CN117778593A - 一种用于鉴定少棘巨蜈蚣及其遗传性别的分子标记 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定少棘巨蜈蚣及其遗传性别的分子标记，包括两个可鉴定蜈蚣遗传性别的分子标记和一个能特异性识别少棘巨蜈蚣的分子标记，前者的引物序列如SEQ ID NO:4、5或SEQ ID NO:6、7所示，后者的引物序列如SEQ ID NO:8、9所示。本发明为少棘巨蜈蚣的物种和遗传性别鉴定提供了可靠材料和方法，可用于全生长周期特别是处于早期阶段的少棘巨蜈蚣鉴定，在蜈蚣性别分化机制及其基础研究和养殖生产中具有重要的意义，本发明还具有操作简单、耗时短、成本低、准确性高等优点。
Description
技术领域
本发明属于中药材分子鉴定领域，具体涉及一种用于鉴定陆生节肢动物蜈蚣属少棘巨蜈蚣(Scoropendra subspinipes mutilans)及其遗传性别的特异性分子标记及其方法。
背景技术
少棘巨蜈蚣(Scoropendra subspinipes mutilans)俗称中国红头蜈蚣，为节肢动物门(Arthropoda)，唇足纲(Chilopoda)，蜈蚣科(Scolopendridae)，蜈蚣属(Scolopendra)，少棘巨蜈蚣分布广泛，从亚洲、印度洋诸岛、南美洲乃至加勒比海域都有它们的身影，是东南亚等国家常用的重要动物药之一。少棘巨蜈蚣在我国的湖北、浙江、湖南、安徽、河南、江苏、陕西、台湾等地均有分布。
少棘巨蜈蚣有良好药用价值，辛，温。有毒，含两种类似蜂毒的有当成分，即组胺类物质和溶血蛋白质，具有熄风镇痉，攻毒散结，通络止痛等功能，是《中国药典》中药用蜈蚣的唯一基源物种。由于少棘巨蜈蚣繁殖系数高、药效好、生长速度快、市场需求广、还有较高经济价值，在中国多地都会捕捉天然少棘巨蜈蚣作为额外收入来源，同时也有更多的农民开展人工养殖少棘巨蜈蚣，将其作为药材销往全国各地以及东南亚各国。少棘巨蜈蚣雌性蜈蚣一次受孕便可终身产卵，且相比于雄性蜈蚣雌性蜈蚣个头更大，生长速度更快，在少棘巨蜈蚣的质量评价中以长度为划分优等品的指标，雌性蜈蚣往往由于个头更大被列为优等品。
目前国内外有关少棘巨蜈蚣的报道涉及蜈蚣的药理作用研究、种群分布特征、蛋白组学探究、毒液的作用及活性成分探究、人工养殖方法的探究、分子标记的开发等多个方面。但是目前有关其基因组方面的研究不足，通过基因组重测序筛选多态性遗传分子标记的技术手段应用不是特别广泛，当前并没有结合分子标记的方法用于鉴定少棘巨蜈蚣性别的方法，现在的生产实践只能通过形态学方法鉴定少棘巨蜈蚣的性别，鉴别准确性低，且对蜈蚣个体伤害大，并存在一定的风险，对操作者有一定的经验及技术要求，并且难以鉴定处于生长发育早期的少棘巨蜈蚣的性别。
SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多样性，其数量很多，多态性丰富。SNP作为第三代遗传分子标记，目前已经在很多物种的遗传多样性分析；分子标记辅助育种；疾病基因的定位、克隆和鉴定；功能基因组学的研究中得到了广泛的应用。
因此本研究的顺利开展有利于推进少棘巨蜈蚣人工养殖繁育的研究及少棘巨蜈蚣性别差异基础的研究和养殖技术的发展，有助于提高养殖产量，提高经济收益，创造更多的附加产值，推动少棘巨蜈蚣的资源保护、开发与利用。探究其性别差异形成的分子基础，促进少棘巨蜈蚣养殖业的综合发展。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术在鉴定少棘巨蜈蚣物种及其遗传性别方面存在的缺陷，提供一种新的分子鉴定方法及用于该方法的分子标记。
为实现上目的，申请人通过对已知性别雌雄蜈蚣个体进行DNA提取，构建重测序基因组文库并进行高通量测序，然后进行序列分析及特异性SNP位点的筛选，接着对候选SNP位点进行扩大样本验证，得到了三个特异性分子标记位点，这三个位点中有两个可识别雌、雄蜈蚣，另一个可区分少棘巨蜈蚣与其他蜈蚣属物种。最后，针对三个分子标记位点分别设计了特异性引物，于是实现本发明。
具体技术方案如下：
一种用于鉴定少棘巨蜈蚣及其遗传性别的分子标记，包括可鉴定少棘巨蜈蚣遗传性别的分子标记和能特异性识别少棘巨蜈蚣的分子标记，用于扩增所述分子标记的引物序列为：
(1)可鉴定少棘巨蜈蚣遗传性别的分子标记引物：
引物1：扩增片段长度418bp
正向引物27-F：5'-CTCCTCCATCATTCCTT-3'(SEQ ID NO:4)
反向引物27-R：5'-TTGCTGCCAGACTTTAC-3'(SEQ ID NO:5)
引物2：扩增片段长度260bp
正向引物21-f：5'-TAAGATGCCAAGAGTATG-3'(SEQ ID NO:6)
反向引物21-r：5'-ACCACCATCAAATTATCA-3'(SEQ ID NO:7)
以上两对引物任选其中一对即可实现少棘巨蜈蚣遗传性别的鉴定。
(2)能特异性识别少棘巨蜈蚣的分子标记引物：
引物3：扩增片段长度425bp
正向引物27-f：5'-TCTCCTCCATCAATCACT-3'(SEQ ID NO:8)
反向引物27-r：5'-CTGCCAGACTTTACGAAT-3'(SEQ ID NO:9)
其中，引物1的设计是根据即雌性蜈蚣(SEQ ID NO：1)与雄性个体相比，一条染色体序列的SNP有9个碱基的缺失(SEQ ID NO：3波浪线碱基)，我们使用primer 5在杂合子中设计一对特有引物用于特异性识别雌性蜈蚣的特有片段SEQ ID NO：1中前17位碱基为正向引物的序列，第402位至第418位为反向引物序列设计出引物1，该引物在雌性少棘巨蜈蚣能特异性扩增出电泳条带，而雄性蜈蚣由于片段的保守性缺失，不能被扩增出来。
引物2的设计是根据杂合SNP位点为SEQ ID NO：2的第1001位，即雌雄个体均含有REF碱基C，在雌性个体中既含有碱基C还有雌性个体特有的碱基T，我们将其作为反向引物3'的最后一个碱基，根据ARMS-PCR技术在其特异性SNP位点相邻碱基进行碱基错配由TA改为TG(SEQ ID NO：2)，使用primer primer 5设计出特异性识别雌性蜈蚣的引物2。
引物3的设计是根据少棘巨蜈蚣雌雄均有的序列即SEQ ID NO：3中前18位碱基为正向引物的序列，第407位至第425位为反向引物序列设计出引物3。
使用上述分子标记及其引物可实现少棘巨蜈蚣及其遗传性别的鉴定，本发明进一步提供一种用于鉴定少棘巨蜈蚣及其遗传性别的试剂盒，该试剂盒含有所述的分子标记引物，具体而言，该试剂盒中含有以上所述的引物3以及引物1、引物2中的任意一对。
本发明继续提供了一种鉴定少棘巨蜈蚣及其遗传性别的方法，该方法包括以下步骤：
1)提取样品的基因组DNA；
2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，用所述的能特异性识别少棘巨蜈蚣的分子标记引物进行PCR扩增；
3)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，用所述的可鉴定少棘巨蜈蚣遗传性别的分子标记引物进行PCR扩增；
4)对步骤2)和3)的PCR扩增产物进行凝胶电泳检测。
若步骤2)的PCR扩增产物有凝胶电泳条带，则鉴定为少棘巨蜈蚣而非其他蜈蚣属物种；若步骤3)的PCR扩增产物有凝胶电泳条带，则鉴定为雌性蜈蚣而非雄性蜈蚣。
本发明的有益效果是：
与现有技术相比，本发明通过雌雄个体少棘巨蜈蚣基因组重测序评估少棘巨蜈蚣性别特异的SNP位点并进行验证，为少棘巨蜈蚣性别决定及性别分化的研究提供重要支持。根据特异性的SNP位点设计雌性特异性引物进行扩增，使得以后对少棘巨蜈蚣的性别鉴定只需要通过PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，检测雌性特异性条带有无即可判定其性别。该结果可为少棘巨蜈蚣的遗传性别的鉴定提供可靠方法，可根据其遗传性别对少棘巨蜈蚣全生长周期特别是处于早期阶段的少棘巨蜈蚣进行性别鉴定，在对少棘巨蜈蚣性别分化机制原理及其基础研究和养殖生产具有重要的作用。本发明还具有操作简单、耗时短、成本低廉、重复性好、准确性高等优点。
附图说明
图1是引物1的退火温度验证试验结果，418bp处的条带为利用引物1扩增得到的目的条带，最佳退火温度为50.5℃。
图2是引物2的退火温度验证试验结果，260bp处的条带为利用引物2扩增得到的目的条带，最佳退火温度为44.5℃。
图3是引物1对少棘巨蜈蚣进行批量验证的试验结果，结果显示所筛选的引物专一性好，结果准确可靠。
图4是引物2对少棘巨蜈蚣进行批量验证的试验结果，结果显示所筛选的引物专一性好，结果准确可靠。
图5是引物3对少棘巨蜈蚣雌雄个体的批量验证试验结果，425bp处的条带为利用引物3扩增得到的目的条带。
图6是引物3对蜈蚣属多棘蜈蚣，哈氏蜈蚣，海南蜈蚣，越南巨人蜈蚣，马氏蜈蚣，日本蜈蚣，禄丰蜈蚣等个体的验证试验结果，蜈蚣属其他物种雌雄个体均无条带，说明该引物能够特异性识别少棘巨蜈蚣，并与其它混伪同属物种快速区分鉴别。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明仅需详细说明。
实施例1分子标记位点的筛选
1.样本采集及其基因组DNA的提取
采集到的少棘巨蜈蚣样本20只，其中雌雄样本各10只。取少棘巨蜈蚣的爪50mg左右，放入盛有300μL裂解液的1.5ml离心管，剪碎至匀浆状态采用改良的CTAB法进行DNA提取，用0.75％的琼脂糖凝胶进行电泳检测DNA片段大小和DNA降解程度，使用NanoDrop One分光光度计(Thermo Fisher Scientific)检测DNA纯度，检测OD260/280比值在1.8-2.2之间，无蛋白质和肉眼可见杂质污染；Qubit 3.0荧光仪(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)检测DNA浓度，检测浓度大于50ng/μl，总量大于2ug，低温保存备用。
2.重测序文库构建及高通量测序
DNA样品检测合格后，使用Covaris超声波破碎仪打断，打断后的样品磁珠进行片段选择，使得样品条带集中在200-400bp左右。再经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增、PCR产物环化等步骤完成整个文库制备工作。文库构建完成后，先使用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段进行检测，插入片段大小符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。检测合格文库安排上机测序(DNBSEQ)：单链环状DNA分子通过滚环复制，形成一个包含300多个拷贝的DNA纳米球(DNB)。将得到的DNBs采用高密度DNA纳米芯片技术，加到芯片上的网状小孔内，通过联合探针锚定聚合技术(cPAS)进行测序。
3.序列分析及性别特异SNP位点的筛选
测序得到的原始测序序列(Raw reads)，里面含有带接头的、低质量的reads，为了保证信息分析质量，必须对Raw reads过滤，得到Clean reads，后续分析都基于Cleanreads。使用fastp对下机原始数据进行质控与过滤，具体过滤标准如下：剔除序列中的接头序列，即adapter；去除reads尾部的polyG和polyX(最短长度为10bp)；以滑窗的方式统计窗口内的碱基计算平均质量值，将低质量的滑窗剪裁掉，其功能类似于Trimmomatic；剔除N个数大于5的reads；剔除质量低于15的碱基占比高于40％的reads；剔除过滤后长度低于15bp的reads。对每个样本分别进行bwa(版本：0.7.17；参数：mem)比对分析，将过滤后的Cleanreads比对到参考基因组上，统计比对情况。具体分析步骤如下：使用bwa比对软件(参数：mem-R，其余参数采用软件默认参数)，将所有样本的Clean reads与参考基因组进行比对；使用samtools(参数：sort)将比对结果从sam(Sequence Alignment/MAP)文件转为排序后的bam文件(binary Alignment/Map)；使用samtools(参数：markdup-r)对排序后的比对结果进行去除重复，用于后续的分析；使用python脚本统计比对率以及覆盖度。基于鉴定变异的结果，结合各个样本的群体信息，进行群体之间差异标记的筛选，筛选标准如下：1.该标记在群体内部完全一致；2.该标记在群体间存在差异；3.为保证基因型鉴定的准确型，过滤掉测序深度低于5X，高于100X的位点。
以下各个群体之间的差异标记筛选结果：
注：NO：位点编号；REF：参考基因组碱基类型；ALT：突变碱基类型；sample_name：群体基因型；sample_name.mean_depth：群体基因型平均测序深度；sample_name.miss_ratio：群体基因型缺失比例。
结果显示与REF相比C组雌性蜈蚣均为杂合子，D组雄性蜈蚣均为纯合子，其中加粗SNP在所有的D组中均表现为保守的纯合子与参考基因组(REF碱基类型)完全一致。即雌雄个体所有的蜈蚣，均含有加粗突变位点的REF碱基类型，而对雌性蜈蚣来说其为杂合子，除了REF的碱基类型，其还有在该位点的SNP突变碱基类型(ALT突变碱基)。最终在雌雄个体间检测到35个性别特异的SNP位点，重测序的结果最终在35个SNP中我们共得到雌性保守变异的SNP位点13个，我们选择其中的两个SNP位点进行引物设计。
实施例2分子标记引物的设计
选择编号21(SEQ ID NO：2)及编号27(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3)的两个SNP所在的序列进行引物设计。其中编号27即雌性蜈蚣(SEQ ID NO：1)与雄性个体相比，一条染色体序列有9个碱基的缺失(SEQ ID NO：3波浪线碱基)，我们使用primer 5在杂合子中设计一对特有引物用于特异性识别雌性蜈蚣的特有片段SEQ ID NO：1中前17位碱基为正向引物的序列，第402位至第418位为反向引物序列设计出引物1，该引物在雌性少棘巨蜈蚣能特异性扩增出电泳条带，而雄性蜈蚣由于片段的保守性缺失，不能被扩增出来。
编号21的杂合SNP位点为SEQ ID NO：2的第1001位即雌雄个体均含有REF碱基C，在雌性个体中既含有碱基C还有雌性个体特有的碱基T，我们将其作为反向引物3'的最后一个碱基，根据ARMS-PCR技术在其特异性SNP位点碱基T相邻碱基进行碱基错配由TA改为(TG)，使用primer primer 5设计出特异性识别雌性蜈蚣的引物2。
为了避免由于DNA模板问题导致的对未扩增出特异性条带的个体的误判，根据少棘巨蜈蚣雌雄共有的DNA片段开发出能够特异性识别少棘巨蜈蚣的引物。根据少棘巨蜈蚣雌雄均有的序列即SEQ ID NO：3中前18位碱基为正向引物的序列，第407位至第425位为反向引物序列设计出引物3。
所述引物的核苷酸序列及扩增序列片段如下(正反引物对应DNA片段已用特殊线条标注)：
SEQ ID NO：1
SEQ ID NO：2
SEQ ID NO：3
实施例3鉴别方法的建立
引物1：
27扩增片段长度418bp
正向引物27-F：5'-CTCCTCCATCATTCCTT-3'
反向引物27-R：5'-TTGCTGCCAGACTTTAC-3'
PCR体系为25μL，包括：dd水9.5μL，2X PCR taq mix 12.5μL，正反引物各1μL(10μM)，DNA模板1μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，特定50.5℃温度退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
使用2％的琼脂糖凝胶150V，400mA，25min，其中雌性蜈蚣条带明亮清晰，雄性蜈蚣无条带。
引物2：
21扩增片段长度260bp
正向引物21-f：5'-TAAGATGCCAAGAGTATG-3'
反向引物21-r：5'-ACCACCATCAAATTATCA-3'
PCR体系为25μL，包括：dd水9.5μL，2X PCR taq mix 12.5μL，正反引物各1μL(10μM)，DNA模板1μL。
所述PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，特定44.5℃温度退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
使用2％的琼脂糖凝胶150V，400mA，25min.其中雌性蜈蚣条带明亮清晰，雄性蜈蚣无条带。
引物3：
27ty扩增片段长度425bp
正向引物27-f：5'TCTCCTCCATCAATCACT 3'
反向引物27-r：5'CTGCCAGACTTTACGAAT 3'
PCR体系为25μL，包括：dd水9.5μL，2X PCR taq mix 12.5μL，正反引物各1μL(10μM)，DNA模板1μL。
所述PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，特定50.5℃温度退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
使用2％的琼脂糖凝胶150V，400mA，25min.其中少棘巨蜈蚣条带明亮清晰，其他蜈蚣属物种均无条带。
实施例4鉴别方法的验证
1.退火温度验证
按照实施例1中DNA提取方法对已知雌雄个体的蜈蚣样本进行DNA的提取，针对引物1和引物2分别设计了一系列的退火温度，并进行PCR扩增，如图1、2。根据电泳结果，引物1选取最佳退火温度为50.5℃，引物2选取最佳退火温度为44.5℃，引物3的退火温度与引物1一致为50.5℃。
2.引物1鉴定方法的验证
按照实施例1中DNA提取方法对已知雌雄个体的蜈蚣样本进行DNA的提取，利用引物1对已知雌雄的48条少棘巨蜈蚣个体进行批量验证，其中雌性蜈蚣条带明亮清晰，雄性蜈蚣无条带，结果如图3所示。
3.引物2鉴定方法的验证
按照实施例1中DNA提取方法对已知雌雄个体的蜈蚣样本进行DNA的提取，利用引物2对已知雌雄的48条少棘巨蜈蚣个体进行批量验证，其中雌性蜈蚣条带明亮清晰，雄性蜈蚣均无条带，结果如图4所示。
4.引物3鉴定方法的验证
按照实施例1中DNA提取方法对已知雌雄个体的蜈蚣样本进行DNA的提取，利用引物3，对已知雌雄的12个雌性及12个雄性少棘巨蜈蚣个体进行验证，雌雄个体条带均明亮清晰。同时使用引物3，对雌性多棘蜈蚣，哈氏蜈蚣，海南蜈蚣，越南巨人蜈蚣，马氏蜈蚣，日本蜈蚣，禄丰蜈蚣(图6上从左到右依次为2、2、3、2、2、3、2条)；雄性多棘蜈蚣，哈氏蜈蚣，海南蜈蚣，越南巨人蜈蚣，马氏蜈蚣，日本蜈蚣，禄丰蜈蚣(图6下从左到右依次为4、4、3、3、3、4、3条)均无条带，该引物可用来特异性识别少棘巨蜈蚣与其他蜈蚣属物种，结果如图5，图6所示。
Claims (6)
1.一种用于鉴定少棘巨蜈蚣及其遗传性别的分子标记，其特征在于：包括可鉴定少棘巨蜈蚣遗传性别的分子标记和能特异性识别少棘巨蜈蚣的分子标记，用于扩增所述分子标记的引物序列为：
可鉴定少棘巨蜈蚣遗传性别的分子标记引物：正向引物序列如SEQ ID NO:4所示，反向引物序列如SEQ ID NO:5所示；或正向引物序列如SEQ ID NO:6所示，反向引物序列如SEQID NO:7所示；
能特异性识别少棘巨蜈蚣的分子标记引物：正向引物序列如SEQ ID NO:8所示，反向引物序列如SEQ ID NO:9所示。
2.权利要求1所述的分子标记在鉴定少棘巨蜈蚣及其遗传性别中的应用。
3.一种用于鉴定少棘巨蜈蚣及其遗传性别的试剂盒，该试剂盒含有权利要求1中所述的分子标记引物。
4.一种鉴定少棘巨蜈蚣及其遗传性别的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)提取样品的基因组DNA；
2)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，用权利要求1中所述的能特异性识别少棘巨蜈蚣的分子标记引物进行PCR扩增；
3)以步骤1)提取的基因组DNA为模板，用权利要求1中所述的可鉴定少棘巨蜈蚣遗传性别的分子标记引物进行PCR扩增；
4)对步骤2)和3)的PCR扩增产物进行凝胶电泳检测。
5.如权利要求4所述鉴定少棘巨蜈蚣及其遗传性别的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为ddH2O 9.5μL，2X PCR taq mix 12.5μL，10μM正、反引物各1μL，DNA模板1μL。
6.如权利要求4所述鉴定少棘巨蜈蚣及其遗传性别的方法，其特征在于：若步骤2)的PCR扩增产物有凝胶电泳条带，则鉴定为少棘巨蜈蚣而非其他蜈蚣属物种；若步骤3)的PCR扩增产物有凝胶电泳条带，则鉴定为雌性蜈蚣而非雄性蜈蚣。
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