CN117797176A - 双胞梭菌在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用和一种药物 - Google Patents
双胞梭菌在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用和一种药物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了双胞梭菌的应用和一种药物，属于生物医药技术领域，所述应用为以下（a1）和/或（a2）和/或（a3）和/或（a4）：（a1）双胞梭菌在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用；（a2）双胞梭菌在制备治疗2型糖尿病药物中的应用；（a3）双胞梭菌在制备降低血清中谷丙转氨酶和天冬氨酸氨基转移酶含量药物中的应用；（a4）双胞梭菌在制备治疗降低肝脏中甘油三酯含量药物中的应用。本发明将非酒精性脂肪肝的日常治疗需求与肠道共生菌易获取的特点有机结合，提出用双胞梭菌治疗非酒精性脂肪肝，解决了非酒精性脂肪肝药物疗法中存在的实际且迫切的问题，在代谢类疾病的临床预防和治疗方面具有潜在应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种药物应用，尤其涉及一种双胞梭菌在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用和一种药物。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种十分常见的肝脏疾病，影响高达25%的世界人口。过量的能量代谢底物、脂肪酸(FAs)和碳水化合物超过肝脏的处理能力，导致活性氧(ROS)、副产物和脂质过氧化的加剧形成，这将导致肝细胞损伤、炎症和死亡。代谢综合征的胰岛素抵抗是指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄入和利用效率下降，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。尽管非酒精性脂肪肝和2型糖尿病这一系列疾病是世界范围内常见的代谢综合征，但全世界缺乏全面的应对措施。非酒精性脂肪肝和2型糖尿病的患病率仍呈现逐年上升趋势，为此，迫切需要寻找新的且稳定可靠的治疗方法。
肠道微生物群主要包括细菌、真菌、病毒以及原生生物，是宿主代谢稳态和能量平衡的重要调节因子。此外，肠道微生物群的活动产生特定的微生物相关代谢物。肝脏与肠道之间由门静脉相连，肠道微生物及其相关代谢物可通过门静脉到达肝脏，这种关系通常被称为“肠-肝”轴。与健康个体相比，非酒精性脂肪肝和二型糖尿病患者的肠道微生物组呈现出失调的现象。肠道微生物组及其相关代谢物的改变与代谢类疾病的发展密切相关。因此，靶向肠道微生物群及其相关代谢物被认为是代谢综合征防治的重要新策略。
健康的肠道共生微生物群通过自身消化、从食物成分中获取能量、外源性降解和产生水溶性微生物以及代谢物来对宿主产生有益作用。这些微生物行为可以促进肠道屏障完整性，改善肠道上皮功能，并提高宿主对病原微生物的抵抗能力。益生菌通过改善宿主进入肠道后的肠道微生物平衡，可以对宿主产生有益的健康影响。有报道益生菌治疗，乳酸杆菌给药小鼠，能够缓解高脂饮食喂养小鼠脂肪细胞增大和体脂异常，并且减少脂肪量，最终限制体重过高以及胰岛素抵抗的产生。另外，有研究表明，灌胃假儿茶芽孢杆菌菌株CECT7765可以通过减少肥胖小鼠肠细胞中的较大脂肪细胞和脂肪胶束的数量，从而缓解肝脂肪变性，进而改善代谢和免疫性肥胖。在细菌相关代谢物方面，已报道肠道细菌能够发酵人类难以消化的碳水化合物（如膳食纤维）进而产生短链脂肪酸（SCFAs）和琥珀酸盐等重要代谢物，其通过增加能量消耗、增加厌食激素的产生和改善食欲调节来预防肥胖。
发明内容
本发明提供双胞梭菌在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用和一种药物，以克服现有技术的缺陷。
为实现上述目的，本发明提供一种双胞梭菌的应用，具有这样的特征：所述应用为以下（a1）和/或（a2）和/或（a3）和/或（a4）：（a1）双胞梭菌在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用；（a2）双胞梭菌在制备治疗2型糖尿病药物中的应用；（a3）双胞梭菌在制备降低血清中谷丙转氨酶和天冬氨酸氨基转移酶含量药物中的应用；（a4）双胞梭菌在制备治疗降低肝脏中甘油三酯含量药物中的应用。
本发明还提供一种药物，具有这样的特征：其活性成分为双胞梭菌；所述药物的功能为以下（b1）和/或（b2）和/或（b3）和/或（b4）：（b1）治疗非酒精性脂肪性肝病；（b2）治疗2型糖尿病；（b3）降低血清中谷丙转氨酶和天冬氨酸氨基转移酶含量；（b4）降低肝脏中甘油三酯含量。
进一步，本发明提供一种药物，还可以具有这样的特征：其中，所述双胞梭菌的单次给药剂量为1×106个/26-33g。
进一步，本发明提供一种药物，还可以具有这样的特征：其中，所述药物中还包括其他药学上可接受的载体和辅料。
进一步，本发明提供一种药物，还可以具有这样的特征：其中，所述药物为医学药剂学上常用药物制剂。
进一步，本发明提供一种药物，还可以具有这样的特征：其中，所述药物制剂选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂中的一种。
进一步，本发明提供一种药物，还可以具有这样的特征：其中，所述药物的给药方式为口服给药或注射给药。
本发明的有益效果在于：本发明双胞梭菌在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用，具体的，双胞梭菌可以缓解非酒精性脂肪肝带来的体重升高、肝脏病变以及胰岛素抵抗。本发明将非酒精性脂肪肝和2型糖尿病的日常治疗需求与肠道共生菌易获取的特点有机结合，着眼于解决非酒精性脂肪肝和2型糖尿药物疗法中存在的实际且迫切的问题，提出用双胞梭菌治疗非酒精性脂肪肝和2型糖尿，为后续应用于非酒精性脂肪肝和2型糖尿病治疗药物提供储备，在代谢类疾病的临床预防和治疗方面具有潜在应用价值。
具体的，双胞梭菌可以通过降低肠道通透性、改变肠道微生物组成、降低血清中LPS水平、下调肝脏炎症因子从而减少脂肪肝炎症和肝细胞损伤，进一步降低血清中谷丙转氨酶和天冬氨酸氨基转移酶含量；双胞梭菌可以上调脂肪分解和脂肪酸氧化相关基因的表达以及下调脂肪的从头合成来降低肝脏中甘油三酯水平。此外，双胞梭菌可以直接通过定植于肠上皮上，消耗葡萄糖，阻止葡萄糖被肠道吸收，从而减少血液中中的葡萄糖含量，并且可以形成菌群屏障，抵御有害菌对胰岛的入侵，阻断炎症。同时，非酒精性脂肪肝常伴随2型糖尿病的发生，内脏脂肪组织胰岛素抵抗是导致肝脏脂肪异位的重要原因之一，双胞梭菌可以通过其细胞因子和代谢产物进入血液循环，减少内脏脂肪积累减少胰岛素抵抗的发生，并减少游离脂肪酸和胆固醇进入肝脏合成甘油三酯，从而减少肝脏炎症以及胰岛素抵抗的发生。
附图说明
图1是双胞梭菌的治疗模式图；
图2是实验分组及构建模型方法示意图；
图3是各分组小鼠持续治疗12周的体重曲线图；
图4是各分组小鼠的肝切片苏木精和伊红染色图；
图5是各分组小鼠的血清生化指标柱状图；
图6是各分组小鼠的葡萄糖耐量及胰岛素敏感性实验结果图；
图7是各分组小鼠的肝脏中甘油三酯含量图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本实施例提供双胞梭菌的以下应用，包括：双胞梭菌在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用；双胞梭菌在制备治疗2型糖尿病药物中的应用；双胞梭菌在制备降低血清中谷丙转氨酶和天冬氨酸氨基转移酶含量药物中的应用；双胞梭菌在制备治疗降低肝脏中甘油三酯含量药物中的应用。双胞梭菌的治疗模式如图1所示。
药效实验如下：
小鼠饲养：6-8周龄健康雄性C57BL / 6小鼠（来自南京卡文斯生物技术有限公司），饲养在南京大学医学院的常规和无病原体设施中。所有小鼠均为SPF级，饲养条件为温度23±2℃，湿度为55±5℃。采取12小时光照/黑暗交替，保证小鼠正常饮水。小鼠饮食和研究符合ARRIVE指南清单2.0的各个方面要求。购买小鼠后用维持饲料适应性喂养一周后用于实验。实验方法遵循江苏省实验动物管理委员会的相关规定。所有实验步骤都得到了南京大学医学院动物实验伦理标准委员会的批准。
分组：如图2所示，小鼠适应性喂养后（26-33g）均分为4组（n≥5）：普通饮食组，又叫对照组，采用小鼠维持饲料喂养，不作其它处理；高脂饮食组，又叫模型组，采用60%脂肪功能的高脂饲料（购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司）喂养；第三组（高脂饮食+磷酸盐缓冲液）和第四组（高脂饮食+双胞梭菌）进行和模型组相同的饮食，另外每隔一天灌胃一次双胞梭菌（1×106个（人给药剂量为1×109~5×109个），购于宁波泰斯拓生物技术有限责任公司，菌种号：DSM 5521）以及等体积的磷酸盐缓冲液进行治疗，治疗持续12周。
每周对所有小鼠进行称重并记录，结果如图3所示。从图3可以看出，与正常饮食的正常小鼠相比，高脂饮食组小鼠表现出体重上的显著增加，灌胃双胞梭菌的高脂饮食小鼠体重明显得到改善，体重有统计学差异（p<0.05）。
组织取样：第12周时，小鼠摘眼球取外周血，置于1.5mL无酶EP管中静置30分钟，然后2000rpm离心20分钟，血清50μL/管分装到200μL EP管，存放于-80℃。取血后，小鼠因颈椎脱位而被安乐死。将肝脏精确解剖，进行后续的称量、拍照、切分等处理，并储存于-80℃等待进一步的分析。
H&E染色和油红染色：取小鼠黄豆粒大小的肝脏固定在4%多聚甲醛中，包埋在石蜡中，制成石蜡切片，然后用苏木精和伊红（H&E）以及油红染色，在显微镜（Nikon ECLIPSETi-U）下观察组织形态并拍照，结果如图4所示。肝切片苏木精和伊红染色的代表图像反映非酒精性脂肪肝病变程度，与正常饮食组相比，高脂饮食组肝细胞产生了明显的气球样变和脂肪变性，双胞梭菌治疗后发生明显改善。
使用丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒，在全自动生化分析仪上进行检测，结果如图5所示。从图5可以看出，与正常饮食组相比，高脂饮食组小鼠血清中谷丙转氨酶和天门冬氨酸氨基转移酶含量显著上升，灌胃双胞梭菌的高脂饮食小鼠经治疗后血清中谷丙转氨酶和天门冬氨酸氨基转移酶含量下降，血清谷丙转氨酶和天门冬氨酸氨基转移酶水平具有统计学意义（p<0.05）。研究发现，双胞梭菌可以通过降低肠道通透性、改变肠道微生物组成、降低血清中LPS水平、下调肝脏炎症因子从而减少脂肪肝炎症和肝细胞损伤，进一步降低血清中谷丙转氨酶和天冬氨酸氨基转移酶含量。
葡萄糖耐受测定：小鼠禁食 12 小时，禁食完成后测体重，尾静脉取血测空腹血糖，腹腔注射10%葡萄糖溶液(1g/kg)，在30 分钟、60 分钟 及 120 分钟时尾静脉取血进行血糖测定，结果如图6所示。
胰岛素耐量实验：小鼠测量体重后，尾静脉取血测定血糖，腹腔注射0.5U/kg胰岛素溶液，在30分钟、60分钟及120分钟时尾静脉取血进行血糖测定，结果如图6所示。
图6反映了葡萄糖耐量及胰岛素敏感性，与正常饮食组相比，高脂饮食组小鼠产生葡萄糖耐受和胰岛素抵抗，灌胃双胞梭菌的高脂饮食小鼠经治疗后葡萄糖耐受和胰岛素抵抗得到缓解（p<0.05）
肝脏甘油三酯测定：使用普利莱组织细胞甘油三酯（TG）酶法测定试剂盒（E1013-105）检测小鼠肝脏中甘油三酯含量，结果如图7所示。从图7可以看出，与正常饮食组相比，高脂饮食组小鼠肝脏中甘油三酯含量显著上升，高脂饮食小鼠经双胞梭菌治疗后肝脏中甘油三脂含量下降。研究发现，双胞梭菌可以上调脂肪分解和脂肪酸氧化相关基因的表达以及下调脂肪的从头合成来降低肝脏中甘油三酯水平。
本发明的双胞梭菌可以制成医学药剂学上常用药物制剂，选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂中的一种。各种剂型可以根据药物制剂领域的常规工艺制备而成。给药方式为口服给药或注射给药，具体的给药时间、给药次数和给药频率等，需要根据病情的具体诊断结果而定，这在本领域技术人员掌握的技术范围之内。将对动物的治疗方案应用于人体上，所有药物对人的有效剂量可以通过该药物对动物的有效剂量进行换算，这对于本领域的普通技术人员而言也是容易实现的。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的试剂、材料和操作步骤均为相应领域内广泛使用的试剂、材料和常规步骤。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.双胞梭菌的应用，其特征在于：
所述应用为以下（a1）和/或（a2）和/或（a3）和/或（a4）：
（a1）双胞梭菌在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用；
（a2）双胞梭菌在制备治疗2型糖尿病药物中的应用；
（a3）双胞梭菌在制备降低血清中谷丙转氨酶和天冬氨酸氨基转移酶含量药物中的应用；
（a4）双胞梭菌在制备治疗降低肝脏中甘油三酯含量药物中的应用。
2.一种药物，其特征在于：
其活性成分为双胞梭菌；
所述药物的功能为以下（b1）和/或（b2）和/或（b3）和/或（b4）：
（b1）治疗非酒精性脂肪性肝病；
（b2）治疗2型糖尿病；
（b3）降低血清中谷丙转氨酶和天冬氨酸氨基转移酶含量；
（b4）降低肝脏中甘油三酯含量。
3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于：
其中，所述双胞梭菌的单次给药剂量为1×106个/26-33g。
4.根据权利要求2所述的药物，其特征在于：
其中，所述药物中还包括其他药学上可接受的载体和辅料。
5.根据权利要求2所述的药物，其特征在于：
其中，所述药物为医学药剂学上常用药物制剂。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于：
其中，所述药物制剂选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂中的一种。
7.根据权利要求2所述的药物，其特征在于：
其中，所述药物的给药方式为口服给药或注射给药。
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