CN117778435A - 一种无可溶标签制备鼠源rna酶抑制剂的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，涉及一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，所述工艺使用优化的表达载体、表达宿主及培养基的优化组合，采用大肠杆菌蛋白表达感受态细胞Rosetta(DE3)作为宿主、pET21a作为表达载体，选用TB培养基并采用优化的培养条件进行培养，无需采用融合蛋白标签，表达的MRI的产量可达到8.93mg/L，目标蛋白活力均值可达714538U/L，其效果比现有技术采用了可溶性标签的产量和比活更高，产量提升了4‑8倍，同时避免了加减标签和包涵体复性的繁复操作和其中产生的活性丧失，缩短生产周期，节约生产成本。

Description

一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺。

背景技术

核糖核酸酶抑制剂(RNase Inhibitor，RI)是一种能够调节核糖核酸酶活性的酸性胞浆蛋白，它与核糖核酸酶(RNase)以1：1的比例结合，从而抑制RNase活性。它是一个防止潜在RNase污染的十分有效的试剂。其分子量约为50kDa，等电点为4.7左右。与人源RNaseInhibitor.相比，小鼠RNase Inhibitor不含人源蛋白中的两个对氧化非常敏感的半胱氨酸，因而具有更高的抗氧化活性。

目前，商品的RNase Inhibitor以鼠源、猪源、人源的RNase Inhibitor较为常见，但因鼠源RI抗氧化活性高，同时适合于对高DTT敏感性实验，因此在市场中较为常见。RI的获得大多采用基因重组方式在原核表达系统(如大肠杆菌)与真核表达系统(如酵母和细胞)表达两种形式，其中真核表达系统表达周期太长且成本太高，因此以大肠杆菌为宿主的重组蛋白原核表达方法更为常用。尽管原核表达的方法比真核表达节约了成本，但原核表达极易产生包涵体，RI基因在大肠杆菌中的表达产物，多数以无活性的包涵体形式存在，产生无活性蛋白产物，需要额外进行体外复性方可得到有活性的RI，而变复性工艺使用高浓度变性剂如盐酸胍、尿素等对包涵体进行溶解变性，进而进行复性，工艺复杂且进行体外折叠后复性率低。例如中国专利公开了一种RNasin的制备方法，其采用原核表达系统表达RNasin，为了提高得率在纯化过程中使用变复性工艺来增加可溶性RNasin的量。

为提升可溶表达量，研究人员开发了添加融合标签、改造工程菌等工艺方法提高重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达，减少包涵体的产生，避免了复性的繁琐工艺。例如，中国专利号CN102234649A公开了一种活性重组核糖核酸酶抑制剂的高效可溶性表达方法，公开了采用原核表达系统BL27工程菌表达小鼠核糖核酸酶抑制剂(mRI)，其在RI序列5’-端加入了TrxA硫氧还蛋白融合标签，制备后纯化得到的mRI的收取量约为1～2mg/L，比活性约为39kunits/mg。但基于融合标签可溶表达的活性蛋白后续还需要利用TEV蛋白酶处理去除TrxA标签，不仅增加了繁琐的去标签步骤，并且去除标签步骤会影响目标蛋白的活性，由此造成已表达的蛋白的活性损失。

鉴于此，开发出一种高效、可溶性表达且产量高、活性高、成本低的MRI制备工艺是是十分有必要的。

发明内容

本发明的目的在于：针对目前原核系统表达RI操作繁琐、产量和活性低的我问题，提供了一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，无需借助可溶标签，亦可大幅提升RI的可溶表达量，进而能够采用简单而低成本的方式提高RI的产量，并且制备出的RI不会再产生活性损失。

本发明的技术方案如下：

一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂工艺，包括以下步骤：

步骤S1：构建重组表达载体，所述表达载体为利用大肠杆菌质粒在NdeI和EcoRI酶切位点插入序列如SEQ ID NO.1所示的MRI基因得到重组的大肠杆菌表达质粒；

步骤S2：培养表达，将所述大肠杆菌质粒转化至大肠杆菌蛋白表达感受态细胞中获得阳性克隆，再将所述阳性克隆于生长培养基中，37℃，180-220r/min培养12-16h，再接种至诱导培养基中，16-37℃，180-220r/min培养，培养时间为4-24h；

步骤S3：分离并纯化，将所述培养菌体依次经过破菌、层析步骤获得目的蛋白。

根据一种优选的实施方式，所述大肠杆菌质粒为pET21a，所述大肠杆菌蛋白表达感受态细胞选自BL21(DE3)、BL21(DE3)-pG-Tf2、Rosetta(DE3)中的任一种。

根据一种优选的实施方式，所述MRI基因的N端或C端引入His标签。

进一步的，大肠杆菌质粒为pET21a，大肠杆菌蛋白表达感受态细胞选自BL21(DE3)、BL21(DE3)-pG-Tf2、Rosetta(DE3)中的任一一种

进一步的，生长培养基选自LB、TB培养基，诱导培养基选自LB、TB、ZYP培养基中任一一种。

进一步的，生长培养基的培养条件为37℃摇床培养12-16h。

进一步的，诱导培养基的培养条件还包括待OD为0.6-0.8时，加入诱导剂开始诱导。

进一步的，诱导剂为异丙基硫代半乳糖，其浓度范围为0.1mM/L～1.5mM/L。

进一步的，诱导温度为20℃～37℃，诱导时长为16-24h。

进一步的，接种于生长培养基的菌落为单菌落；诱导培养基上的接种量为l‰。

进一步的，层析步骤依次包括亲和层析、离子交换层析和疏水层析。

与现有的技术相比本发明的有益效果是：

1、一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，与现有增加融合标签使得目标蛋白可溶性表达的制备工艺相比，本申请的制备方法通过对表达载体、表达宿主及培养基的优化组合，使得RI大量可溶表达，制备出的产量高、活性好的RI，采用本申请的制备工艺制备出的目标蛋白活力均值可达714538U/L，即最终可以获得8.93mg/L的活性RI；其产量较现有采用了可溶标签的产量更高，且避免了繁琐的加标签和去标签步骤和活性损失，亦无需包涵体复性工艺，工艺简单，缩短了生产周期，节约生产成本，经济性好，产量高；

2、一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，本申请的制备工艺采用的培养基更适合高密度的发酵技术，纯化工艺简单，利于MRI规模化生产，极大程度上满足不断增长的研究及广泛的应用需求。

附图说明

图1为鼠核糖核酸酶抑制剂(MRI)编码基因序列构建至表达载体pET-21a的质粒图谱；

图2为鼠核糖核酸酶抑制剂(MRI)表达检测及分离后的SDS-PAGE图，其中泳道1对应诱导前菌体，泳道2对应诱导后菌体，泳道3对应诱导后破菌后的沉淀，泳道4对应诱导后破菌上清；

图3为现有技术未采用可溶标签的表达胶图；泳道1对应诱导前菌体，泳道2对应诱导后菌体，泳道3对应诱导后破菌后的沉淀，泳道4对应诱导后破菌上清；

图4为鼠核糖核酸酶抑制剂(MRI)亲和层析后的SDS-PAGE图，其中泳道1对应破菌上清，泳道2对应Ni柱亲和上样时的流穿液，泳道3对应Ni柱亲和时buffer B洗杂液，泳道4对应Ni柱亲和时buffer C洗脱液，泳道5对应Ni柱亲和时buffer D洗脱液，泳道6对应Ni柱亲和时buffer E洗脱液；

图5为鼠核糖核酸酶抑制剂(MRI)Q柱层析后的SDS-PAGE图，其中泳道1为Q柱层析前样品，泳道2为Q柱层析上样时的流穿液，泳道3为Q柱层析时buffer G洗脱液，泳道4为Q柱层析时buffer H洗脱液，泳道5为Q柱层析时buffer I洗脱液；

图6为鼠核糖核酸酶抑制剂(MRI)疏水层析后的SDS-PAGE图，其中泳道1为疏水层析前样品，泳道2为疏水层析上样时的流穿液，泳道3为疏水层析时buffer J洗杂液，泳道4为疏水层析时buffer K洗脱液，泳道5为疏水层析时buffer L洗脱液；

图7为鼠核糖核酸酶抑制剂(MRI)最终产品SDS-PAGE图，其中泳道1为最终制备的MRI，泳道2为牛血清白蛋白(BSA)；

图8为鼠核糖核酸酶抑制剂(MRI)活性检测图，泳道1：仅含有RNA；泳道2：添加RNA及RNase；泳道3-5：添加RNA、RNase及不同加量的商品RI；泳道6-8：添加RNA、RNase及不同加量的本发明MRI；

图9为鼠核糖核酸酶抑制剂(MRI)稳定性检测图，泳道1为仅含有RNA；泳道2：添加RNA及RNase；泳道3-5：添加RNA、RNase及不同加量的商品RI(-20℃保存)；泳道6-8：添加RNA、RNase及不同加量的商品RI(37℃，热加速14天)；泳道9-11：添加RNA、RNase及不同加量的本发明MRI(-20℃保存)；泳道12-14：添加RNA、RNase及不同加量的本发明MRI(37℃，热加速14天)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1：

一、鼠核糖核酸酶抑制剂(MRI)重组表达载体的构建

利用本发明方法在大肠杆菌中表达第三方基因合成公司合成的来源于人源的核糖核酸酶抑制剂基因，以后统称为(MRI)。

1.引物设计如下：

引物1：

AGAAGGAGATATACATATGAGTCTTGACATCCAGTGTGAGCAG；

引物2：

GTGGTGGTGGTGCTCGAGGGAAATGATCCTCAGGGAAGGC。

2.DNA扩增：

PCR体系为50uL，其中2×HieffPlus PCR Master Mix(With Dye)25ul，正向引物和反向引物0.2uM，模板50ng，ddH2O补足至50ul。PCR程序为98℃2min；98℃10s，58℃20s，72℃2min(30s/kb)，循环25次；72℃5min；4℃hold。跑核酸胶：核酸胶浓度为1.0％，电泳压力为100V，跑胶30min。使用omega的胶回收试剂盒进行胶回收。

3.同源重组：

首先，将pET21a质粒经限制性内切酶Nco I和EcoR I依次酶切，琼脂糖胶回收该载体；再次，使用同源重组酶(2x cloneExpress mix)2ul，分别加入质粒与待连接胶回收产物目标基因1ul，混匀后，50℃重组5min。

4.转化

将4ul重组产物，加入100ul DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热击90s，冰上放置15min，加入200ul LB，37度活化1h，最后取100ul涂板。

5.测序

将平板菌落送至第三方测序公司测序，获得测序正确的阳性克隆。质粒图谱如图1所示。

二、MRI的可溶性表达

1.重组载体扩增

首先，通过同源重组酶将目标基因与经Nco I和EcoR I酶切后的pET21a表达载体相连，得到重组载体pET21a_MRI，并将其转化至DH5α克隆感受态细胞中，于卡那霉素抗性平板涂布培养。将平板菌落送至第三方测序公司测序，获得测序正确的阳性克隆，提取阳性克隆中的重组载体。

将提取的重组载体热激转化到表达感受态细胞Rosetta(DE3)中，于相应抗性平板涂布培养，挑取单菌落，接种于相应抗性的10mL LB液体培养基中，37℃摇床培养16h，再以l‰接种量于1000mL TB培养基中接种，37℃，180-220rpm培养，待OD为0.6-0.8时，开始诱导，加入终浓度为0.5mM/L异丙基硫代半乳糖(IPTG)于扩大培养好的摇瓶中，培养条件20℃，180-220rpm，16h。发酵结束后，收集菌体，然后分离与纯化。

其中LB培养基包括1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠、50ug/mL卡那霉素、50ug/mL氯霉素等成分；

TB培养基包括包含1.2％胰蛋白胨、2.4％酵母提取物、72mM/L磷酸氢二钾、17mM/L磷酸二氢钾、0.5％甘油、50ug/mL卡那霉素、50ug/mL氯霉素等成分。

三、MRI的分离与纯化

对实施例2中在最佳培养条件下表达的MRI进行分离纯化。

1.分离

a.将菌体从-80℃冰箱中取出，加入lysis buffer(20mM Tris，300mM NaCl，5mMimidazole，1mM DTT，0.05％ Triton X-100，0.1mg/ml溶菌酶，pH 8.0)，搅拌溶解。

b.在菌液中加入终浓度为1mM的PMSF，超声破菌，破菌条件为：超声3s，暂停3s，每次超声10min，共超声3次。

c.将超声完成的菌液收集至离心杯中，12000rpm，离心20min，离心两次。

表达检测SDS-PAGE结果如图2所示，对比泳道1与2发现诱导后比诱导前在50KDa处多了一条目标带，说明目标蛋白在大肠杆菌宿主有表达；通过泳道3与4对比，泳道3为破菌沉淀，为包涵体表达，而泳道4为破菌上清，为可溶性表达，说明目标蛋白在宿主细胞内通过改变诱导条件，目标蛋白在宿主细胞内部分包涵体转化为了可溶性上清表达。

现有技术未添加可溶标签采用大肠杆菌表达系统表达鼠源RNA酶抑制剂，绝大部分会形成包涵体，表达检测SDS-PAGE结果如下图3所示。

对比图2和图3可知，与未添加可溶标签采用大肠杆菌表达系统表达鼠源RNA酶抑制剂的效果相比，本申请中所产生的包涵体表达大幅减少，而可溶性表达量显著增加。

2.纯化

a.亲和层析

1)柱平衡：用5个柱体积的buffer A(20mM Tris，300mM NaCl，5mM imidazole，1mMTCEP，pH 8.0)平衡填料。

2)上样：将离心的上清液用0.45um的滤膜过滤，然后将上清液以5mL/min的流速经过NI亲和层析柱，并收集流穿液。

3)洗杂：用10个柱体积的buffer A洗杂。

4)洗脱：分别采用10个柱体积的buffer B(20mM Tris，300mM NaCl，10mMimidazole，1mM TCEP，pH 8.0)、10个柱体积的buffer C(20mM Tris，500mM NaCl，25mMimidazole，1mM TCEP，pH 8.0)、5个柱体积的buffer D(20mM Tris，500mM NaCl，250mMimidazole，2mM TCEP，pH 8.0)以及5个柱体积的buffer E(20mM Tris，300mM NaCl，500mMimidazole，1mM TCEP，pH 8.0)将目的蛋白梯度洗脱下来。

SDS-PAGE结果如图4所示：buffer D洗脱液中目的蛋白较纯。

b.Q柱层析

1)将亲和纯化后的蛋白透析到buffer F(20mM Tris，50mM NaCl，1mM EDTA，1mMDTT，pH8.0)中，按体积比1:50进行透析16h。

2)柱平衡：用5个柱体积的buffer F平衡填料。

2)上样：将样品用0.45um的滤膜过滤，然后将过滤液以2mL/min的流速经过Q层析柱，并收集流穿液。

3)洗杂：用10个柱体积的buffer G(20mM Tris，100mM NaCl，1mM EDTA，5mM DTT，pH 8.0)洗杂。

4)洗脱：分别采用10个柱体积的buffer H(20mM Tris，300mM NaCl，1mM EDTA，5mMDTT，pH 8.0)、5个柱体积的buffer I(20mM Tris，1.0M NaCl，1mM EDTA，5mM DTT，pH 8.0)将目的蛋白梯度洗脱下来。将样品收集至离心管中。

Q柱纯化SDS-PAGE如图5所示：目的蛋白在buffer H洗脱液中大量洗脱出，但纯度不高，需进一步纯化。

c.疏水层析

1)往Q层析后的蛋白加入30％硫酸铵，搅拌30min，收集至离心杯中，12000rpm，离心20min，0.45um膜过滤，待用。

2)柱平衡：用5个柱体积的buffer J(20mM Tris，30％硫酸铵，1mM DTT，pH 8.0)平衡填料。

2)上样：将样品过滤液以2mL/min的流速经过疏水层析柱，并收集流穿液。

3)洗杂：用10个柱体积的buffer K(20mM Tris，21％硫酸铵，1mM DTT，pH 8.0)。

4)洗脱：分别采用5个柱体积的buffer L(20mM Tris，15％硫酸铵，1mM DTT，pH8.0)与5个柱体积的buffer M(20mM Tris，1mM DTT，pH 8.0)将目的蛋白梯度洗脱下来。将样品收集至离心管中。

疏水层化SDS-PAGE如图6所示：buffer L洗脱液中目的蛋白较纯,经过对制备的MRI原液酶活力测定，1L发酵液胞内可溶性目标产物经纯化后获得目标蛋白活力均值可达714538U，即最终可以获得8.93mg的活性RI。

其效果较现有技术中添加可溶性标签后的产量更高，效果具有显著性。

本发明经最终表达分离纯化后制备MRI原液的SDS-PAGE图如图7所示，从图中可知，目标蛋白经三步纯化后纯度在90％以上。

四、性能检测

1.活性检测

采用本发明的MRI抑制RNase A降解RNA方法进行活性测定。具体的，设置实验组：商品RI和本发明的MRI，对照组：水；分别单独在反应体系中添加3种不同加量的商品RI和MRI，再加入重组RNase A，孵育一定时间后加入RNA，室温再孵育，结束后加入终止液结束实验，最后使用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带。比活胶图如图8显示，对照组RNA完全被降解，而加入MRI和商品RI的实验组RNA条带完整，由此表明MRI能够完全抑制RNaseA的活性，且本发明制备的MRI的比活与商品酶RNasin相当。

2.稳定性检测

将实施案例3中制备出来的MRI透析到贮存buffer中，贮存buffer包含20mM Tris-HCl、100mM NaCl、8mM DTT、50％glycerol，0.1mM EDTA pH 8.0。放到37℃恒温箱中做加速试验，对比0天和14天的稳定性差异，检测方法与活性检测方法相同，胶图如图9所示，琼脂糖凝胶电泳结果表明在37℃下热加速14天，添加不同加量的MRI均可抑制RNase A降解RNA，由此证明本发明的MRI具有优良的稳定性。

对比例：

1.宿主的筛选

首先，通过同源重组酶将目标基因与经Nco I和EcoR I酶切后的pET21a表达载体相连，得到重组载体pET21a_MRI，并将其转化至DH5α克隆感受态细胞中，于卡那霉素抗性平板涂布培养。将平板菌落送至第三方测序公司测序，获得测序正确的阳性克隆。

其次，将测序成功的重组载体分别热激转化到表达感受态细胞BL21(DE3)、BL21(DE3)-pG-Tf2、Rosetta(DE3)中，于相应抗性平板涂布培养，挑取单菌落，接种于相应抗性的10mL LB液体培养基中，37℃摇床培养16h，再以l‰接种量于1000mL LB培养基中接种，37℃，180-220rpm培养，待OD为0.6-0.8时，开始诱导，加入终浓度为0.4mM/L IPTG于扩大培养好的摇瓶中，培养条件16℃，180-220rpm，16h。发酵结束后，收集菌体，然后分离与纯化。

结果表明，MRI在Rosetta(DE3)宿主表达量最高，1L发酵液裂解后可溶性目标蛋白活力为82100U，而BL21(DE3)、BL21(DE3)-pG-Tf2表达的可溶性目标蛋白活力均值分别约为25920U、48695U。

2.培养基的筛选

将筛选出的重组MRI菌落Rosetta(DE3)_pET21a_MRI，于卡那霉素抗性平板涂布培养，挑取单菌落，于卡那霉素抗性的20mL LB液体培养基培养(包含1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠)中接种，37℃摇床培养16h，分别再以l‰接种量于1000mL LB培养基(包含1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠)、TB培养基(包含1.2％胰蛋白胨、2.4％酵母提取物、72mM/L磷酸氢二钾、17mM/L磷酸二氢钾、0.5％甘油)和ZYP培养基(包含1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、50mM/L磷酸氢二钾、50mM/L磷酸二氢钾、0.5％甘油、25mM/L硫酸铵、2mM/L硫酸镁、0.05％葡萄糖和0.2％α-乳糖)中接种，37℃，180-220rpm培养条件，待OD为0.6-0.8时，开始诱导，加入于扩大培养好的摇瓶中，培养条件16℃，180-220rpm，16h，发酵结束后，收集菌体，然后分离与纯化。

结果表明，在TB培养基表达条件下可溶性表达量高，1L发酵液可溶性目标蛋白活力均值为491080U；而在LB培养基中菌种后期生长缓慢且菌量较少，分离出的目标蛋白也较少，1L发酵液可溶性目标蛋白活力均值为173440U；ZYP培养基在16℃时代谢慢，生长周期长，表达量不及TB培养基，1L发酵液可溶性目标蛋白活力均值为352967U。

3.诱导条件的优化

将重组载体pET21a_MRI，在Rosetta(DE3)菌株中表达，在卡那霉素抗性平板挑取单菌落，于卡那霉素抗性的20mL LB液体培养基中接种，37℃摇床培养16h，分别再以l‰接种量于TB培养基中，当37℃，180-220rpm培养至OD为0.6-0.8，诱导温度分别设置为16℃、20℃和37℃，诱导剂浓度设置为0.1mM/L、0.5mM/L和1.5mM/L，诱导时间分别设置为4h、16h、和24h。

结果表明，诱导温度对MRI影响随着表达温度的升高表达量先升高再降低，优选20℃；诱导IPTG浓度随浓度增大可溶性蛋白先增大再缓慢减小，所以诱导剂浓度0.5mM/L最优；随着表达时间的延长表达量增多，但是发现表达时间24h时，菌体活力降低，优选16h。经优化后，最终1L发酵液裂解后可溶性目标蛋白活力均值为984768U。

综上，本申请的最佳表达条件为：以Rosetta(DE3)为宿主，以pET21a为载体对MRI进行表达，TB培养基作为MRI蛋白表达使用培养基且TB培养基培养条件为：诱导温度20℃，诱导剂为异丙基硫代半乳糖(IPTG)，浓度0.5mM/L，诱导时间16h。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改，等同替换，改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

采用本发明的工艺表达的鼠源RNA酶抑制剂的基因序列如SEQ ID NO.1所示：

ATGAGCCTGGACATCCAGAGCCTGGACATCCAGTGTGAGGAGCTGAGCGACGCTAGATGGGCCGAGCTCCTCCCTCTGCTCCAGCAGTGCCAAGTGGTCAGGCTGGACGACTGTGGCCTCACGGAAGCACGGTGCAAGGACATCAGCTCTGCACTTCGAGTCAACCCTGCACTGGCAGAGCTCAACCTGCGCAGCAACGAGCTGGGCGATGTCGGCGTGCATTGCGTGCTCCAGGGCCTGCAGACCCCCTCCTGCAAGATCCAGAAGCTGAGCCTCCAGAACTGCTGCCTGACGGGGGCCGGCTGCGGGGTCCTGTCCAGCACACTACGCACCCTGCCCACCCTGCAGGAGCTGCACCTCAGCGACAACCTCTTGGGGGATGCGGGCCTGCAGCTGCTCTGCGAAGGACTCCTGGACCCCCAGTGCCGCCTGGAAAAGCTGCAGCTGGAGTATTGCAGCCTCTCGGCTGCCAGCTGCGAGCCCCTGGCCTCCGTGCTCAGGGCCAAGCCGGACTTCAAGGAGCTCACGGTTAGCAACAACGACATCAATGAGGCTGGCGTCCGTGTGCTGTGCCAGGGCCTGAAGGACTCCCCCTGCCAGCTGGAGGCGCTCAAGCTGGAGAGCTGCGGTGTGACATCAGACAACTGCCGGGACCTGTGCGGCATTGTGGCCTCCAAGGCCTCGCTGCGGGAGCTGGCCCTGGGCAGCAACAAGCTGGGTGATGTGGGCATGGCGGAGCTGTGCCCAGGGCTGCTCCACCCCAGCTCCAGGCTCAGGACCCTGTGGATCTGGGAGTGTGGCATCACTGCCAAGGGCTGCGGGGATCTGTGCCGTGTCCTCAGGGCCAAGGAGAGCCTGAAGGAGCTCAGCCTGGCCGGCAACGAGCTGGGGGATGAGGGTGCCCGACTGCTGTGTGAGACCCTGCTGGAACCTGGCTGCCAGCTGGAGTCGCTGTGGGTGAAGTCCTGCAGCTTCACAGCCGCCTGCTGCTCCCACTTCAGCTCAGTGCTGGCCCAGAACAGGTTTCTCCTGGAGCTACAGATAAGCAACAACAGGCTGGAGGATGCGGGCGTGCGGGAGCTGTGCCAGGGCCTGGGCCAGCCTGGCTCTGTGCTGCGGGTGCTCTGGTTGGCCGACTGCGATGTGAGTGACAGCAGCTGCAGCAGCCTCGCCGCAACCCTGTTGGCCAACCACAGCCTGCGTGAGCTGGACCTCAGCAACAACTGCCTGGGGGACGCCGGCATCCTGCAGCTGGTGGAGAGCGTCCGGCAGCCGGGCTGCCTCCTGGAGCAGCTGGTCCTGTACGACATTTACTGGTCTGAGGAGATGGAGGACCGGCTGCAGGCCCTGGAGAAGGACAAGCCATCCCTGAGGGTCATCTCCTGA。

本发明的工艺表达的鼠源RNA酶抑制剂基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示：

MSLDIQSLDIQCEELSDARWAELLPLLQQCQVVRLDDCGLTEARCKDISSALRVNPALAELNLRSNELGDVGVHCVLQGLQTPSCKIQKLSLQNCCLTGAGCGVLSSTLRTLPTLQELHLSDNLLGDAGLQLLCEGLLDPQCRLEKLQLEYCSLSAASCEPLASVLRAKPDFKELTVSNNDINEAGVRVLCQGLKDSPCQLEALKLESCGVTSDNCRDLCGIVASKASLRELALGSNKLGDVGMAELCPGLLHPSSRLRTLWIWECGITAKGCGDLCRVLRAKESLKELSLAGNELGDEGARLLCETLLEPGCQLESLWVKSCSFTAACCSHFSSVLAQNRFLLELQISNNRLEDAGVRELCQGLGQPGSVLRVLWLADCDVSDSSCSSLAATLLANHSLRELDLSNNCLGDAGILQLVESVRQPGCLLEQLVLYDIYWSEEMEDRLQALEKDKPSLRVIS。

Claims (10)

1.一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1：构建重组表达载体，将MRI基因插入大肠杆菌质粒中得到重组的大肠杆菌表达质粒；

步骤S2：培养表达，将大肠杆菌表达质粒转化至大肠杆菌蛋白表达感受态细胞中获得阳性克隆，随后将阳性克隆于生长培养基中，37℃，180-220r/min培养12-16h，再接种至诱导培养基中，16-37℃，180-220r/min培养，培养时间为4-24h；

步骤S3：破菌，分离纯化得目的蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，步骤S1中所述大肠杆菌质粒为pET21a，步骤S2中所述大肠杆菌蛋白表达感受态细胞选自BL21、BL21-pG-Tf2或Rosetta的任一种。

3.根据权利要求1所述的一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述生长培养基选自LB、TB培养基中的任一一种，所述诱导培养基选自LB、TB、ZYP培养基中任一一种。

4.根据权利要求1所述的一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述生长培养基的培养条件为37℃摇床培养12-16h。

5.根据权利要求1所述的一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述诱导培养基的培养条件还包括：待OD为0.6-0.8时，加入诱导剂开始诱导。

6.根据权利要求5所述的一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述诱导剂为异丙基硫代半乳糖，其浓度范围为0.1mM/L～1.5mM/L。

7.根据权利要求6所述的一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述诱导温度为20℃～37℃，所述诱导时长为16-24h。

8.根据权利要求1所述的一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述接种于所述生长培养基的菌落为单菌落；所述诱导培养基上的接种量为l‰。

9.根据权利要求1所述的一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述MRI基因的N端或C端引入His标签。

10.根据权利要求1所述的一种无可溶标签制备鼠源RNA酶抑制剂的工艺，其特征在于，所述分离纯化步骤包括层析，所述层析依次包括亲和层析、离子交换层析和疏水层析。