CN117802058A - 一种甲酸脱氢酶突变体及其制备方法、应用和nadh的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种甲酸脱氢酶突变体及其制备方法、应用和NADH的制备方法，所述甲酸脱氢酶突变体为在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上发生了氨基酸突变的甲酸脱氢酶；所述氨基酸突变的类型包括K212L和/或A347V。本发明通过在甲酸脱氢酶中引入所述突变，显著提高了甲酸脱氢酶的催化活力，从而提高NADH的生产和再生效率。
Description
技术领域
本发明属于蛋白改造技术领域，涉及一种甲酸脱氢酶突变体及其制备方法、应用和NADH的制备方法。
背景技术
手性醇、非天然氨基酸及其衍生物在食品、医药和化工工业有巨大的应用前景。近年来，这些产物的非对称还原也颇受关注。在还原的过程中需要消耗大量昂贵的NADH或NADPH，为了降低生产成本，提高辅酶循环效率一直是非对称氧化还原领域需要关注的焦点。迄今为止，在生物转化的辅酶再生体系中，葡萄糖脱氢酶和甲酸脱氢酶是两种应用最为广泛的辅酶再生酶。葡萄糖脱氢酶通过氧化葡萄糖来进行NADH或NADPH的再生，有葡萄糖酸等副产物生成，会加大后续处理工艺的难度。甲酸脱氢酶(formate dehydrogenases，FDH)能催化甲酸氧化生成二氧化碳，同时能将NAD+还原成NADH，在NADH的再生中起重要的作用。此外，甲酸脱氢酶介导的NADH再生没有任何副产物的产生。因此，甲酸脱氢酶更适合于NADH的再生。
甲酸脱氢酶广泛存在于甲基营养型微生物中，如可以利用甲醇的酵母菌以及一些细菌等，最具代表性的是来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的甲酸脱氢酶CbFDH，已成功用于与L-亮氨酸脱氢酶偶联进行手性纯L-叔亮氨酸的工业化生产。然而，野生型的CbFDH酶活性低，与其它氧化还原酶偶联时，辅酶NADH的再生能力不足，制约了产品的转化效率。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种甲酸脱氢酶突变体及其制备方法、应用和NADH的制备方法。本发明采用基因工程技术对来源于红球菌属(Rhodococcussp.JT-3)的甲酸脱氢酶进行人工定向改造，显著提高了甲酸脱氢酶的催化活力，从而提高NADH的生产和再生效率。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种甲酸脱氢酶突变体，所述甲酸脱氢酶突变体为在SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列基础上发生了氨基酸突变的甲酸脱氢酶；
所述氨基酸突变的类型包括K212L和/或A347V。
在本发明中，通过在甲酸脱氢酶中引入如上所述突变，显著提高了甲酸脱氢酶的催化活力，从而提高NADH的生产和再生效率。
在本发明中，所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列如下：
MAKVLCVLYDDPVDGYPTTYARDDLPTVERYGDGQSLPTPTAIDFVPGT
MLGSVSGELGLRKYLESNGHTLVVTSDKDGPDSVFERELADADVVISQPFWP
AYLTADRIAKAPNLKLALTAGIGSDHVDLQAAMDSGVTVAEVTYCNSISVAE
HVVMMILGLVRNYLPSHEWVTKGGWNIADCVARSYDVEGMHVGTVAAGRI
GLAVLRRLKPFGMHLHYTDRHRLPESVEEELGLIWHPSPEDMYPNCDVVTL
NCPLHPETEHMVNEETLKLFKRGAYLVNTARGKLCDRDAIVRALEDGRLAG
YAGDVWFPQPAPEDHPWRSMPNHGMTPHISGTSLSAQTRYAAGTREILECFF
EGRPIRDEYLIVDSGALAGVGAHSYSAGNATDGSEEAAKFKQR。
优选地，所述甲酸脱氢酶的编码序列包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO.2：
ATGGCTAAAGTTCTGTGCGTTCTGTACGACGACCCGGTTGACGGTTACCCGACCACCTACGCTCGTGACGACCTGCCGACCGTTGAACGTTACGGTGACGGTCAGTCTCTGCCGACCCCGACCGCTATCGACTTCGTTCCGGGTACCAT GCTGGGTTCTGTTTCTGGTGAACTGGGTCTGCGTAAATACCTGGAATCTAACGGTCACACCCTGGTTGTTACCTCTGACAAAGACGGTCCGGACTCTGTTTTCGAACGTGAACTGGCTGACGCTGACGTTGTTATCTCTCAGCCGTTCTGGCCGGCTTACCTGACCGCTGACCGTATCGCTAAAGCTCCGAACCTGAAACTGGCTCTGACCGCTGGTATCGGTTCTGACCACGTTGACCTGCAGGCTGCTATGGACTCTGGTGTTACCGTTGCTGAAGTTACCTACTGCAACTCTATCTCTGTTGCTGAACACGTTGTTATGATGATCCTGGGTCTGGTTCGTAACTACCTGCCGTCTCACGAATGGGTTACCAAAGGTGGTTGGAACATCGCTGACTGCGTTGCTCGTTCTTACGACGTTGAAGGTATGCACGTTGGTACCGTTGCTGCTGGTCGTATCGGTCTGGCTGTTCTGCGTCGTCTGAAACCGTTCGGTATGCACCTGCACTACACCGACCGTCACCGTCTGCCGGAATCTGTTGAAGAAGAACTGGGTCTGATCTGGCACCCGTCTCCGGAAGACATGTACCCGAACTGCGACGTTGTTACCCTGAACTGCCCGCTGCACCCGGAAACCGAACACATGGTTAACGAAGAAACCCTGAAACTGTTCAAACGTGGTGCTTACCTGGTTAACACCGCTCGTGGTAAACTGTGCGACCGTGACGCTATCGTTCGTGCTCTGGAAGACGGTCGTCTGGCTGGTTACGCTGGTGACGTTTGGTTCCCGCAGCCGGCTCCGGAAGACCACCCGTGGCGTTCTATGCCGAACCACGGTATGACCCCGCACATCTCTGGTACCTCTCTGTCTGCTCAGACCCGTTACGCTGCTGGTACCCGTGAAATCCTGGAATGCTTCTTCGAAGGTCGTCCGATCCGTGACGAATACCTGATCGTTGACTCTGGTGCTCTGGCTGGTGTTGGTGCTCACTCTTACTCTGCTGGTAACGCTACCGACGGTTCTGAAGAAGCTGCTAAATTCAAACAGCGTTAA。
在本发明中，所述甲酸脱氢酶来源于红球菌属(Rhodococcus sp.JT-3)。
第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的甲酸脱氢酶突变体。
第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的第二方面所述的核酸分子。
第四方面，本发明提供了一种甲酸脱氢酶突变体转化子，所述甲酸脱氢酶突变体转化子为表达第一方面所述的甲酸脱氢酶突变体的基因工程菌株。
优选地，所述甲酸脱氢酶突变体转化子含有第二方面所述的核酸分子。
优选地，所述甲酸脱氢酶突变体转化子含有第三方面所述的表达载体。
优选地，所述基因工程菌株包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌或毕氏酵母中的任意一种。
第五方面，本发明提供了一种第一方面所述的甲酸脱氢酶突变体的构建方法，所述构建方法包括：
利用全基因合成来源于红球菌属Rhodococcus sp.JT-3的甲酸脱氢酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示；以SEQ ID NO.2序列为模板，进行PCR扩增，获得随机突变片段，经酶切重组到表达载体，转化到宿主细胞中进行培养获得突变文库，对突变文库进行高通量筛选，获得所述甲酸脱氢酶突变体；
优选地，所述进行PCR扩增时正向引物FDH-NdeⅠ-F的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物FDH-XhoⅠ-R的序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.3：5’-GAATTCCATATGGCTAAAGTTCTGTGCGTTCTGT-3’；
SEQ ID NO.4：5’-CCGCTCGAGTTAACGCTGTTTGAATTTAGCAGCT-3’。
优选地，所述载体选用pET系列载体，优选为pET28a(+)。
优选地，所述宿主细胞为BL21(DE3)。
第六方面，本发明提供了一种第一方面所述的甲酸脱氢酶突变体在NADH再生和制备反应中的应用。
第七方面，本发明提供一种NADH的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
将甲酸脱氢酶突变体添加至含有NAD+和甲酸钠的混合液中反应，获得含有NADH的反应液，得到NADH。
优选地，所述NAD+和甲酸钠的质量比为1:1-10:1，例如1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1或10:1。
优选地，所述甲酸脱氢酶突变体的用量为NAD+的重量的1％-5％，例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％。
优选地，所述混合液的pH为8.0-9.0，例如8.0、8.2、8.5、8.7、8.9或9.0。
优选地，所述反应的温度为20-40℃，例如20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、38℃或40℃；反应的时间为8-24小时，例如8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、20小时、22小时或24小时。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明通过在甲酸脱氢酶中引入所述突变，显著提高了甲酸脱氢酶的催化活力，从而提高NADH的生产和再生效率。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1野生型甲酸脱氢酶的构建
全基因合成来源于红球菌属(Rhodococcus sp.JT-3)的甲酸脱氢酶(WP_158171102.1)的核苷酸序列(序列如SEQ ID NO.2所示，由常州基宇生物技术有限公司合成)，经限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ(购自New England Biolabs公司，根据说明书进行操作)酶切后重组到载体pET 28a(+)中，再转化到Tran5α感受态(购自全式金公司)中。
将E.coli Tran5α置于LB液体培养基中，37℃、160rpm下振荡培养过夜。提取重组质粒FDH-pET28a(+)，转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞(全式金公司)中，得到表达野生型甲酸脱氢酶的重组大肠杆菌。
实施例2通过随机突变PCR构建FDH随机突变文库
以序列SEQ ID NO.2为模板，应用安捷伦GeneMorph II Random Mutagenesis Kit构建随机突变库，正向引物FDH-NdeⅠ-F的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物FDH-XhoⅠ-R的序列如SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.3：5’-GAATTCCATATGGCTAAAGTTCTGTGCGTTCTGT-3’；
SEQ ID NO.4：5’-CCGCTCGAGTTAACGCTGTTTGAATTTAGCAGCT-3’。
PCR反应体系如下：
PCR程序如下：
95℃2min；
95℃30s，55℃30s，72℃90s，30个循环；
72℃10min。
扩增结束后进行凝胶电泳检测，胶回收1.2kb处的随机突变片段，经限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ(购自New England Biolabs公司，根据说明书进行操作)酶切后重组到载体pET28a(+)中，再转化到大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞(全式金公司)中，涂布于含50μg/mL卡拉霉素的LB平板，获得FDH的突变文库。再采用菌落PCR技术检测阳性率，同时随机挑取10个转化子进行测序分析，估算突变文库的突变率。再以上一轮获得的最优突变体为模板进行下一轮的定向进化。
实施例3：突变文库的高通量筛选
用灭菌牙签挑取突变子至每孔含有300μL LB培养基的96深孔板中，于37℃、220r/min过夜培养，取50μL过夜培养液接种至每孔含有600μL LB培养基的96深孔板中培养3～4h(OD600约为1)，再加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，25℃诱导24h。然后在4000×g离心力下离心10min，收集细胞。将离心收集之后的96孔板每孔加200μL溶菌缓冲液(pH＝7.5，100mmol/L PBS，750mg/L Lysozyme和10mg/L DNase)，置于振荡器上剧烈振荡使细胞悬浮，然后将细胞悬浮液置于37℃反应1h，4000×g下离心10min，吸取上清酶液进行筛选。
高通量筛选的反应体系如下:3mmol/L甲酸钠，0.4mmol/L NAD+，酶液10μL，pH＝7.5的100mmol/L PBS缓冲液，共计200μL，30℃下在全波长扫描式多功能微孔板读数仪中测各孔1min内OD340的变化值，筛选出对甲酸钠活性最高的突变体，并进行测序分析。
从随机突变库中，对反应酶活较高的突变体克隆进行测序，经测序发现，突变位点包括这些位点的氨基酸的替换导致突变体的酶活力的显著变化。通过对氨基酸位点进行突变，获得如表1所示的突变菌株。
表1
| 突变株 | 突变位点 |
| FDH | -- |
| FDH 1 | K212L |
| FDH 2 | A347V |
| FDH 3 | K212L+A347V |
实施例4：FDH及其突变体酶活性测定
将含有FDH-pET28a及其突变体重组质粒的E.coli BL21(DE3)接种至含50mg/L硫酸卡那霉素的LB培养基中，于37℃200rpm转速的恒温摇床中培养过夜。取培养液按1％的接种量接种至新鲜的含50mg/L硫酸卡那霉素的LB培养基中，于37℃200rpm转速的恒温摇床中培养至OD600数值为0.6～0.8，加入终浓度为0.1mmol的IPTG，25℃继续培养16h，诱导FDH及其突变体表达。
于4℃、10000rpm离心10min收集菌泥，重悬于磷酸钠缓冲液(50mM，pH 7.5)中，冰浴中超声破碎细胞(工作4s、间歇4s，超声10min)，于4℃、10000rpm离心10min收集上清酶液，使用Ni-NTA亲和层析法(上海生工)纯化FDH及其突变体，获得纯酶液。
酶活测定方法采用NADH比色法进行。酶活测定的反应体系为1mL，包含1mmol/LNAD+、6mmol/L甲酸钠、100mmol/L pH＝7.5PBS缓冲液，30℃保温2min后加入100μL稀释适当倍数的酶液，测定1min内340nm下吸光度的变化值。在该条件下，每分钟产生1μmol NADH所需的酶量定义为1U。酶活U＝EW·V·1000/6220·L＝EW/6.22。EW为1min下OD340的变化值，V为反应液的体积(mL)，6220为摩尔消光系数(L/(mol·cm))，L为光程距离(cm)。
测定结果如表2所示。由表2可以看出，相比于原始的甲酸脱氢酶，突变体的酶活均有显著提升，相对酶活均在125％以上，甚至高达400％。上述结果表明本发明通过在甲酸脱氢酶中引入突变，成功提高了酶的反应活性，具有重要的实际应用价值。
表2
| 突变株 | 酶活(U/mg) |
| FDH | 12 |
| FDH1 | 15 |
| FDH2 | 25 |
| FDH3 | 50 |
实施例5
向100mL反应釜中加入去离子水50g，开启搅拌，加入NAD+10g，再加入甲酸钠3.1g，体系温度保持在20℃，物料充分溶解后，以20％氢氧化钠调节体系pH值8.5，加入FDH3的酶液0.3g，反应开始计时，随着反应进行体系pH值不断降低，在整个反应过程中以20％氢氧化钠维持体系pH值在8.0-8.5之间，反应8h，取样中控，通过HPLC检测NADH的含量，然后计算NADH的收率(NADH的收率＝NADH产量/NAD+转化成NADH的理论最大产量)，结果显示反应收率为98.5％。
实施例6
向100mL反应釜中加入去离子水50g，开启搅拌，加入NAD+10g，再加入甲酸钠5.0g，体系温度保持在35℃，物料充分溶解后，以20％氢氧化钠调节体系pH值9.0，加入FDH3的酶液0.1g，反应开始计时，随着反应进行体系pH值不断降低，在整个反应过程中以20％氢氧化钠维持体系pH值在8.0-9.0之间，反应20h，取样中控，结果显示反应收率为98.9％。
实施例7
向100mL反应釜中加入去离子水50g，开启搅拌，加入NAD+10g，再加入甲酸钠1.5g，体系温度保持在25℃，物料充分溶解后，以20％氢氧化钠调节体系pH值8.0，加入FDH3的酶液0.3g，反应开始计时，随着反应进行体系pH值不断降低，在整个反应过程中以20％氢氧化钠维持体系pH值在8.0-9.0之间，反应14h，取样中控，结果显示反应收率为97.2％。
实施例8
向100mL反应釜中加入去离子水50g，开启搅拌，加入NAD+10g，再加入甲酸钠3.3g，体系温度保持在20℃，物料充分溶解后，以20％氢氧化钠调节体系pH值8.0，加入FDH1的酶液0.5g，反应开始计时，随着反应进行体系pH值不断降低，在整个反应过程中以20％氢氧化钠维持体系pH值在8.0-9.0之间，反应10h，取样中控，结果显示反应收率为96.8％。
实施例9
向100mL反应釜中加入去离子水50g，开启搅拌，加入NAD+10g，再加入甲酸钠3.3g，体系温度保持在20℃，物料充分溶解后，以20％氢氧化钠调节体系pH值8.0，加入FDH2的酶液0.3g，反应开始计时，随着反应进行体系pH值不断降低，在整个反应过程中以20％氢氧化钠维持体系pH值在8.0-9.0之间，反应10h，取样中控，结果显示反应收率为97.2％。
实施例10
向100mL反应釜中加入去离子水50g，开启搅拌，加入NAD+10g，再加入甲酸钠1g，体系温度保持在20℃，物料充分溶解后，以20％氢氧化钠调节体系pH值8.0，加入FDH2的酶液0.2g，反应开始计时，随着反应进行体系pH值不断降低，在整个反应过程中以20％氢氧化钠维持体系pH值在8.0-9.0之间，反应15h，取样中控，结果显示反应收率为92.3％。
实施例11
向100mL反应釜中加入去离子水50g，开启搅拌，加入NAD+10g，再加入甲酸钠10g，体系温度保持在20℃，物料充分溶解后，以20％氢氧化钠调节体系pH值9.0，加入FDH1的酶液0.4g，反应开始计时，随着反应进行体系pH值不断降低，在整个反应过程中以20％氢氧化钠维持体系pH值在8.0-9.0之间，反应24h，取样中控，结果显示反应收率为97.8％。
对比例1
向100mL反应釜中加入去离子水50g，开启搅拌，加入NAD+10g，再加入甲酸钠3.3g，体系温度保持在20℃，物料充分溶解后，以20％氢氧化钠调节体系pH值8.0，加入野生型FDH的酶液0.3g，反应开始计时，随着反应进行体系pH值不断降低，在整个反应过程中以20％氢氧化钠维持体系pH值在8.0-9.0之间，反应10h，取样中控，结果显示反应收率为65.7％。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的甲酸脱氢酶突变体及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种甲酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲酸脱氢酶突变体为在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上发生了氨基酸突变的甲酸脱氢酶；
所述氨基酸突变的类型包括K212L和/或A347V。
2.根据权利要求1所述的甲酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲酸脱氢酶的编码序列包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的甲酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述甲酸脱氢酶来源于红球菌属Rhodococcus sp.JT-3。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-3中任一项所述的甲酸脱氢酶突变体。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求4所述的核酸分子。
6.一种甲酸脱氢酶突变体转化子，其特征在于，所述甲酸脱氢酶突变体转化子为表达如权利要求1-3中任一项所述的甲酸脱氢酶突变体的基因工程菌株；
优选地，所述甲酸脱氢酶突变体转化子含有如权利要求4所述的核酸分子；
优选地，所述甲酸脱氢酶突变体转化子含有如权利要求5所述的表达载体；
优选地，所述基因工程菌株包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌或毕氏酵母中的任意一种。
7.一种如权利要求1-3中任一项所述的甲酸脱氢酶突变体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
利用全基因合成来源于红球菌属Rhodococcus sp.JT-3的甲酸脱氢酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示；以SEQ ID NO.2序列为模板，进行PCR扩增，获得随机突变片段，经酶切重组到表达载体，转化到宿主细胞中进行培养获得突变文库，对突变文库进行高通量筛选，获得所述甲酸脱氢酶突变体；
优选地，所述进行PCR扩增时正向引物FDH-NdeⅠ-F的序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物FDH-XhoⅠ-R的序列如SEQ ID NO.4所示；
优选地，所述载体选用pET系列载体，优选为pET28a(+)；
优选地，所述宿主细胞为BL21(DE3)。
8.一种如权利要求1-3中任一项所述的甲酸脱氢酶突变体在NADH再生和制备反应中的应用。
9.一种NADH的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
将甲酸脱氢酶突变体添加至含有NAD+和甲酸钠的混合液中反应，获得含有NADH的反应液，得到NADH。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述NAD+和甲酸钠的质量比为1:1-10:1；
优选地，所述甲酸脱氢酶突变体的用量为NAD+的重量的1％-5％；
优选地，所述混合液的pH为8.0-9.0；
优选地，所述反应的温度为20-40℃，反应的时间为8-24小时。
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