启动子，如来自花椰菜花叶病毒的35S。
也可以使用其他技术生成雄性不育植物，如胞质雄性不育/恢复系统[例如Ogura系统，已公开美国专利申请20020032916、US 6,229,072、WO97/02737、US 5,789,566或US6,365,798、WO98/54340的Polima系统、或WO95/09910的Kosena系统、US 5,644,066]。
MS亲本或RF亲本或二者均可以包含根据本发明的CRT根肿病抗性基因。可以通过使用已知方法向欧洲油菜纯系引入CRT根肿病抗性基因并且随后用pTA29-barnase或用pNOS-barstar转化这个株系来实现这点。或者，可以通过使包含CRT根肿病抗性基因的植物与MS亲本或RF亲本杂交，或通过转化MS亲本或RF亲本，将CRT根肿病抗性基因直接引入转基因MS或RF亲本系。从MS和RF亲本之间杂交产生的F1杂交种子将随后含有CRT根肿病抗性基因。
其他实施方案公开了一种检测芸薹DNA样品中CRT抗根肿病基因座的试剂盒，其中所述试剂盒包含一个或多个能够扩增与CRT连锁的DNA标记的PCR引物对。公开的试剂盒可以包含两种识别CRT且不识别SEQ ID NOs:4、5、7或8的核苷酸序列的引物。
如本文中所用，“试剂盒”指一组试剂，所述试剂的目的在于实施本发明的方法，更具体地在于鉴定生物样品中的CRT根肿病抗性基因或确定包含CRT根肿病抗性基因的植物材料的接合性状态。更具体地，本发明试剂盒的优选实施方案包含用于鉴定CRT根肿病抗性基因的至少两种特异性引物或用于确定接合性状态的至少两种或三种特异性引物。任选地，试剂盒还可以包含任何其他试剂。或者，根据本发明的另一个实施方案，该试剂盒可以包含与生物样品的核酸特异性杂交以鉴定其中CRT根肿病抗性基因存在情况的至少一种特异性探针，或用于确定接合性状态的至少两种或三种特异性探针。任选地，该试剂盒还可以包含使用所述特异性探针鉴定生物样品中CRT根肿病抗性基因的任何其他试剂(如但不限于杂交缓冲液、标记物)。
本发明的试剂盒可以用于以下目的，并且其组分可以针对以下目的专门调整：质量控制(例如，种子批的纯度)、检测CRT抗根肿病基因在植物材料或者包含或衍生自植物材料的材料(如但不限于食品或饲料产品)中的存在或不存在。可以通过使用特异性结合CRT基因和十字花科易感株系中相应基因的备选性引物和/或探针集合，确定CRT抗根肿病基因的接合性状态。
如本文中所用的术语“引物”包括能够在模板依赖的过程如PCR中引发新生核酸合成的任意核酸。一般而言，引物是具有10个至30个核苷酸的寡核苷酸，但是可以使用更长序列。引物可以按双链形式提供，不过优选单链形式。探针可以作为引物使用，不过将探针设计为与靶DNA或RNA结合并且不需要用于扩增过程中。
当谈及特异性引物时，如本文中所用的术语“识别”指以下事实：特异性引物在本发明方法中所述的条件(诸如PCR鉴定方案条件)下与特定核酸序列特异性杂交，其中特异性由阳性对照和阴性对照的存在决定。设计识别给定等位基因的特定核苷酸序列的引物是本领域中的标准。
仍然另一个实施方案提供一种产生食品、饲料或工业产品的方法，包含获得根据本发明的植物或其部分并从这种植物或其部分制备食品、饲料或工业产品。在又一目的中，所述食品或饲料是油、饼粕、籽粒、淀粉、面粉或蛋白质；或所述工业产品是生物燃料、纤维、工业化学品、药物或营养制剂。
进一步提供SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列或SEQ ID NO:3的氨基酸序列鉴定同源性根肿病抗性基因的用途。
可以使用本领域已知的方法，鉴定同源性根肿病抗性基因。可以使用包含SEQ IDNOs:1或2的核苷酸序列的核酸或其部分作为探针，通过严格条件下杂交鉴定和分离同源核苷酸序列。也可以使用对编码CRT的基因特异的寡核苷酸作为引物，如但不限于包含来自SEQ ID NOs:1或2的约20至约50个连续核苷酸或由其组成的寡核苷酸或其互补序列，通过DNA扩增获得其他编码CRT的序列。可以使用与其他核苷酸或氨基酸序列的基本局部比对搜索工具(BLAST)同源性检索，由计算机方式鉴定同源性根肿病抗性基因。可以使用本文所述的方法，如在非根肿病抗性的植物中转化植物可表达启动子控制下的抗根肿病基因，验证已鉴定同源性根肿病抗性基因的功能。
当两个核酸分子在适宜条件下彼此复性时，杂交出现。核酸杂交是DNA操作领域技术人员公知的技术。给定的核酸对的杂交特性是其相似性或同一性的指标。两个核酸序列基本上相同的另一个指标是这两个分子在严格条件下彼此杂交。短语“特异性杂交”指某分子在严格条件下仅与特定核苷酸序列结合、形成双链体或杂交，当该序列存在于复杂混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中。“基本上结合”指探针核酸和靶核酸之间的互补性杂交并且包括可以通过降低杂交介质的严格性而容许的少量错配以实现所需的对靶核酸序列的检测。在核酸杂交实验如DNA印迹和RNA印迹杂交的情况下，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下不同。高严格性洗涤条件的实例是在72℃时0.15M NaCI持续约15分钟。严格性洗涤条件实例是在65℃时0.2X SSC洗涤15分钟。经常地，高严格性洗涤之前是低严格性洗涤以移除背景探针信号。用于例如多于100个核苷酸的双链体的中等严格性洗涤实例是在45℃时1X SSC持续15分钟。用于例如多于100个核苷酸的双链体的低严格性洗涤实例是在40℃时4X至6X SSC持续15分钟。对于短探针(例如，约10个至50个核苷酸)，严格条件通常涉及在pH 7.0至8.3时小于约1.5M、更优选地约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)的盐浓度，并且温度一般是至少约30℃并且对于长探针(例如，>50个核苷酸)，是至少约60℃。也可以通过添加去稳定剂如甲酰胺实现严格性条件。通常，特定杂交分析中对不相关探针所观察的2X(或高于)信噪比表示检出特异性杂交。如果严格条件下彼此不杂交的核酸编码的蛋白质基本上相同，则核酸也基本上相同。例如，当使用遗传密码允许的最大密码子简并性产生核酸副本时，这种情况出现。对于特定探针，选择Tm等同于严格条件。用于DNA印迹法或RNA印迹法中的滤膜上杂交具有多于100个互补性残基的互补性核酸的严格杂交条件实例是50％甲酰胺，例如在37℃于50％甲酰胺、1M NaCI、1％SDS中杂交，并且在60℃至65℃于0.1X SSC中洗涤。示例性低严格性条件包括在37℃用30％至35％甲酰胺，1M NaCI，1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并且在50℃至55℃于1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCI/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性中等严格性条件包括在37℃于40％至45％甲酰胺，1.0M NaCI，1％SDS中杂交，并且在55℃至60℃于0.5X至1XSSC中洗涤。以下是可以用来克隆与本发明参考核苷酸序列基本上相同的直向同源核苷酸序列的成组杂交/洗涤条件的实例：某参考核苷酸序列优选地与该参考核苷酸序列在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，并在50℃于2X SSC、0.1％SDS中洗涤；更合乎需要地在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，并在50℃于1X SSC、0.1％SDS中洗涤；仍然更合乎需要地在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，同时在50℃于0.5X SSC、0.1％SDS中洗涤；甚至仍更合乎需要地在50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中杂交，同时在50℃于0.1X SSC、0.1％SDS中洗涤。
根据本发明的植物可以额外地含有赋予除草剂抗性的内源基因或转基因，如赋予草铵膦(glufosinate ammonium)(
Figure BDA0002682374190000241
或/>
Figure BDA0002682374190000242
)抗性的bar或pat基因[通过引用方式并入的EP 0 242 236和EP 0 242 246]；或者任何修饰的EPSPS基因，如来自玉米的2mEPSPS基因[通过引用方式并入的EP 0 508 909和EP 0 507 698]，或者赋予草甘膦/>
Figure BDA0002682374190000243
抗性的草甘膦乙酰转移酶、或草甘膦氧化还原酶，或者赋予溴苯腈耐受性的溴苯腈水解酶，或赋予针对磺酰脲类、咪唑啉酮类、磺酰氨基羰基三唑啉酮类、三唑并嘧啶类或嘧啶基(氧代/硫代)苯甲酸类的耐受性的任何修饰的AHAS基因，如目前作为
Figure BDA0002682374190000244
卡诺拉油菜销售的耐受咪唑啉酮的菜籽油菜突变体PM1和PM2。另外，本发明的植物可以另外含有赋予增加的含油量或改进的油组成的内源基因或转基因，如12:0ACP硫酯酶增加以获得高月桂酸酯，赋予授粉控制；诸如诸如在花药特异性启动子控制下的barnase以获得雄性不育，或在花药特异性启动子控制下的barstar以赋予雄性不育的恢复；或诸如Ogura胞质雄性不育和能育性的核恢复子。
本发明的植物和种子可以用化学化合物进一步处理，如选自以下列表的化学化合物：
除草剂：烯草酮(clethodim)、二氯吡啶酸(clopyralid)、氯甲草(diclofop)、胺苯磺隆(Ethametsulfuron)、吡氟禾草灵(fluazifop)、草铵膦(glufosinate)、草甘膦(glyphosate)、吡草胺(metazachlor)、喹草酸(quinmerac)、喹禾灵(quizalofop)、醌肟草(tepraloxydim)、氟乐灵(trifluralin)。
杀真菌剂/PGR：腈嘧菌酯(azoxystrobin)、N-[9-(二氯亚甲基)-1,2,3,4-四氢-1,4-亚甲基萘-5-基]-3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(苯并烯氟菌唑(benzovindiflupyr)、Benzodiflupyr)、联苯吡菌(bixafen)、啶酰菌胺(boscalid)、多菌灵(carbendazim)、萎锈灵(carboxin)、氯化矮壮素(Chlormequat-chloride)、盾壳霉(Coniothryrium minitans)、环唑醇(cyproconazole)、环丙嘧啶(cyprodinil)、噁醚唑(difenoconazole)、烯酰吗啉(dimethomorph)、醚菌胺(dimoxystrobin)、氧唑菌(epoxiconazole)、噁唑酮菌(famoxadone)、氟啶胺(fluazinam)、咯菌腈(fludioxonil)、氟吡菌胺(fluopicolide)、氟吡菌酰胺(Fluopyram)、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、喹唑菌酮(fluquinconazole)、氟硅唑(flusilazole)、Fluthianil、粉唑醇(flutriafol)、氟唑菌酰胺(Fluxapyroxad)、异丙定(iprodione)、吡唑萘菌胺(Isopyrazam)、精甲霜灵(Mefenoxam)、氯化缩节胺(Mepiquat-chloride)、甲霜灵(metalaxyl)、环戊唑菌(metconazole)、叉氨苯酰胺(metominostrobin)、多效唑(paclobutrazole)、戊苯吡菌胺(Penflufen)、戊苯吡菌胺(Penflufen)、啶氧菌酯(picoxystrobin)、丙氯灵(prochloraz)、丙硫菌唑(prothioconazole)、唑菌胺酯(pyraclostrobin)、氟唑环菌胺(Sedaxane)、戊唑醇(tebuconazole)、氟醚唑(tetraconazole)、甲基托布津(thiophanate-methyl)、塞仑，唑菌醇(triadimenol)、肟菌酯(trifloxystrobin)、坚强芽孢杆菌(bacillus firmus)、坚强芽孢杆菌(bacillus firmus)菌株我-1582、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株GB03、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株QST713、短小芽孢杆菌(Bacillus pumulis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumulis)菌株GB34。
杀虫剂：啶虫脒(Acetamiprid)、涕灭威(Aldicarb)、印楝素(Azadirachtin)、克百威(carbofuran)、氯虫苯甲酰胺(Chlorantraniliprole)(Rynaxypyr)、可尼丁(clothianidin)、氰虫酰胺(Cyantraniliprole)(Cyazypyr)、(β-)氟氯氰菊酯((beta-)Cyfluthrin)、γ-氯氟氰菊酯(γ-Cyhalothrin)、λ-氟氯氰菊酯(λ-Cyhalothrin)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、乐果(Dimethoate)、呋虫胺(Dinetofuran)、乙虫腈(Ethiprole)、氟啶虫酰胺(Flonicamid)、氟虫双酰胺(Flubendiamide)、氟噻虫砜(Fluensulfone)、氟吡菌酰胺(Fluopyram)、Flupyradifurone、氟胺氰菊酯(tau-fluvalinate)、Imicyafos、吡虫啉(imidacloprid)、氰氟虫腙(Metaflumizone)、甲硫威(Methiocarb)、吡蚜酮(Pymetrozine)、吡氟喹腙(Pyrifluquinazon)、乙基多杀菌素(Spinetoram)、艾克敌(Spinosad)、螺虫乙酯(Spirotetramate)、氟啶虫胺腈(Sulfoxaflor)、噻虫啉(Thiacloprid)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-曱基-6-(甲基氨甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-1H-四唑-1-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-{2-氟-4-甲基-5-[(2,2,2-三氟乙基)亚磺酰]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1,2,4-三唑-5-胺、(1E)-N-[(6-氯吡啶-3-基)甲基]-N'-氰基-N-(2,2-二氟乙基)乙亚胺酰胺(ethanimidamide)、坚强芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌菌株I-1582、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌菌株GB03、枯草芽孢杆菌菌株QST713、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)F52。
除非另外说明，否则无论何时提到本发明的“植物”或“多个植物”时，应当理解，本文还涵盖植物部分(细胞、组织或器官、种荚、种子、分开的部分如根、叶、花、花粉等)，植物的仍保留亲本区别特征(尤其果实开裂特性)的子代，诸如通过自交或杂交获得的种子，例如(通过使两个近交亲本系杂交所获得的)杂交种子、杂交植物和从中衍生的植物部分。
在一些实施方案中，本发明的植物细胞，即包含CRT抗根肿病基因的植物细胞，以及根据本发明的方法产生的植物细胞，可以是非繁殖性细胞。
获得的本发明植物可以在常规育种方案中用来产生具有相同特征的更多植物，或用来在相同或相关植物物种的其它品种中或在杂交植物中引入存在本发明CRT基因的特征。获得的植物还可以用于产生繁殖材料。本发明的植物还可以用来产生通过本发明方法获得的植物的配子、种子(包括碾碎的种子和种籽饼)、种子油、合子胚或体细胞胚、子代或杂交体。本发明还涵盖从本发明植物获得的种子。
如本文所用，“产生繁殖材料”指本领域已知的产生其他植物、植物部分或种子的任何手段并且尤其包括营养性繁殖方法(例如空中压条法或地面压条法、分株、嫁(芽)接、微繁殖，匍匐茎或长匐茎、贮藏器官如鳞茎、球茎、块茎和根状茎、扎根(striking)或插条、双鳞片)、有性繁殖(与另一株植物杂交)和无性繁殖(例如无融合生殖、体细胞杂交)。
如本文所用，“包含”应解释为特指存在如所提到的特征、整数、步骤或组分，但是不排除存在或附加一种或多种特征、整数、步骤或组分或它们的群组。因此，例如，包含一个核苷酸序列或氨基酸序列的核酸或蛋白质可以包含比实际所引述更多的核苷酸或氨基酸，即，包含于更大的核酸或蛋白质中。包含以结构方式或功能方式定义的核酸的嵌合基因可以包含额外的DNA区域等。
在74千字节(大小如Microsoft
Figure BDA0002682374190000271
中所测定)的命名为“BCS18-2008_ST25.txt”的文件中所含的序列表含有12个序列，SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12，在此通过电子提交方式一并提交并通过引用方式并入本文。
在说明书和实施例中，参考以下序列：
序列
SEQ ID No.1：CRT编码序列的核苷酸序列。
SEQ ID No.2：CRT基因组序列的核苷酸序列。
SEQ ID No.3：CRT蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID No.4：CRS1编码序列的核苷酸序列。
SEQ ID No.5：CRS1基因组序列的核苷酸序列。
SEQ ID No.6：CRS1蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID No.7：CRS2编码序列的核苷酸序列。
SEQ ID No.8：CRS2基因组序列的核苷酸序列。
SEQ ID No.9：CRS2蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID No.10：T-DNA 35S::CRT的核苷酸序列。
SEQ ID No.11：与Tosca变种中根肿病抗性相关的SNP标记基因座。
SEQ ID No.12：与Tosca变种中根肿病抗性相关的第二SNP标记基因座。
实施例
除非实施例中另外说明，否则全部重组DNA技术均按照Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆实验手册),第三版,Cold SpringHarbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社),NY；Ausubel等人(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology(当代分子生物学实验手册),Current Protocols,USA的第1和第2卷；和Brown(1998)Molecular Biology LabFax(分子生物学实验室传真),第二版,Academic Press(UK)的第I和第II卷之中所述的标准方案实施。在BIOS ScientificPublications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications,UK联合出版的PlantMolecular Biology Labfax(1993)(R.D.D.Croy)中描述了用于植物分子操作的标准材料和方法。用于聚合酶链反应的标准材料和方法可以在Dieffenbach和Dveksler(1995)PCRPrimer:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press中和McPherson等人(2000)PCR-Basics:From Background to Bench,第1版,德国Springer Verlag中找到。在Vos等人(1995,NAR 23:4407-4414)和公开的EP专利申请EP 534858中描述了AFLP分析的标准流程。
1.实施例1-根肿病抗性粗略作图
产生欧洲油菜作图群体
从抗根肿病雌性DH亲本和根肿病易感雄性DH亲本之间的F1杂交产生双-单倍体(DH)群体。该群体由199株个体组成。
DH系的Infinium基因型分型(iSCAN)分析
使用生产商的纯化试剂盒和方案，使用自动化KingFisher DNA提取方法(ThermoScientific)，从199株DH植物并从该杂交的2个亲本提取DNA。
通过以下方式设计约5K(4921个)SNP定制阵列，Illumina Infinium II HDBeadChip：借助Illumina分析(ADT)筛选拜耳公司挽回型(propitiatory)SNP、其个体变体基因座，包括其左侧和右侧翼序列，随后如Ganal等人(PLOS.2011年12月8日)和Clark等人(2016,Theor Appl Genet.129(10):1887–1899)所描述那样选择最成功的定制基因分型测定。
如生产商方案所述和如Ganal等人(2011)和Clark等人(2016)中所述那样进行测定。
始于总计200ng(50ng/μl)基因组DNA，将该DNA经由改良的全基因组扩增扩增并酶促片段化。将片段化的DNA与24阵列芯片的单SNP阵列杂交。BeadChip清单文件(*.dmap)中提供每个寡核苷酸标签标记的珠的位置。以这种方式，片段化的DNA样品可以与已知对应于单SNP的每个珠寡核苷酸特异性杂交。通过单碱基延伸进行精确SNP等位基因检测，用二硝基苯基(DNP)标记A/T延伸碱基并且用生物素标记C/G碱基。激光激发结合了荧光团的抗生物素抗体或抗DNP抗体，以发射(分别)作为红色和绿色被检出的信号并由Illumina iScan在高分辨BeadChip图像中捕获。扫描各像后，在Illumina iSCAN系统(阵列读数仪)上分析它们，其中根据相应珠地图(*.dmap)文件寄存信号并且提取图像(*.idat)上每个珠双颜色信号强度值。默认情况下，ICS AutoConvert启用，归一化强度数据并生成基因型识别。
使用GenomeStudioTM数据分析软件(GenomeStudio Software V2011.1(Illumina))进行BeadArray idat文件分析。使用基因分型(GT)模块中的一体化算法(GenTrain&GenCall)进行原始数据分析，如原始数据归一化、聚类和基因型鉴定。通过与典型基因型聚类比较，从BeadChip标记双色信号强度进行基因型识别。通过GenTrain算法进行聚类位置鉴定。随着一份样品因DNA提取失败而被排除，而未鉴定到其他表现低劣的样品，则不需要进一步移除样品和全部SNP重新聚类。仍然，SNP聚类的位置要求通过使2D笛卡尔曲线中Cy3和Cy5荧光强度聚类情况可视化并使聚类再居中来编辑。在导出基因型识别前进一步审查修正的基因型识别，知晓这个群体的亲本和株系是双单倍体并且因而任何未能仅显示双组聚类的SNP不可信：设定超过两个识别发生聚类的SNP为‘不识别’。
DH系的表型分型
加拿大阿尔伯塔省阿尔伯塔大学收集跨加拿大西部的分离株。一些分离株为单孢子的并且基于Williams,1966的分类计数体系，描述为致病型3、5、6和8(Strelkov等人,2006；Xue等人,2008)。致病型3、5、6和8从该大学获得并且将每个致病型分别单独接种到每个DH系上地并使用0-3标度进行表型分析。
遗传作图
对DH作图群体的个体观察到总计1608个多态性的SNP标记范例(3070个标记是单型的，并且243个具有多于10％的无识别)。使用MSTMap软件(Wu,PLOS.2008年10月10日)进行遗传连锁作图。根据在线用户说明(http://138.23.178.42/mstmap/)应用默认MSTMap参数。通过计算与基因分型数据相关的曲线最小生成树，MSTMap找到最佳分子标记顺序及重组距离。经由参数‘no_map_dist’设定两个标记之间最小距离，限定了标记密集连锁群。
如“Guide to QTL Map with R/qtl(采用R/qtl进行QTL Map指南)”中所述，使用R/qtl进行数量性状基因座作图。简而言之，通过以下方式检查遗传图：重新计算配对重组分数(重组频率)并且‘核查标记顺序’过程鉴定问题标记顺序，后者随后使用‘switch.order’功能被修正。采用正确顺序，使用Kosambi作图算法计算最终作图距离。由于表型并未正态分布，故我们使用基于秩次的‘非参数间隔区作图’法(Kruskal–Wallis检验的扩展)。
通过检查范围从Lod3至Lod6的Lod-分型树结果，鉴定连锁型标记基因型分组。借助鉴定的连锁型标记分组，以第3轮选项并使用Kosambi作图功能，使用默认计算选项进行标记排序。这项分析产生对染色体N03上包含五个候选抗病性基因的基因组区域的鉴定。
2.实施例2–根肿病抗性精细定位和CRT基因鉴定
从抗根肿病雌性亲本和根肿病易感雄性亲本之间的F1杂交产生含3000株个体的F2群体。使用位于N03上已鉴定的基因组区间中的99个SNP标记，对这3000株F2连同亲本一起进行基因分型。这项分析带来了在染色体N03上已鉴定区域内部鉴定到一个更小基因组区间，其现在仅包含一个候选抗病性基因，即CRT抗根肿病基因。
鉴定的CRT基因是一个编码NBS的基因。SEQ ID NO:2中提供抗根肿病等位基因的基因组序列，而SEQ ID Nos:5和8中提供两个易感等位基因的基因组序列。相应的编码性DNA序列分别在SEQ ID NOs:1、4和7中提供。
图1显示抗性等位基因和易感等位基因的编码性序列的比对结果，同时图2中给出相应抗性蛋白和易感蛋白的氨基酸序列的比对结果。总体上，CRT的氨基酸序列与相应的根肿病敏感蛋白共有至少90％相似性。
3.实施例3--验证抗根肿病基因CRT
构建编码CRT用于芸薹属细胞中组成型表达的重组基因
通过PCR克隆法获得具有根据SEQ ID NO:1的核酸序列的DNA分子。
使用标准重组DNA技术，在含有bar选择标记盒(SEQ ID NO:10的位置5385至7895)的载体中装配根据从SEQ ID NO:10的核苷酸位置141至668的序列的组成型启动子区域CaMV35S、根据从SEQ ID NO:10的核苷酸位置672至731的序列的包含矮牵牛(Petuniahybrida)叶绿素a/b结合蛋白基因的前导序列的5’UTR序列、根据序列SEQ ID NO:1或根据从SEQ ID NO:10的核苷酸位置738至5084的序列的编码CRT的DNA片段和根据从SEQ ID NO:10的核苷酸位置5101至5304的序列的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)g7基因的3′非翻译序列，以产生T-DNA P35S::CRT(SEQ ID NO:10)。
产生表达CRT的转基因芸薹属植物
将T-DNA载体引入含有Ti-辅助质粒的根癌农杆菌菌株并且用来稳定转化内部开发的易感根肿病菌株CR11和CR6的欧洲油菜系。如下文描述进一步分析纯合植物及其相应的无效分离子。
对组成型表达CRT的转基因芸薹属植物及其相应的无效分离系的根肿病抗性评估
产生的全部转基因系或事件当中，基于其在纯合体中CRT转基因的有效表达，选择8个株系，其中纯合体通过分离株CR6接种对根肿病抗病性待进行表型分型。
根肿病抗性评估提供了一致结果：对于每个经转化和表达CRT的株系，纯合植物抵抗疾病，同时无效分离子易患疾病。图3显示对这些株系中3者观察到的表型。尽管用病原体接种，纯合植物形成健康根系，而无效分离子的根形成形成随根肿病病原体感染常见的瘿。
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Claims (25)

1.一种能够赋予根肿病抗性的蛋白质，其由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。
2.分离的核酸分子，其具有编码权利要求1的蛋白质的核苷酸序列，其中所述核酸由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列组成。
3.重组基因，包含与编码权利要求1的蛋白质的核酸序列可操作地连接的植物可表达启动子和任选地在植物中有功能的转录终止及多聚腺苷酸化区。
4.权利要求3的重组基因，其中所述核酸序列由SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的序列组成。
5.权利要求3或4的重组基因，其中所述植物可表达启动子选自由组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子组成的组。
6.权利要求3或4的重组基因，其中所述植物可表达启动子是CaMV35S启动子。
7.载体，包含权利要求3至6中任一项的重组基因。
8.细菌或真菌细胞，包含权利要求3至6中任一项的重组基因或权利要求7的载体。
9.非繁殖性植物细胞，包含权利要求3至6中任一项的重组基因或权利要求7的载体。
10.非繁殖性植物细胞，包含编码根据权利要求1的蛋白质的异源CRT基因，但不包含SEQ ID NOs:11和12的序列中至少一者。
11.权利要求10的非繁殖性植物细胞，其为十字花科(Brassicacae)植物。
12.根据权利要求11的非繁殖性十字花科植物细胞或根据权利要求9或10的非繁殖性植物细胞，还包含至少一个其他抗病性基因，所述其他抗病性基因选自由根肿病抗性基因、黑胫病抗性基因、抗核盘菌(Sclerotinia)基因、抗轮枝菌(Verticillium)基因、抗镰刀菌(Fusarium)基因、抗翠菊黄化支原体(Aster Yellows)基因、抗链格孢(Alternaria)基因和抗灰茎病基因组成的组。
13.根据权利要求9至12中任一项的非繁殖性十字花科植物细胞，其选自由欧洲油菜(Brassica napus)、芥菜(Brassica juncea)、甘蓝(Brassica oleracea)、芜青(Brassicarapa)、黑芥(Brassica nigra)和埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)组成的组。
14.获得抗根肿病十字花科植物的方法，包括：
a)向十字花科植物细胞引入或提供编码根据权利要求1的蛋白质的抗根肿病基因，以产生十字花科细胞，并且
b)从所述细胞再生植物。
15.根据权利要求14的方法，其中所述十字花科植物选自由欧洲油菜、芥菜、甘蓝、芜青、黑芥和埃塞俄比亚芥组成的组。
16.根据权利要求14或15的方法，其中通过向十字花科植物细胞提供或引入根据权利要求3至6中任一项的重组基因或根据权利要求7的载体，向十字花科植物细胞引入或提供所述抗根肿病基因。
17.获得抗根肿病十字花科植物的方法，包括：
a.提供包含根据权利要求2的核酸的序列的第一芸薹属(Brassica)植物；
b.提供缺少根据权利要求2的核酸的序列的第二芸薹属植物；
c.将第一芸薹属植物与第二芸薹属植物杂交以提供后裔芸薹属植物；
d.选择对权利要求2的核酸的序列的存在检验呈阳性的后裔芸薹属植物作为已经向其中引入权利要求2的核酸的序列的芸薹属植物。
18.根据权利要求3至6任一项的重组基因、根据权利要求7的载体或权利要求2的分离的核酸分子的用途，用于获得十字花科中的根肿病抗性。
19.包含权利要求3至6任一项的重组基因或权利要求7的载体的植物的用途，用于产生菜籽油菜油或菜籽油菜种籽饼粕。
20.包含权利要求3至6任一项的重组基因或权利要求7的载体的植物的用途，用于产生种子。
21.包含权利要求3至6任一项的重组基因或权利要求7的载体的植物的用途，用于产生菜籽油菜作物。
22.产生食品、饲料或工业产品的方法，包括
a)获得包含权利要求3至6任一项的重组基因或权利要求7的载体的植物或其部分；并且
b)从植物或其部分制备食品、饲料或工业产品。
23.权利要求22的方法，其中
a)食品或饲料是油、饼粕、籽粒、淀粉、面粉或蛋白质；或
b)工业产品是生物燃料、纤维、工业化学品、药物或营养制剂。
24.检测芸薹属DNA样品中CRT抗根肿病基因座的试剂盒，其中所述试剂盒包含能够扩增与CRT连锁的DNA标记的两条引物，其中CRT编码SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或其中CRT由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列组成，其中所述引物识别CRT且不识别SEQ ID NOs:4、5、7或8的核苷酸序列。
25.根据权利要求24的试剂盒的用途，用于确定芸薹属油籽植物中存在或不存在CRT。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4149246A1 (en) * 2020-05-11 2023-03-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Clubroot resistance
US20240018606A1 (en) * 2020-12-21 2024-01-18 NPZ Innovation GmbH New native clubroot resistance in rapeseed brassica napus
CN112442506B (zh) * 2020-12-21 2023-01-03 浙江大学 一种拟南芥根肿病感病候选基因at2g35930及其应用
WO2023035011A1 (en) * 2021-09-03 2023-03-09 North Carolina State University Compositions and methods for conferring resistance to geminivirus
CN113817749B (zh) * 2021-10-18 2023-06-23 杭州市萧山区农(林)业技术推广中心 拟南芥根肿病感病候选相关基因at3g22970及其应用
CN114381463B (zh) * 2022-02-23 2023-11-07 华中农业大学 来源欧洲芜菁ECD04的BraA08g039212E基因在根肿菌抗性改良中的应用
CN116004584B (zh) * 2022-08-17 2024-04-02 华中农业大学 一种抗根肿菌的几丁质酶及编码基因和应用
CN116410282B (zh) * 2023-03-17 2024-02-20 华中农业大学 来源欧洲芜菁ECD04的BraA03g008044E基因在根肿菌抗性改良中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104152443A (zh) * 2014-07-16 2014-11-19 浙江大学 与芜菁抗根肿病基因连锁的分子标记及获得方法
WO2016176358A2 (en) * 2015-04-30 2016-11-03 Monsanto Technology Llc Methods for producing canola plants with clubroot resistance and compositions thereof
CN106591457A (zh) * 2016-12-23 2017-04-26 北京市农林科学院 一种鉴定位于白菜a03染色体上的根肿病抗性qtl的snp分子标记开发及其应用
CN107190084A (zh) * 2011-09-27 2017-09-22 陶氏益农公司 对根肿病具有抗性的ho/ll芸苔

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5721209B2 (ja) * 2010-09-22 2015-05-20 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 根こぶ病抵抗性アブラナ科植物の作出方法
JP2012158585A (ja) * 2011-01-11 2012-08-23 Ishihara Sangyo Kaisha Ltd 根こぶ病の防除方法
US8754290B2 (en) * 2011-02-09 2014-06-17 Dow Agrosciences, Llc HO/LL canola with resistance to clubroot disease
EP2745679A1 (en) * 2012-12-21 2014-06-25 Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel B.V. Brassica plants resistant to clubroot
AU2016369320B2 (en) * 2015-12-15 2023-01-12 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Brassicaceae plants resistant to plasmodiophora brassicae (clubroot)

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107190084A (zh) * 2011-09-27 2017-09-22 陶氏益农公司 对根肿病具有抗性的ho/ll芸苔
CN104152443A (zh) * 2014-07-16 2014-11-19 浙江大学 与芜菁抗根肿病基因连锁的分子标记及获得方法
WO2016176358A2 (en) * 2015-04-30 2016-11-03 Monsanto Technology Llc Methods for producing canola plants with clubroot resistance and compositions thereof
CN106591457A (zh) * 2016-12-23 2017-04-26 北京市农林科学院 一种鉴定位于白菜a03染色体上的根肿病抗性qtl的snp分子标记开发及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
disease resistance protein [Brassica rapa subsp. pekinensis];Yu,H.-J.et al.;《GenBank: ACP30601.1》;20160724;1-2 *
Genetic mapping of clubroot resistance genes in oilseed rape;S. Werner et al.;《Theor Appl Genet》;20071127;363-372 *
大白菜抗根肿病基因CRb的精细定位;赵卓;《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》;20141015;D046-58 *

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