CN117815220A - 苦参醇f在制备治疗银屑病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了苦参醇F在制备治疗银屑病药物中的应用。本发明通过实验证明，单体苦参醇F能明显改善咪喹莫特诱导的银屑病小鼠的背部皮损症状及炎性细胞浸润的程度，且效果优于阳性对照药物卡泊三醇，能降低银屑病样小鼠皮肤中促炎细胞因子IL‑1β、IL‑6、IL‑8、IL‑17A、IL‑22、IL‑23、TNF‑α表达水平，升高抗炎细胞因子IL‑10的表达，说明单体苦参醇F可明显改善银屑病小鼠的皮肤炎症，很可能是通过降低皮肤组织中炎症因子IL‑1β、IL‑6、IL‑8、IL‑17A、IL‑22、IL‑23、TNF‑α和升高IL‑10的表达而达到干预银屑病的作用。单体苦参醇F还能够抑制HaCaT细胞增殖，以及抑制HaCaT细胞经IL‑17A刺激后产生IL‑6、IL‑1β、TNF‑α的水平，调节细胞免疫缓解银屑病的进程，为银屑病治疗药物提供了一种新的潜在药物。
Description
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及苦参醇F在制备治疗银屑病药物中的应用。
背景技术
苦参为豆科植物苦参（Sophora flavecensAit.）的干燥根，是中国传统的常用中药之一，具有清热燥湿、杀虫、利尿等功效，主要用于热痢、便血、黄疸尿闭、赤白带下等，含有生物碱、黄酮、苯丙素、二苯甲酰基衍生物、萜类、甾体、有机酸、脂肪酸、挥发油等成分，其中生物碱和黄酮为其主要活性成分。现代药理研究表明，苦参具有抗肿瘤、抗炎、镇痛、抑菌等药理作用。
早期对苦参化学成分的研究主要侧重于生物碱类成分，近年来的研究则多集中在其所含的异戊烯基黄酮类化合物，截止日前, 从苦参根中分离到的苦参异戊烯基黄酮约有121种。研究证明，异戊烯基黄酮具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多方面的药理活性，有良好研究及开发前景。
苦参醇F为苦参中重要的异戊烯基黄酮类化合物，目前已报道苦参醇F可降低磷酸化核因子κB和kappa B 抑制因子激酶水平以及白细胞介素1βIL-1β、IL-6 mRNA表达水平来抑制炎症反应，缓解特应性皮炎；可减少黑色素的生成，对皮肤有美白作用；还有抑菌及抗糖脂代谢紊乱作用，但苦参醇F治疗银屑病的药理作用未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供苦参醇F作为活性成分在制备治疗银屑病药物中的应用。
本发明的目的是这样实现的，苦参醇F作为活性成分在制备治疗银屑病药物中的应用，其通过降低皮肤组织中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A、IL-22、IL-23、TNF-α和升高IL-10的表达达到干预银屑病的作用；
本发明通过实验证明，单体苦参醇F能明显改善咪喹莫特诱导的银屑病小鼠的背部皮损症状及炎性细胞浸润的程度，效果优于阳性对照药物卡泊三醇，能降低银屑病样小鼠皮肤中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A、IL-22、IL-23、TNF-α表达水平，升高抗炎细胞因子IL-10的表达，说明单体苦参醇F可明显改善银屑病小鼠的皮肤炎症，很可能是通过降低皮肤组织中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A、IL-22、IL-23、TNF-α和升高IL-10的表达而达到干预银屑病的作用。单体苦参醇F还能够抑制HaCaT细胞增殖，以及抑制HaCaT细胞经IL-17A刺激后产生IL-6、IL-1β、TNF-α的水平，调节细胞免疫缓解银屑病的进程，为银屑病治疗药物提供了一种新的潜在药物，也拓宽了苦参醇F的应用范围。
附图说明
图1为苦参醇F对银屑病样小鼠皮肤外观的影响图；
图2为银屑病样模型小鼠皮损PASI评分结果图（注：n=6，与正常组相比，### P<0.001，与模型组比较，*** P<0.001）；
图3为银屑病样小鼠背部皮肤H&E染色结果图（200×）（n=6）；
图4为银屑病样小鼠脾脏变化图（注：n=6，与正常组相比，### P<0.001，与模型组比较，*P<0.05）；
图5为单体苦参醇F对银屑病样小鼠皮损处IL-1β表达的影响图（注：n=6，与正常组相比，### P<0.001，与模型组比较，*** P<0.001，*P<0.05）；
图6为单体苦参醇F对银屑病样小鼠皮损处IL-6表达的影响图（注：n=6，与正常组相比，### P<0.001；与模型组相比，*** P<0.001）；
图7为单体苦参醇F对银屑病样小鼠皮损处IL-8表达的影响图（注：n=6，与正常组相比，## P<0.01；与模型组相比，** P<0.01，* P<0.05）；
图8为单体苦参醇F对银屑病样小鼠皮损处IL-17A表达的影响图（注：n=6，与正常组相比，### P<0.001；与模型组相比，*** P<0.001）；
图9为单体苦参醇F对银屑病样小鼠皮损处IL-22表达的影响图（注：n=6，与正常组相比，### P<0.001；与模型组相比，*** P<0.001，** P<0.01，* P<0.05）；
图10为单体苦参醇F对银屑病样小鼠皮损处IL-23表达的影响图（注：n=6，与正常组相比，### P<0.001；与模型组相比，*** P<0.001）；
图11为单体苦参醇F对银屑病样小鼠皮损处TNF-α表达的影响图（注：n=6，与正常组相比，### P<0.001；与模型组相比，*** P<0.001）；
图12为单体苦参醇F对银屑病样小鼠皮损处IL-10表达的影响图（注：n=6，与正常组相比，### P<0.001；与模型组相比，*** P<0.001）；
图13为单体苦参醇F对HaCaT细胞活力的影响图（n=5）；
图14为单体苦参醇F对HaCaT 细胞形态及增殖的干预作用（注：n=3，图中圈表示细胞之间空隙大小）；
图15为单体苦参醇F对IL-17A刺激HaCaT细胞产生炎性因子IL-6的影响 图（（n=3），与正常组相比，### P<0.001；与对照组（0µg/mL）相比，*** P<0.001）；
图16为单体苦参醇F对IL-17A刺激HaCaT细胞产生炎性因子IL-1β的影响 图（（n=3），与正常组相比，### P<0.001；与对照组（0µg/mL）相比，** P<0.01，* P<0.05）；
图17为单体苦参醇F对IL-17A刺激HaCaT细胞产生炎性因子TNF-α的影响图（（n=3），与正常组相比，### P<0.001；与对照组（0µg/mL）相比，** P<0.01，* P<0.05）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明提供了苦参醇F作为活性成分在制备治疗银屑病药物中的应用，苦参醇F通过降低皮肤组织中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A、IL-22、IL-23、TNF-α和升高IL-10的表达达到干预银屑病的作用；其通过抑制HaCaT细胞经IL-17A刺激后产生IL-6、IL-1β、TNF-α的水平，调节细胞免疫缓解银屑病的进程。
苦参醇F的小鼠给药剂量为100-400 mg/kg。
实施例1
一、实验方法
1、称取一定量的单体苦参醇F(购自成都普菲德生物科技有限公司)，溶于75%乙醇中，配置成浓度分别为50mg/ml、33.3mg/ml、16.7mg/ml的单体乙醇溶液备用。给小鼠喷涂前放于超声中助溶。
2、银屑病样小鼠皮肤损伤的诱导及给药
雄性SPF级BALB/c小鼠48只（6-8周龄、20±2 g）来源于斯贝福（北京）生物技术有限公司，饲养于云南中医药大学动物实验室。在标准条件下控制饲养温度在25 ℃左右（日温差≤3 ℃，实际温度为25 ± 2 ℃）；相对湿度保持在45 %左右（实际湿度为45 ± 5%）；室内控制12 h明暗交替循环，喂养期间自由摄食饮水。
实验动物到达后自由摄食、饮水并适应性喂养7天，随后根据体重随机进行分组，分别为正常组（Control）、模型组（Model）、阳性药组（卡泊三醇，KBSC ，100 mg/kg）、单体苦参醇F高剂量组（DHH，400 mg/kg）、单体苦参醇F中剂量组（DHM，200 mg/kg）、单体苦参醇F低剂量组（DHL，100 mg/kg）。除去小鼠背部毛发使得裸露皮肤约 2cm × 3 cm 大小区域。小鼠脱毛后正常组每只小鼠涂抹凡士林62.5mg/d/（2×3 cm2），相同剂量的5 %咪喹莫特乳膏涂于造模组小鼠背部62.5 mg/d/（2cm×3 cm），持续造模5天。
造模开始之日起每日按上述分组相对应的药物及给药剂量连续喷涂5天，75%乙醇（0.3ml/只/天）作为正常、模型组对照喷涂药物，卡泊三醇作为阳性对照药物（62.5mg/d），给药组高、中、低剂量组分别给予不同浓度的单体乙醇溶液0.3ml/只/天的药物。实验过程中观察小鼠的一般生理状态（毛色、精神状态、摄食量等），每日测量小鼠体重。
3、指标获取与计算
3.1 皮损评分
参考临床银屑病的面积与严重性指数（PASI，如表1）评分标准，每日由专人定时观察各组小鼠皮损的变化情况，尽量减少实验误差。根据 PASI 评分标准（红斑，0-4；鳞屑，0-4；皮肤增厚程度，0-4）每日评出各组实验动物背部银屑病样变化总积分（鳞屑+红斑+皮损增厚，0-12），统计分析后绘制银屑病评分趋势图以观察小鼠皮损动态变化情况。
表1 PASI评分
3.2 血液采集与处理
连续造模及给药5天后，第6天摘眼球获取外周血（0.8-1.5 mL）样本，待实验结束于4 ℃、3500 rpm/min条件下离心10 min，分离血清于-80 ℃冰箱保存，根据后续实验目的进行相应指标的测定，并对各组小鼠的背部皮肤进行拍照。
3.3 指标测定与计算
实验第6天记录小鼠体重，剖取各组小鼠脾脏，清除脾脏粘连组织并用冰冷的生理盐水清洗干净，滤纸吸干水分后用分析天平称量其重量，记录各组小鼠脾脏重量（mg）并计算小鼠脾脏指数 [脾质量（mg）/体质量（g）× 10]
3.4 H&E染色
为了进行组织学病理检查，将小鼠背部皮损处皮肤浸泡于4%多聚甲醛通用型组织固定液中固定24 h以上，然后将组织从固定液中取出修复平整并贴上标签，置于脱水盒内经不同浓度的酒精脱水处理不同的时间，再进行包埋处理。将包埋好的蜡块修整好，置于石蜡切片机上切片（3-5 μm），后按照标准方案进行苏木精和伊红（H＆E）染色以观察组织病理变化，最后在显微镜下观察（皮层厚度、炎性浸润）并进行图像采集。
3.5 酶联免疫吸附试验
在免疫学反应原理的基础上通过酶联免疫吸附试验（ELISA法）检测所有组别小鼠（正常组和银屑病样小鼠）背部皮损处细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IL-22、IL-23和TNF-α的水平。每只小鼠称取约50 mg 背部皮损组织置于冰上，并用预冷的生理盐水将皮肤组织样本表面的血渍冲洗干净，滤纸擦干后快速将其剪碎置于2 mL连盖离心管中，加入陶瓷珠和裂解物进行组织样本匀浆（组织：匀浆介质=1：9；5000 rpm/min，15 min）。按照Elisa试剂盒的操作说明准备所需试剂，并检测正常组和银屑病样小鼠皮损处匀浆上清中细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IL-22、IL-23和TNF-α的含量，数值通过450nm处的吸光度值（OD）反映。
4、统计学处理
实验数据利用GraphPad Prism 5.0和SPSS 21.0统计学软件进行组间差异统计分析，通过单因素方差分析计算组间差异的显著性，结果以“均值 ± 标准差”表示，P<0.05视为有统计学意义。
二、结果与分析
1、单体苦参醇F减轻IMQ诱导的银屑病样皮炎
为了评估单体苦参醇F对IMQ诱导的银屑病样小鼠模型的疗效，本实验采用咪喹莫特连续造模及同时给药6天后处死小鼠。通过肉眼观察，如图1所示，正常组小鼠皮肤始终保持光滑，表皮没有干燥鳞屑、红斑等现象；造模组于第2-3天开始出现皮损，背部出现红色斑点，随着造模时间的延长，红斑逐渐从点扩大到片状，背部由轻微鳞屑到片状再到鳞屑成层，造模及给药6天后银屑病样模型形成；与模型组相比，单体苦参醇F给药组没有出现典型的银屑病样皮损，小鼠鳞屑明显变薄、减少，鳞屑厚度减轻，且苦参醇F低、中、高剂量组均效果显著优于阳性对照药物卡泊三醇。
2、单体苦参醇F对银屑病样小鼠皮损严重程度的影响
本实验通过评分系统（PASI评分）来比较给药组和模型组小鼠背部皮肤银屑病面积和严重程度，结果如图2所示：正常组红斑、鳞屑、皮损增厚三者评分之和始终为0；造模组小鼠从第3天开始逐渐出现皮肤增厚或鳞屑现象，PASI总评分逐渐升高；阳性药组与给药单体苦参醇F组相较于模型组银屑PASI评分均明显降低，且单体苦参醇F低、中、高剂量组PASI评分还显著低于阳性药组，表明苦参醇F效果优于阳性对照药物卡泊三醇。
通过H&E染色对银屑病样小鼠皮损组织进行病理学分析（如图3）：正常组细胞形态正常，表皮较薄，无炎性浸润现象，模型组与之相反；与模型组相比，经阳性药和单体苦参醇F干预治疗的银屑病小鼠在皮损厚度、炎性浸润方面改善效果显著。由此说明单体苦参醇F能够抑制银屑病样小鼠皮损处的炎性细胞浸润，并降低疾病的严重程度，且苦参醇F低、中、高剂量组均效果显著优于阳性对照药物卡泊三醇。
3、银屑病样小鼠脾脏变化
银屑病是一种免疫介导的慢性炎症疾病，脾脏作为身体的主要免疫器官，在受到炎症刺激时免疫系统异常活化，会引起脾脏肿大。由图4可以看出，与正常组相比，咪喹莫特造模的模型组脾脏指数显著升高，差异具有统计学意义（P<0.001）；与模型组相比，单体苦参醇F中、低剂量组小鼠脾脏指数呈不同程度降低，表明单体苦参醇F能够抑制银屑病样小鼠脾脏的肿大，从而调节银屑病发展过程中免疫系统的异常活化。
4、单体苦参醇F对银屑病样小鼠皮损处细胞因子表达的影响
4.1 单体苦参醇F对银屑病样小鼠皮损处IL-1β表达的影响
从图5可以看出，将咪喹莫特涂抹小鼠背部后，能显著诱导与临床相似的银屑病症状。此外，使用IMQ后显著增加了皮损组织中IL-1β的含量（P<0.001），与模型组相比，单体苦参醇F高剂量组抑制了IL-1β的表达。
4.2 单体苦参醇F对银屑病样小鼠皮损处IL-6表达的影响
如图6，与正常组相比，模型组IL-6的表达水平显著增加（P<0.001），ELISA结果显示模型组中IL-6表达水平显著升高；给予药物（包括药卡泊三醇与单体高、中剂量）干预后能显著降低银屑病样小鼠皮损处IL-6的水平和表达差异均具有统计学意义（P<0.001），单体苦参醇F低剂量组能在一定程度上降低IL-6的表达。
4.3 单体苦参醇F对银屑病样小鼠皮损处IL-8表达的影响
如图7所示，模型组IL-8在IMQ造模后表达高于正常组（P<0.01）；相较于模型组，卡泊三醇对IL-8的抑制能力优于单体苦参醇F高、中剂量组，三者均能显著降低IL-8的水平（P<0.01或P<0.05），而单体苦参醇F低剂量组虽能降低银屑病样小鼠皮损处IL-8的水平，但差异没有统计学意义（P>0.05）。
4.4 单体苦参醇F对银屑病样小鼠皮损处IL-17A表达的影响
如图8，与正常组相比，模型组IL-17A的表达水平显著增加（P<0.001），ELISA结果显示模型组中IL-17A表达水平显著升高；给予药物（包括药卡泊三醇与单体高、中剂量）干预后能显著降低银屑病样小鼠皮损处IL-17A的水平和表达差异均具有统计学意义（P<0.001），单体苦参醇F低剂量组能显著降低IL-17A的表达。
4.5 单体苦参醇F对银屑病样小鼠皮损处IL-22表达的影响
如图9，银屑病样小鼠皮损处IL-22的表达高于正常组；与模型组相比，KBSC组显著降低IL-22在银屑病样小鼠皮损部位的异常表达（P<0.001），单体苦参醇F高、中剂量组在一定程度上抑制了IL-22的水平（P<0.01，P<0.05），但单体苦参醇F低剂量组仅在一定程度上降低了IL-22的表达水平，统计学与模型组相比无差异（P>0.05）。
4.6 单体苦参醇F对银屑病样小鼠皮损处IL-23表达的影响
目前众多研究结果已证明IL-23在银屑病发病过程中占有重要地位，如图10所示，在银屑病样小鼠皮损处IL-23的表达均显著高于正常组；而卡泊三醇（P<0.001）与单体苦参醇F高、中、低（P<0.001）给药干预后对IL-23的表达有显著的抑制作用。
4.7 单体苦参醇F对银屑病样小鼠皮损处TNF-α表达的影响
如图11，银屑病样小鼠皮损处TNF-α的表达显著高于正常组（P<0.001）；与模型组相比，卡泊三醇组显著降低TNF-α在银屑病样小鼠皮损部位的异常表达（P<0.001），单体苦参醇F高、中、低剂量组显著抑制了TNF-α的水平（P<0.001）。
4.8 单体苦参醇F对银屑病样小鼠皮损处IL-10表达的影响
IL-10是一种抗炎因子，在炎症皮肤中表达量较少（图12）；IMQ诱导的银屑病样小鼠经给药干预后，卡泊三醇能够显著促进IL-10的表达（P<0.001），单体苦参醇F高、中、低剂量（P<0.001）对IL-10有显著的促进作用，由此说明单体苦参醇F可能通过免疫因子层面干预银屑病，起到一定的改善或治疗作用。
以上结果表明，单体苦参醇F能明显改善咪喹莫特诱导的银屑病小鼠的背部
皮损症状及炎性细胞浸润的程度，ELISA结果显示，单体苦参醇F能降低银屑病样小鼠皮肤中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A、IL-22、IL-23、TNF-α表达水平，升高抗炎细胞因子IL-10的表达。由此可推断出单体苦参醇F可明显改善银屑病小鼠的皮肤炎症，很可能是通过降低皮肤组织中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A、IL-22、IL-23、TNF-α和升高IL-10的表达而达到干预银屑病的作用。
实施例2 苦参醇F对干预HaCaT作用研究
本实验通过HaCaT细胞建立银屑病细胞模型，给予单体苦参醇F，利用CCK-8进行细胞活性测试，通过倒置显微镜和CCK-8试剂观察单体苦参醇F对HaCaT细胞形态和细胞增殖的影响，并计算出细胞增殖抑制率。结合IL-6 ELISA试剂盒评估HaCaT细胞经IL-17A刺激后单体苦参醇F不同剂量对其产生细胞因子IL-6、TNF-α、的作用，以此探究单体苦参醇F对体外培养HaCaT细胞的干预作用。
一、实验方法
1、单体苦参醇F药液的配置
2、细胞培养液配置
含有10 %胎牛血清（FBS）、1 %青-链霉素双抗的DMEM高糖培养液的配置：取10 mLFBS、1 mL青-链霉素双抗溶液、89 mL基本培养基（DMEM高糖培养基，以配置100 mL为例），混合均匀。将HaCaT细胞株接种于含有10 % FBS、1 %青-链霉素双抗的DMEM高糖培养液中，置于37 ℃、5 %CO2细胞恒温培养箱内使其贴壁生长，倒置显微镜下观察细胞生长情况并结合培养基颜色的变化（由红至橙）进行换液，一般隔天换液。待细胞长至80-90 %即可进行传代培养（一般传代比例为1：2），实验期间严格进行无菌操作。
3、细胞传代
将培养瓶从培养箱中取出置于无菌操作台，打开瓶口弃去瓶中旧的培养液，加入3-5 mL PBS小幅度轻摇洗涤后弃去（PBS清洗2次即可），然后加入1-2 mL 0.25 %胰酶-0.53mM EDTA消化液（以T25培养瓶为例），将培养瓶倒置于37℃培养箱1-3分钟（预热处理）后翻转使胰酶与细胞接触3-5分钟（消化处理），通过倒置显微镜观察细胞形态，若细胞触角回缩变圆（大部分）且轻拍瓶壁可见大量细胞脱离瓶壁，则迅速移至无菌操作台轻敲几下，补加 2mL完全培养基中和胰酶的消化能力。最后将细胞悬液转移至无菌离心管中1000 rpm离心5 min弃上清，补加完全培养基并制备单细胞悬液后取适量转移至新的培养瓶培养。
4、细胞计数
按上述方法进行细胞消化制成单细胞悬液后，用移液枪吸取10 μL单细胞悬液转移至洁净的细胞计数板上，将细胞计数板置于倒置显微镜下调出计数室，按照细胞计数规则（处于线上的细胞记上不记下、记左不记右）进行计数并计算单细胞悬液的细胞密度。公式如下：细胞密度=[（4个大格内细胞数量之和/4）×104×稀释倍数]个/mL。
5、单体苦参醇F对体外培养HaCaT细胞活力的影响
按步骤3操作进行细胞消化离心，离心结束后使用移液枪移去上清液，剩余细胞沉淀加入配置好的DMEM高糖完全培养基（胎牛血清：青霉素-链霉素双抗：基本培养基=10：1：89），反复轻轻吹打细胞悬液以制备单细胞悬液，然后通过细胞计数调整单细胞悬液密度（1×105个/mL）。计数结束后以100μL/孔将细胞接种于96孔板中，随机分为空白组（无细胞+培养基）、对照组（细胞+培养基）、给药组（细胞+药液+培养基），每组5个复孔，以0.01 mg/mL、0.025mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL浓度梯度给药。待细胞生长至70-80 %时PBS清洗，然后各组加入相应培养液，于5 %CO2孵箱37℃条件下分别培养24 h、48 h，然后加入CCK-8（10 μL/孔）继续培养2（1-4小时）小时，通过酶标仪测定450 nm波长处的吸光度（OD）值并计算细胞活力[76]，公式如下：细胞活力（%）=（试验孔OD值-空白孔OD值）/（对照孔OD值-空白孔OD值）×100%，实验重复3次。
6、单体苦参醇F对体外培养HaCaT细胞增殖能力的影响
实验选用处于对数生长期的细胞并以1×105个/孔的密度接种于12孔板中，随机分为空白组（无细胞+培养基）、对照组（细胞+培养基）、单体苦参醇F高剂量组（DHH，1mg/mL）、单体苦参醇F中剂量组（DHM，0.5 mg/mL）、单体苦参醇F低剂量组（DHL，0.25 mg/mL），每组3个复孔。待细胞生长至70-80%时PBS清洗，然后各组加入相应培养液，分别培养24 h、48h后通过倒置显微镜观察细胞形态及存活密度，最后加入CCK-8通过酶标仪测定所有孔在450 nm波长处的OD值并计算细胞增殖抑制率[77]，对照组是指未用竹叶防风药液处理的细胞，其细胞增殖被认为是 100％。公式如下：细胞增殖抑制率（%）=[1-（试验孔OD值-空白孔OD值）/（对照孔OD值-空白孔OD值）]×100%，实验重复3次。
7、单体苦参醇F对IL-17诱导的HaCaT细胞分泌炎性因子的影响
实验选用处于对数生长期的细胞并以1×104个/孔的密度接种于96孔板中，按步骤6所述分组，待细胞生长至70-80%时各给药组预处理细胞6 h（每孔100 µL），随后用IL-17A（100 ng/mL）与不同浓度的单体苦参醇F（高剂量，40 µg/mL；中剂量，20 µg/mL；低剂量，10 µg/mL）联合处理细胞24 h，空白组加入等量培养基，对照组用IL-17A（100 ng/mL）处理以诱导细胞中牛皮癣样炎症。24小时后收集细胞培养液，按照ELISA试剂盒的操作说明测定HaCaT细胞上清液中IL-6的水平。即收集细胞培养液离心20 min（2000-3000 rpm/min）后仔细收集上清，设置标准孔和样本孔（空白对照孔和待测样本孔），标准孔加入相应标准品，空白对照孔不加样品及酶标试剂，待测样本孔加入相应样品，然后按照试剂盒说明书进行加样、加酶、温育、洗涤、显色、终止、测定等一系列的操作。
8、统计学处理
所有数据采用SPSS 17.0和GraphPad Prism 5.0软件进行统计处理，各组间差异性采用单因素方差分析检验，计量资料以“”表示，P<0.05被认为差异具有统计学意义。
二、 结果与分析
1、单体苦参醇F抑制HaCaT细胞活力
如图13所示，0.1 mg-2 mg浓度梯度的单体苦参醇F分别干预HaCaT细胞24h、48h后，低浓度几乎不影响 HaCaT 细胞生长，随着单体苦参醇F浓度的增大、给药时间的增加，HaCaT细胞存活率逐渐下降且与剂量、时间呈一定的线性关系，表明单体苦参醇F能够干预HaCaT细胞生长。
2、单体苦参醇F抑制HaCaT细胞增殖
单体苦参醇F对HaCaT细胞形态的影响：通过细胞活力试验确定单体苦参醇F高、中、低剂量分别为1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25mg/mL。如图14（左），单体苦参醇F不同浓度分别干预HaCaT细胞24h、48h后，在倒置显微镜下观察细胞形态的变化，图中显示随着单体苦参醇F浓度的增加，HaCaT漂浮细胞逐渐增多、细胞密度逐渐减小，说明HaCaT细胞随给药浓度的升高存活率、细胞密度等下降。
单体苦参醇F对HaCaT细胞增殖能力的影响：图14（右）中显示，在给药干预24h、48h后，单体苦参醇F不同给药浓度组均能够抑制HaCaT细胞增殖，且细胞增殖抑制率与时间、药物浓度成正比，给药时间越长、给药浓度越高，细胞增殖抑制率就越高，由此说明单体苦参醇F对HaCaT 细胞生长有显著的抑制作用，且浓度越高抑制越强。
3、单体苦参醇F抑制IL-17A刺激HaCaT细胞产生炎性因子IL-6
在细胞活性试验中，确定不影响细胞生长的药物剂量50 µg/mL为高剂量，25 µg/mL、10 µg/mL分别为中、低剂量，然后进行单体苦参醇F干预IL-17A诱导的HaCaT细胞分泌炎性因子试验。经ELISA试剂盒检测各组细胞上清中IL-6的表达水平，结果如图15所示：对照组（0 µg/mL）细胞上清中IL-6表达含量显著升高（P<0.001）；单体苦参醇F高、中、低剂量组与对照组相比IL-6表达显著下降（P<0.01），说明单体苦参醇F能够抑制IL-17A刺激HaCaT细胞产生皮肤炎性细胞因子IL-6。
4、 单体苦参醇F抑制IL-17A刺激HaCaT细胞产生炎性因子IL-1β
在细胞活性试验中，确定不影响细胞生长的药物剂量50 µg/mL为高剂量，25 µg/mL、10 µg/mL分别为中、低剂量，然后进行单体苦参醇F干预IL-17A诱导的HaCaT细胞分泌炎性因子IL-1β试验。经ELISA试剂盒检测各组细胞上清中IL-1β的表达水平，结果如图16所示：对照组（0 µg/mL）细胞上清中IL-1β表达含量显著升高（P<0.001）；单体苦参醇F高、中剂量组与对照组相比IL-1β表达显著下降（P<0.01），说明单体苦参醇F能够抑制IL-17A刺激HaCaT细胞产生皮肤炎性细胞因子IL-1β。
5、单体苦参醇F抑制IL-17A刺激HaCaT细胞产生炎性因子TNF-α
在细胞活性试验中，确定不影响细胞生长的药物剂量50 µg/mL为高剂量，25 µg/mL、10 µg/mL分别为中、低剂量，然后进行单体苦参醇F干预IL-17A诱导的HaCaT细胞分泌炎性因子TNF-α试验。经ELISA试剂盒检测各组细胞上清中TNF-α的表达水平，结果如图17所示：对照组（0 µg/mL）细胞上清中TNF-α表达含量显著升高（P<0.001）；单体苦参醇F高、中剂量组与对照组相比TNF-α表达显著下降（P<0.01），说明单体苦参醇F能够抑制IL-17A刺激HaCaT细胞产生皮肤炎性细胞因子TNF-α。
结果分析：银屑病是一种以淋巴细胞和中性粒细胞浸润、角质形成细胞角化增殖过度为主的慢性皮肤炎症疾病，病变部位的鳞屑和红斑虽不致命，但严重影响患者的身心健康及生活质量，HaCaT细胞是由角质形成细胞体外培养后自然转化而得到的人类永生化角质细胞，与正常人角质形成细胞分化特性相似（保留了角质形成细胞分化能力），呈不规则多边形贴壁生长，多用于皮肤疾病（如银屑病、湿疹）角质形成细胞的病理学研究。本实验以人表皮角质形成细胞HaCaT细胞为银屑病细胞模型，探讨单体苦参醇F在细胞层面干预银屑病的效果。结果表明，一定浓度的单体苦参醇F物（0.1 mg-1 mg）能够抑制HaCaT细胞增殖，对HaCaT细胞的干预作用随时间延长、浓度的增大而增强。
银屑病发病进程中有些细胞因子占据非常重要的地位，总结文献报道发现目前银屑病的研究不外乎集中在促炎因子（IL-6、IL-8、IL-17A等）与抗炎因子（如IL-10）激发与活化等细胞免疫上。然而角质形成细胞在受到刺激活化时自身可合成分泌多种细胞因子（IL-1、IL-6、IL-8等），这些细胞因子又反过来作用于自身，促进其增殖分化过程，这种自反馈调节使得机体细胞免疫紊乱（银屑病病理表现）。另一方面IL-17A参与人类角质形成细胞的过度增殖和异常分化从而加重银屑病。有研究表明当基底角质形成细胞中IL-17A高表达时可诱导靶细胞分泌大量IL-6，使得局部更甚者全身IL-6水平异常增加，进一步引发细胞因子促炎反应，在病变皮肤表面放大炎症反应（表皮起红疹、鳞屑、微囊肿等）。IL-6是一种多效性促炎细胞因子，不仅促进B细胞、T细胞、中性粒细胞分化和激活，在免疫系统和非免疫组织之间的促炎作用中也起着关键作用。几乎所有的基质细胞和免疫系统细胞都会产生IL-6，机体缺乏IL-6会导致先天免疫和适应性免疫受损。正常情况下人体内IL-6的生理浓度相对较低，但当机体稳态调节失衡、自身免疫或炎性爆发的情况下，IL-6的表达浓度会迅速升高，因此其浓度增加通常更好地预测疾病的发生，近年来IL-6不同的干预策略治疗银屑病备受关注。此外，在银屑病细胞模型研究中TNF-α、IL-17A、IL-22也经常被用来诱导角质形成细胞炎症或增殖。本研究通过IL-17A刺激在体外建立了银屑病样角质形成细胞模型，用不同浓度的单体苦参醇F（50 µg/mL、25 µg/mL、10 µg/mL）处理角质形成细胞24h，然后通过ELISA试剂盒检测IL-17A刺激HaCaT细胞后IL-6、IL-1β、TNF-α的水平。结果表明，IL-17A能显著提高IL-6的表达水平（P<0.001）而单体苦参醇F能够抑制HaCaT细胞经IL-17A刺激后产生IL-6、IL-1β、TNF-α的水平，调节细胞免疫缓解银屑病的进程。
Claims (3)
1.苦参醇F作为活性成分在制备治疗银屑病药物中的应用，其特征在于，苦参醇F通过降低皮肤组织中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A、IL-22、IL-23、TNF-α和升高IL-10的表达达到干预银屑病的作用。
2.根据权利要求1所述苦参醇F作为活性成分在制备治疗银屑病药物中的应用，其特征在于，苦参醇F能够抑制HaCaT细胞增殖以及HaCaT细胞经IL-17A刺激后产生IL-6、IL-1β、TNF-α的水平，调节细胞免疫缓解银屑病的进程。
3.根据权利要求1所述苦参醇F作为活性成分在制备治疗银屑病药物中的应用，其特征在于，苦参醇F的小鼠给药剂量为100-400 mg/kg。
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