CN117821378A - 釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法及其应用 - Google Patents
釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117821378A CN117821378A CN202211180213.8A CN202211180213A CN117821378A CN 117821378 A CN117821378 A CN 117821378A CN 202211180213 A CN202211180213 A CN 202211180213A CN 117821378 A CN117821378 A CN 117821378A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- preparation
- exosomes
- culture medium
- stem cells
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 78
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 61
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 57
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 47
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 16
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 16
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 14
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 11
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 9
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 claims description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 7
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 claims description 3
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 claims description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 3
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 claims description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 3
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 3
- 210000004231 tunica media Anatomy 0.000 claims description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
- A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/50—Soluble polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Birds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法及其应用，涉及干细胞技术领域。本发明制备方法对干细胞进行两次无菌培养，能够获取较为纯净且外泌体含量较高的制备液，为后续步骤做好准备；进行两次除杂处理，能够有效去除杂质和囊泡，保证外泌体的纯度；进行筛选处理，能够将残留的细胞、血小板和稍大的胞外囊膜去除，得到含有外泌体的纯化制备液，进一步提高外泌体纯度；对外泌体进行孵育，便于外泌体的最终制备，制备方便，耗时短，能够提高干细胞外泌体的制备速度；本制备方法在二次除杂后采用细胞分选装置对制备液进行纯化，能够提高外泌体的纯度，且该操作耗时短，操作方便。
Description
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，特别是涉及一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法及其应用。
背景技术
干细胞外泌体是来自干细胞的一种细胞分泌物，外泌体是干细胞分泌微小的囊泡(宽30至150纳米)，它带上有干细胞的蛋白、mRNA和microRNA等生物活性化学物质，具备干细胞的一些功能。外泌体合乎纳米颗粒的界定，干细胞外泌体可以透过血脑屏障，是干细胞与别的细胞中间信息内容传送的关键物质，有利于干细胞功能的完成。它们类似细胞间的“通信兵”可以在细胞之间转移DNA，RNA或蛋白质，从而影响受体细胞的功能，在干细胞和再生医学领域，外泌体正在被用于以治疗从心脏病到呼吸系统疾病的疾病。
但是现有的干细胞外泌体制备的方法，一般是使用差速离心，由于样本的粘度与分离的外泌体纯度有显着的相关性，因此，具有高粘度的生物样品(例如血浆和血清样本)需要更长的超速离心步骤和更高的离心速度，从而使得制备的外泌体的纯度不是很高，制备时间过长，从而影响实验结果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法及其应用，解决了现有技术中的具有高粘度的生物样品(例如血浆和血清样本)需要更长的超速离心步骤和更高的离心速度，制备的外泌体的纯度不是很高，制备时间过长技术问题。
为达上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法及其应用，包括
步骤一：采用含血清培养基培养干细胞，培养至一定时间，然后制备干细胞，将干细胞放置在不含血清的培养基中，培养至一定时间；向容器内加入所需水量的一部分，按照培养基的配方，称取各种原料，依次加入使其溶解，最后应在全部原料溶解后加水补足，将培养基倒置过来，平放在恒温箱里，12～24h后检查，如培养基末长杂菌，即可用来培养微生物，然后进行实验，在含血清培养基中进行无菌环境培养12～36h，在不含血清的培养基中进行无菌环境培养24～48h将培养后的干细胞放置在采血袋中；
步骤二：祛除步骤一中不含血清培养基中的干细胞进行过滤干细胞，制备剩下部分；根据细胞的大小不同，可通过超滤膜过滤膜具，使用0.7μm、0.45μm或0.21μm的孔径对不同大小的干细胞进行过滤，再将离心过的采血袋倒置的悬挂在分浆夹的固定挤压板上，用5ml的注射器从采血袋的热合掉的端口扎入，用于制备液体，将制备液放置无菌存放盒中；
步骤三：将步骤二中得到的培养上清液进行第一次离心处理，制备上清液，能够去除杂质细胞和凋亡的细胞碎；清液的第一次离心处理，采用300g的离心力，离心处理8～10min；
步骤四：对步骤三中得到的上清液进行第二次离心处理，制备上清液，能够去除较大的囊泡；清液的第二次离心处理，采用2000g的离心力，离心处理8～10min；
步骤五：采用细胞分选装置对步骤四得到的上清液进行筛分，将其中残留的细胞、血小板和稍大的胞外囊膜去除，得到含有外泌体的纯化制备液；采用两个串联的细胞分选装置进行筛分对制备液进行纯化，细胞分选装置由一个微流体通道和两端的声换能器组成，第一个细胞分选装置的声波频率较低，用来去除样本中残留的细胞和血小板；第二个细胞分选装置的声波频率较高，将样本中的外泌体与稍大的胞外囊膜分离开来，得到含有外泌体的纯化制备液；
步骤六：将步骤五种获取的制备液采用PEG溶液混合在4℃无菌恒温条件下孵育将孵育后的制备液通过低速离心即可沉淀回收外泌体，得到高纯度的干细胞外泌体；PEG溶液的浓度为0.25g/ml，PEG溶液的配制方法为：按照0.25g/ml的浓度比例，称取PEG8000溶解于Milli-Q超纯水中，121℃条件下湿热灭菌30min；获取的PEG溶液保存在4℃的恒温无菌环境中；外泌体孵育的时间为8～10h；外泌体制备的离心条件为：500g的离心力，离心处理8～10min。
一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法所制备的外泌体在制备用于皮肤创伤的治疗的制剂中的应用；皮肤创伤为表皮、真皮或皮下组织的创伤。
本发明的实施例具有以下有益效果：
本发明的制备方法对干细胞进行两次无菌培养，能够获取较为纯净且外泌体含量较高的制备液，为后续步骤做好准备；进行两次除杂处理，能够有效去除杂质和囊泡，保证外泌体的纯度；进行筛选处理，能够将残留的细胞、血小板和稍大的胞外囊膜去除，得到含有外泌体的纯化制备液，进一步提高外泌体纯度；对外泌体进行孵育，便于外泌体的最终制备，制备方便，耗时短，能够提高干细胞外泌体的制备速度；本制备方法在二次除杂后采用细胞分选装置对制备液进行纯化，能够提高外泌体的纯度，且该操作耗时短，操作方便；纯化后的制备液采用PEG溶液孵育后进行低速离心沉淀分离即可获取干细胞外泌体，不需要进行长时间的超高速离心分离进行制备，且制备的外泌体纯度高，能够大大提高制备效率。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明一实施例的细胞外泌体制备方法流程结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。
为了保持本发明实施例的以下说明清楚且简明，本发明省略了已知功能和已知部件的详细说明。
请参阅图1所示，在本实施例中提供了一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法及其应用，包括：
步骤一：采用含血清培养基培养干细胞，培养至一定时间，然后提取干细胞，将干细胞放置在不含血清的培养基中，培养至一定时间；向容器内加入所需水量的一部分，按照培养基的配方，称取各种原料，依次加入使其溶解，最后应在全部原料溶解后加水补足，将培养基倒置过来，平放在恒温箱里，12～24h后检查，如培养基末长杂菌，即可用来培养微生物，然后进行实验，在含血清培养基中进行无菌环境培养12～36h，在不含血清的培养基中进行无菌环境培养24～48h将培养后的干细胞放置在采血袋中；
步骤二：祛除步骤一中不含血清培养基中的干细胞进行过滤干细胞，提取剩下部分；根据细胞的大小不同，可通过超滤膜过滤膜具，使用0.7μm、0.45μm或0.21μm的孔径对不同大小的干细胞进行过滤，再将离心过的采血袋倒置的悬挂在分浆夹的固定挤压板上，用5ml的注射器从采血袋的热合掉的端口扎入，用于提取液体，将提取液放置无菌存放盒中；
步骤三：将步骤二中得到的培养上清液进行第一次离心处理，提取上清液，能够去除杂质细胞和凋亡的细胞碎；清液的第一次离心处理，采用300g的离心力，离心处理8～10min；
步骤四：对步骤三中得到的上清液进行第二次离心处理，提取上清液，能够去除较大的囊泡；清液的第二次离心处理，采用2000g的离心力，离心处理8～10min；
步骤五：采用细胞分选装置对步骤四得到的上清液进行筛分，将其中残留的细胞、血小板和稍大的胞外囊膜去除，得到含有外泌体的纯化提取液；采用两个串联的细胞分选装置进行筛分对提取液进行纯化，细胞分选装置由一个微流体通道和两端的声换能器组成，第一个细胞分选装置的声波频率较低，用来去除样本中残留的细胞和血小板；第二个细胞分选装置的声波频率较高，将样本中的外泌体与稍大的胞外囊膜分离开来，得到含有外泌体的纯化提取液；
细胞分选装置是采用基于新型声波流体技术开发的声波筛选装置，细胞分选装置由一个微流体通道和两端的声换能器组成，两个声换能器生产的声波相互接触所形成的驻波会生成一系列压力节点；当细胞或粒子流过通道并遇到一个节点时，压力会引导细胞稍微偏离中心，细胞位移的距离取决于细胞大小和可压缩性等其他性质。为了筛分外泌体，将两个细胞分选装置串联，第二个装置的声波频率设置较低，用来去除样本中残留的细胞和血小板，第二个装置的声波频率设置较高，将样本中的外泌体与稍大的胞外囊膜分离开来，对提取液进行纯化，便于得到高纯度的外泌体。且利用该装置完成100ml样本的筛选工作用时不到25分钟，能够大大提高提取速度和外泌体的纯度。
步骤六：将步骤五种获取的提取液采用PEG溶液混合在4℃无菌恒温条件下孵育将孵育后的提取液通过低速离心即可沉淀回收外泌体，得到高纯度的干细胞外泌体；PEG溶液的浓度为0.25g/ml，PEG溶液的配制方法为：按照0.25g/ml的浓度比例，称取PEG8000溶解于Milli-Q超纯水中，121℃条件下湿热灭菌30min；获取的PEG溶液保存在4℃的恒温无菌环境中；外泌体孵育的时间为8～10h；外泌体提取的离心条件为：500g的离心力，离心处理8～10min。
一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的提取方法所提取的外泌体在提取用于皮肤创伤的治疗的制剂中的应用；皮肤创伤为表皮、真皮或皮下组织的创伤。
本制备方法对干细胞进行两次无菌培养，能够获取较为纯净且外泌体含量较高的制备液，为后续步骤做好准备；进行两次除杂处理，能够有效去除杂质和囊泡，保证外泌体的纯度；进行筛选处理，能够将残留的细胞、血小板和稍大的胞外囊膜去除，得到含有外泌体的纯化制备液，进一步提高外泌体纯度；对外泌体进行孵育，便于外泌体的最终制备，制备方便，耗时短，能够提高干细胞外泌体的制备速度；本制备方法在二次除杂后采用细胞分选装置对制备液进行纯化，能够提高外泌体的纯度，且该操作耗时短，操作方便；纯化后的制备液采用PEG溶液孵育后进行低速离心沉淀分离即可获取干细胞外泌体，不需要进行长时间的超高速离心分离进行制备，且制备的外泌体纯度高，能够大大提高制备效率。
上述实施例可以相互结合。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施方式能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。
在本发明的描述中，需要理解的是，方位词如“前、后、上、下、左、右”、“横向、竖向、垂直、水平”和“顶、底”等所指示的方位或位置关系通常是基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，在未作相反说明的情况下，这些方位词并不指示和暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位或者以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制；方位词“内、外”是指相对于各部件本身的轮廓的内外。
Claims (10)
1.一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，包括：
步骤一：采用含血清培养基培养干细胞，培养至一定时间，然后制备干细胞，将干细胞放置在不含血清的培养基中，培养至一定时间；
步骤二：祛除步骤一中不含血清培养基中的干细胞进行过滤干细胞，制备剩下部分；
步骤三：将步骤二中得到的培养上清液进行第一次离心处理，制备上清液，能够去除杂质细胞和凋亡的细胞碎；
步骤四：对步骤三中得到的上清液进行第二次离心处理，制备上清液，能够去除较大的囊泡；
步骤五：采用细胞分选装置对步骤四得到的上清液进行筛分，将其中残留的细胞、血小板和稍大的胞外囊膜去除，得到含有外泌体的纯化制备液；
步骤六：将步骤五种获取的制备液采用PEG溶液混合在4℃无菌恒温条件下孵育将孵育后的制备液通过低速离心即可沉淀回收外泌体，得到高纯度的干细胞外泌体。
2.如权利要求1所述的一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，在步骤一中，向容器内加入所需水量的一部分，按照培养基的配方，称取各种原料，依次加入使其溶解，最后应在全部原料溶解后加水补足，将培养基倒置过来，平放在恒温箱里，12～24h后检查，如培养基末长杂菌，即可用来培养微生物，然后进行实验，在含血清培养基中进行无菌环境培养12～36h，在不含血清的培养基中进行无菌环境培养24～48h将培养后的干细胞放置在采血袋中。
3.如权利要求1所述的一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，在步骤二中，根据细胞的大小不同，可通过超滤膜过滤膜具，使用0.7μm、0.45μm或0.21μm的孔径对不同大小的干细胞进行过滤，再将离心过的采血袋倒置的悬挂在分浆夹的固定挤压板上，用5ml的注射器从采血袋的热合掉的端口扎入，用于制备液体，将制备液放置无菌存放盒中。
4.如权利要求1所述的一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，在步骤三中上清液的第一次离心处理，采用300g的离心力，离心处理8～10min。
5.如权利要求1所述的一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，在步骤四中上清液的第二次离心处理，采用2000g的离心力，离心处理8～10min。
6.如权利要求1所述的一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，在步骤五中，采用两个串联的细胞分选装置进行筛分对制备液进行纯化，细胞分选装置由一个微流体通道和两端的声换能器组成，第一个细胞分选装置的声波频率较低，用来去除样本中残留的细胞和血小板；第二个细胞分选装置的声波频率较高，将样本中的外泌体与稍大的胞外囊膜分离开来，得到含有外泌体的纯化制备液。
7.如权利要求1所述的一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，在步骤六中，PEG溶液的浓度为0.25g/ml，PEG溶液的配制方法为：按照0.25g/ml的浓度比例，称取PEG8000溶解于Milli-Q超纯水中，121℃条件下湿热灭菌30min；获取的PEG溶液保存在4℃的恒温无菌环境中。
8.如权利要求1所述的一种釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法，其特征在于，在步骤六中外泌体孵育的时间为8～10h；在步骤六中外泌体制备的离心条件为：500g的离心力，离心处理8～10min。
9.如权利要求1-8中任一项所述方法所制备的外泌体在制备用于皮肤创伤的治疗的制剂中的应用。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述皮肤创伤为表皮、真皮或皮下组织的创伤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211180213.8A CN117821378A (zh) | 2022-09-27 | 2022-09-27 | 釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211180213.8A CN117821378A (zh) | 2022-09-27 | 2022-09-27 | 釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117821378A true CN117821378A (zh) | 2024-04-05 |
Family
ID=90508351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211180213.8A Pending CN117821378A (zh) | 2022-09-27 | 2022-09-27 | 釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117821378A (zh) |
-
2022
- 2022-09-27 CN CN202211180213.8A patent/CN117821378A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2020103192A1 (zh) | 外泌体的提取方法 | |
| US20080318317A1 (en) | Kit for Preparing a Composition Comprising Fat Cells | |
| CN112080460A (zh) | 一种干细胞外泌体的提取方法 | |
| CN112899218A (zh) | 一种用于外泌体提取的双重切向流过滤体系及外泌体的制备方法与应用 | |
| CN111269872B (zh) | 一种拟穴青蟹组织外泌体分离的方法 | |
| CN109825472A (zh) | 一种细胞外囊泡的提取方法及试剂盒 | |
| CN112410292B (zh) | 脐带间充质干细胞脂质囊泡体的制备方法及其在促进皮肤再生中的应用 | |
| CN116083364A (zh) | 一种基于超滤装置获得不同尺寸外泌体的方法 | |
| CN107875124A (zh) | 一种从细胞悬液中提取和纯化包裹药物的细胞囊泡的方法 | |
| CN110252440B (zh) | 一种外泌体过滤提取装置及外泌体提取方法 | |
| CN109929802A (zh) | 一种基于Transwell孔板上室培养细胞下室吸附分离外泌体的方法和应用 | |
| CN110272504A (zh) | 硒化扁藻胞外多糖的制备方法和硒化扁藻胞外多糖 | |
| CN117821378A (zh) | 釆用干细胞外泌体对皮肤紧致功效的制备方法及其应用 | |
| CN102492654A (zh) | 一种分离人脐带血干细胞的试剂盒及其使用方法 | |
| WO2024130756A1 (zh) | 肿瘤细胞来源的外泌体在体外促进肿瘤细胞或肿瘤类器官生长中的应用 | |
| CN114958721A (zh) | 一种干细胞外泌体的提取方法 | |
| RU2560944C2 (ru) | Способ ультраочистки альгинатов | |
| CN114700186B (zh) | 一种刺参体液样品外泌体分离的方法 | |
| CN212688058U (zh) | 一种细胞膜纳米囊泡过滤收集装置 | |
| CN111358808A (zh) | 免疫细胞及血浆纳米提取物脂质体免疫调节制剂制备方法 | |
| RU2502999C1 (ru) | Способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи | |
| CN114958750B (zh) | 一种从胰腺癌组织提取外泌体的方法 | |
| CN100410368C (zh) | 染色体核型分析淋巴细胞培养标本预处理方法 | |
| CN108507957A (zh) | 利用体外定量溶血分光光度法检测抗体生成细胞的方法 | |
| CN118109410B (zh) | 一种自然杀伤细胞外泌体的制备方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication |