CN117777248A - 一种多受体激动剂多肽Retatrutide的水基固相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种多受体激动剂多肽Retatrutide的水基固相合成方法。所述方法包括分别用水基固相多肽合成法制备四个带保护基片段I、II、III和IV，液相法偶联四个片段并脱除氨基酸残基上的保护基后得到Retatrutide粗肽。本发明所述方法减少了昂贵和有害溶剂的使用，减少了化学废物的产生，提高了合成过程的原子经济性，可实现绿色工业化生产。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药技术领域，具体涉及一种多受体激动剂多肽Retatrutide的水基固相合成方法。
背景技术
在整个说明书中对现有技术的任何讨论都不应被视为承认这些现有技术是广为人知的，或构成本领域公知常识的一部分。
肥胖和糖尿病是对公共健康的严重威胁。据《World Obesity Atlas 2023》显示，2020年全球肥胖人士达26.03亿，预计2035年人数将增长到40.05亿，占全球人口的51％。肥胖与高血压、心血管疾病、某些类型的癌症密切相关，严重肥胖会导致2型糖尿病(T2D)。预计到2035年，糖尿病患者将增至5.92亿。T2D是最常见的糖尿病形式，在糖尿病患者中占90％-95％。糖尿病带来严重的经济负担，国际糖尿病联合会的数据显示，2021年糖尿病导致的全球卫生支出约为9660亿美元；预计到2045年，这一数字将超过10540亿美元。
目前对于肥胖和糖尿病治疗最好的药物类型是多肽，其可以恢复T2D患者胰岛素产生，从而降低血糖，同时可以诱导饱腹感或营养吸收不良及在新陈代谢和脂类代谢管理方面提供改善，从而治疗肥胖。2022年，三款治疗肥胖和糖尿病多肽类药物的总销售额近200亿美元。但是这三款药物均为作用于单一受体的GLP-1类药物，通常伴随着胃肠道和心血管等不良反应，限制了其使用。而胰岛素类多肽药物在治疗糖尿病时会出现短时间血糖过低而出现眩晕等不良反应。
多家机构研究证明，多靶点受体激动剂多肽既可以预防肥胖治疗糖尿病，又避免现有药物的毒副作用，是治疗肥胖和糖尿病药物的发展趋势。除了以上疗效，其他适应症如超重伴有射血分数保留的心衰、阻塞性睡眠呼吸暂停、非酒精性脂肪性肝炎、慢性肾脏病和肥胖症代谢结局等均有一定报道，具有极大的社会效益和经济效益。
与治疗糖尿病和肥胖有关的三个最有效的靶点受体为GLP-1R、GCGR和GIPR，礼来公司已经开发出一款GLP-1R和GIPR的双靶点受体激动剂——替尔泊肽，一经上市即产生巨大效益，据礼来披露的财报数据显示，替尔泊肽(糖尿病适应症)2023年上半年销售额15.48亿美元，进入全球药品销售额TOP100榜单，排名第50位。
Retatrutide(LY3437943，瑞他鲁肽)是礼来基于GIP肽序开发的一种靶向GLP-1R/GCGR/GIPR的多肽药物，人体内平均半衰期长达6天，小鼠体内半衰期为21h(0.47mg/kg)，Retatrutide治疗肥胖的2期临床试验结果显示，与安慰剂相比，所有剂量的Retatrutide治疗均显示出具有临床意义的体重减轻，每周注射Retatrutide(12mg)，48周后患者平均体重减轻24.2％，这是迄今为止药物减肥能达到的最好效果。Retatrutide有望成为全球首个进入3期临床的GLP-1R/GIPR/GCGR激动剂。2023年5月31日，礼来在Clinicaltrials.gov网站上注册了Retatrutide治疗患有心血管疾病以及肥胖疾病的临床3期试验(NCT05882045)，预计于2025年可完成该试验的主要研究。
Retatrutide的CAS#为2381089-83-2，分子式:C221H342N46O68，分子量:4731.33，化学结构见图1。目前对于Retatrutide合成方法的文献报道较少，因其序列有特殊氨基酸，无法像司美格鲁肽一样采用部分发酵法合成，理论上生产方式为固相+液相。比如专利CN117024528A公布了一种Retatrutide的制备方法，按其序列顺序，逐个偶联带保护氨基酸或带保护多肽片段得到肽树脂，将肽树脂裂解、纯化得到Retatrutide。此种工艺使用大量有害溶剂且工艺物质强度(Process Mass Intensity,PMI)很高，其原子经济性极差，导致产生大量化学废物、多肽生产成本高昂。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提供了一种Retatrutide的水基固相合成方法，该方法环境友好且经济高效，减少了昂贵和有害溶剂的使用，减少了化学废物的产生，提高了合成过程的原子经济性，大幅降低了多肽生产的成本，特别有利于工业化生产，同时为其他类似复杂多肽的合成提供了可行的参考方案。
具体地，本发明提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个的结合构成本发明的技术方案。
本发明提供了一种合成Retatrutide的方法，其包括以水基固相合成法分别合成式I至式IV所示的多肽片段，然后偶联所述多肽片段以合成Retatrutide；式I至式IV所示的多肽片段在本发明中也被简称为片段I、片段II、片段III、片段IV；
其中，按照Retatrutide主链C端至N端的氨基酸顺序，片段I为第30～39氨基酸多肽片段，序列为H2N-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH2，结构如下所示：
片段II为第22～29氨基酸多肽片段，序列为：SmocHN-Phe-Ile-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Leu-Glu(tBu)-Gly-CO2H，结构如下所示：
片段III为带有侧链的第15～21氨基酸多肽片段，序列为：SmocHN-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Lys{diacid-C20(tBu)-gamma-Glu(tBu)-(AEEA)}-Ala-Gln-Aib-Ala-CO2H，结构如下所示：
片段IV为第1～14氨基酸多肽片段，序列为：BocHN-Tyr(tBu)-Aib-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Leu(αMe)-Leu-CO2H，结构如下所示：
式I所示多肽片段的制备
在本发明的一种实施方式中，式I所示多肽片段的制备方法包括：以氨基PEGA树脂为固相合成载体，依次从C端至N端缩合Smoc-L-Ser(OtBu)-OH,Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Ala-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-Gly-OH，裂解、干燥、纯化、冻干后得到式I所示多肽片段。
进一步地，根据本发明的一些实施方式，式I所示多肽片段的制备方法包括：
取氨基PEGA树脂溶胀作为固相合成载体；
将首个氨基酸Smoc-L-Ser(OtBu)-OH和缩合剂加入乙腈水溶液中活化，然后加入至溶胀后的树脂中反应制备得到Smoc-L-Ser(OtBu)-OH-树脂，该过程投料两次，反应完成后，脱除Smoc保护基，制备得到L-Ser(OtBu)-OH-树脂；
分别活化Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Ala-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-Gly-OH；活化方法同首个氨基酸，即将氨基酸和缩合剂加入乙腈水溶液中进行活化，活化10～30分钟；
将活化后的Smoc-L-Pro-OH加入至L-Ser(OtBu)-OH-树脂中缩合，缩合完成后脱除Smoc保护基，然后继续依次缩合Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Ala-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-Gly-OH，每缩合一个氨基酸后均进行脱除Smoc保护基的操作，最终得到多肽片段I树脂；
裂解多肽片段I树脂，得到多肽片段I粗肽，对其进行干燥、纯化、冻干后得到式I所示多肽片段。
在本发明的一些实施方式中，树脂的溶胀方法包括：将氨基PEGA树脂加入纯化水中溶胀1.0～2.0小时，再用纯化水洗涤树脂两次。
在本发明的一些实施方式中，所述缩合剂由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)、2-肟氰乙酸乙酯(Oxyma)和碳酸氢钠组成，其中，EDC-HCl、Oxyma和碳酸氢钠的摩尔比为3～5:3～4:3～5。
本发明的一些实施方式中，缩合反应的温度为10～30℃，缩合反应的时间为0.5～3小时。
在本发明的一些实施方式中，脱除Smoc保护基的试剂为氢氧化钠和乙醇胺的混合溶液，其中，所述氢氧化钠和乙醇胺的混合溶液由0.5～1.0M的氢氧化钠和20～25％(质量分数)乙醇胺溶液混合得到。比如，在本发明的一些实施方式中，脱除Smoc保护基的方法包括：加入0.5～1.0M氢氧化钠/20～25％乙醇胺溶液脱Smoc两次，两次脱除分别在10～30℃条件下进行20分钟和30分钟，再用纯化水洗涤树脂至pH达到7左右。
在本发明的一些实施方式中，所述乙腈水溶液为10～20％乙腈(质量分数)。
在本发明的一些实施方式中，裂解多肽片段时加入裂解液，所述裂解液为10～20％(质量分数)的六氟异丙醇。
在本发明的一些实施方式中，所述干燥、纯化的操作包括对反应液进行抽滤，滤液浓缩至干后使用反相高效液相色谱法对粗肽纯化，流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为三氟乙酸乙腈溶液。比如，在本发明的一些实施方式中，所述干燥、纯化的操作包括对反应液进行抽滤，滤液浓缩至干后用C18制备柱(50*250mm，10μm)进行反相高效液相色潽法对粗肽纯化，流动相A相为0.1％三氟乙酸/水溶液，流动相B相为0.1％三氟乙酸/乙腈溶液。
式II所示多肽片段的制备
在本发明的一种实施方式中，式II所示多肽片段的制备方法包括：以PEGA树脂为固相合成载体，依次从C端至N端缩合Smoc-Gly-OH，Smoc-L-Glu(OtBu)-OH，Smoc-L-Leu-OH，Smoc-L-Leu-OH，Smoc-L-Tyr(tBu)-OH，Smoc-L-Glu(OtBu)-OH，Smoc-L-Ile-OH，Smoc-L-Phe-OH，裂解、干燥、纯化、冻干后得到式II所示多肽片段。
进一步地，根据本发明的一些实施方式，式II所示多肽片段的制备方法包括：
取PEGA树脂溶胀作为固相合成载体；
将首个氨基酸Smoc-Gly-OH和缩合剂加入乙腈水溶液中活化，然后加入至溶胀后的树脂中反应制备得到Smoc-Gly-OH-树脂，该过程投料两次，反应完成后，脱除Smoc保护基，制备得到Gly-OH-树脂；
分别活化Smoc-L-Glu(OtBu)-OH，Smoc-L-Leu-OH，Smoc-L-Leu-OH，Smoc-L-Tyr(tBu)-OH，Smoc-L-Glu(OtBu)-OH，Smoc-L-Ile-OH，Smoc-L-Phe-OH；活化方法同首个氨基酸，即将氨基酸和缩合剂加入乙腈水溶液中进行活化，活化10～30分钟；
将活化后的Smoc-L-Glu(OtBu)-OH加入至Gly-OH-树脂中缩合，缩合完成后脱除Smoc保护基，然后继续依次缩合Smoc-L-Leu-OH，Smoc-L-Leu-OH，Smoc-L-Tyr(tBu)-OH，Smoc-L-Glu(OtBu)-OH，Smoc-L-Ile-OH，每缩合一个氨基酸后均进行脱除Smoc保护基的操作，最后缩合Smoc-L-Phe-OH，得到多肽片段II树脂；
裂解多肽片段II树脂，得到多肽片段II粗肽，对其进行干燥、纯化、冻干后得到式II所示多肽片段。
在本发明的一些实施方式中，树脂的溶胀方法包括：将PEGA树脂加入纯化水中溶胀1.0～2.0小时，再用纯化水洗涤树脂两次。
在本发明的一些实施方式中，所述缩合剂由EDC-HCl、Oxyma和碳酸氢钠组成，其中，EDC-HCl、Oxyma和碳酸氢钠的摩尔比为3～5:3～4:3～5。
本发明的一些实施方式中，缩合反应的温度为10～30℃，缩合反应的时间为0.5～3小时。
在本发明的一些实施方式中，脱除Smoc保护基的试剂为氢氧化钠和乙醇胺的混合溶液，其中，所述氢氧化钠和乙醇胺的混合溶液由0.5～1.0M的氢氧化钠和20～25％(质量分数)乙醇胺溶液混合得到。比如，在本发明的一些实施方式中，脱除Smoc保护基的方法包括：加入0.5～1.0M氢氧化钠/20～25％乙醇胺溶液脱Smoc两次，两次脱除分别在10～30℃条件下进行20分钟和30分钟，再用纯化水洗涤树脂至pH达到7左右。
在本发明的一些实施方式中，所述乙腈水溶液为10～20％乙腈(质量分数)。
在本发明的一些实施方式中，裂解多肽片段时加入裂解液，所述裂解液为10～20％(质量分数)的六氟异丙醇。
在本发明的一些实施方式中，所述干燥、纯化的操作包括对反应液进行抽滤，滤液浓缩至干后使用反相高效液相色谱法对粗肽纯化，流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为三氟乙酸乙腈溶液。比如，在本发明的一些实施方式中，所述干燥、纯化的操作包括对反应液进行抽滤，滤液浓缩至干后用C18制备柱(50*250mm，10μm)进行反相高效液相色潽法对粗肽纯化，流动相A相为0.1％三氟乙酸/水溶液，流动相B相为0.1％三氟乙酸/乙腈溶液。
式III所示多肽片段的制备
在本发明的一种实施方式中，式III所示的多肽片段的制备方法包括：以PEGA树脂为固相合成载体，依次从C端至N端缩合Smoc-L-Ala-OH，Smoc-Aib-OH，Smoc-L-Gln-OH，Smoc-L-Ala-OH，Smoc-L-Lys{diacid-C20(tBu)-gamma-Glu(tBu)-(AEEA)}，Smoc-L-Lys(Boc)-OH，Smoc-L-Asp(OtBu)-OH，裂解、干燥、纯化、冻干后得到式III所示多肽片段。
进一步地，根据本发明的一些实施方式，式III所示多肽片段的制备方法包括：
取PEGA树脂溶胀作为固相合成载体；
将首个氨基酸Smoc-L-Ala-OH和缩合剂加入乙腈水溶液中活化，然后加入至溶胀后的树脂中反应制备得到Smoc-L-Ala-OH-树脂，该过程投料两次，反应完成后，脱除Smoc保护基，制备得到L-Ala-OH-树脂；
分别活化Smoc-Aib-OH，Smoc-L-Gln-OH，Smoc-L-Ala-OH，Smoc-L-Lys{diacid-C20(tBu)-gamma-Glu(tBu)-(AEEA)}，Smoc-L-Lys(Boc)-OH，Smoc-L-Asp(OtBu)-OH；活化方法同首个氨基酸，即将氨基酸和缩合剂加入乙腈水溶液中进行活化，活化10～30分钟；
将活化后的Smoc-Aib-OH加入至L-Ala-OH-树脂中缩合，缩合完成后脱除Smoc保护基，然后继续依次缩合Smoc-L-Gln-OH，Smoc-L-Ala-OH，Smoc-L-Lys{diacid-C20(tBu)-gamma-Glu(tBu)-(AEEA)}，Smoc-L-Lys(Boc)-OH，每缩合一个氨基酸后均进行脱除Smoc保护基的操作，最后缩合Smoc-L-Asp(OtBu)-OH，得到多肽片段III树脂；
裂解多肽片段III树脂，得到多肽片段III粗肽，对其进行干燥、纯化、冻干后得到式III所示多肽片段。
其中，Smoc-L-Lys{diacid-C20(tBu)-gamma-Glu(tBu)-(AEEA)}结构如式IX所示：
在本发明的一些实施方式中，树脂的溶胀方法包括：将PEGA树脂加入纯化水中溶胀1.0～2.0小时，再用纯化水洗涤树脂两次。
在本发明的一些实施方式中，所述缩合剂由EDC-HCl、Oxyma和碳酸氢钠组成，其中，EDC-HCl、Oxyma和碳酸氢钠的摩尔比为3～5:3～4:3～5。
在本发明的一些实施方式中，缩合Smoc-L-Lys{diacid-C20(tBu)-gamma-Glu(tBu)-(AEEA)}时，缩合反应时间为12～16小时，并且反应6～8小时后需要补加一次缩合剂。其他氨基酸的缩合，缩合反应的温度为10～30℃，缩合反应的时间为0.5～3小时。
在本发明的一些实施方式中，脱除Smoc保护基的试剂为氢氧化钠和乙醇胺的混合溶液，其中，所述氢氧化钠和乙醇胺的混合溶液由0.5～1.0M的氢氧化钠和20～25％(质量分数)乙醇胺溶液混合得到。比如，在本发明的一些实施方式中，脱除Smoc保护基的方法包括：加入0.5～1.0M氢氧化钠/20～25％乙醇胺溶液脱Smoc两次，两次脱除分别在10～30℃条件下进行20分钟和30分钟，再用纯化水洗涤树脂至pH达到7左右。
在本发明的一些实施方式中，所述乙腈水溶液为10～20％乙腈(质量分数)。
在本发明的一些实施方式中，裂解多肽片段时加入裂解液，所述裂解液为10～20％(质量分数)的六氟异丙醇。
在本发明的一些实施方式中，所述干燥、纯化的操作包括对反应液进行抽滤，滤液浓缩至干后使用反相高效液相色谱法对粗肽纯化，流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为三氟乙酸乙腈溶液。比如，在本发明的一些实施方式中，所述干燥、纯化的操作包括对反应液进行抽滤，滤液浓缩至干后用C18制备柱(50*250mm，10μm)进行反相高效液相色潽法对粗肽纯化，流动相A相为0.1％三氟乙酸/水溶液，流动相B相为0.1％三氟乙酸/乙腈溶液。
式IV所示多肽片段的制备
在本发明的一种实施方式中，式IV所示多肽片段的制备方法包括：以PEGA树脂为固相合成载体，依次从C端至N端缩合Smoc-L-Leu-OH，Smoc-L-Leu(αMe)-OH，Smoc-L-Ile-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Tyr(tBu)-OH，Smoc-L-Asp(OtBu)-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Thr(OtBu)-OH，Smoc-L-Phe-OH，Smoc-L-Thr(OtBu)-OH，Smoc-Gly-OH，Smoc-L-Gln-OH，Smoc-Aib-OH，Boc-L-Tyr(OtBu)-OH，裂解、干燥、纯化、冻干后得到式IV所示多肽片段。
进一步地，根据本发明的上述实施方式，式IV所示多肽片段的制备方法包括：
取PEGA树脂溶胀作为固相合成载体；
将首个氨基酸Smoc-L-Leu-OH和缩合剂加入乙腈水溶液中活化，然后加入至溶胀后的树脂中反应制备得到Smoc-L-Leu-OH-树脂，该过程投料两次，反应完成后，脱除Smoc保护基，制备得到L-Leu-OH-树脂；
分别活化Smoc-L-Leu(αMe)-OH，Smoc-L-Ile-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Tyr(tBu)-OH，Smoc-L-Asp(OtBu)-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Thr(OtBu)-OH，Smoc-L-Phe-OH，Smoc-L-Thr(OtBu)-OH，Smoc-Gly-OH，Smoc-L-Gln-OH，Smoc-Aib-OH，Smoc-L-Tyr(tBu)-OH；活化方法同首个氨基酸，即将氨基酸和缩合剂加入乙腈水溶液中进行活化，活化10～30分钟；
将活化后的Smoc-L-Leu(αMe)-OH加入至L-Leu-OH-树脂中缩合，缩合完成后脱除Smoc保护基，然后继续依次缩合Smoc-L-Ile-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Tyr(tBu)-OH，Smoc-L-Asp(OtBu)-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Thr(OtBu)-OH，Smoc-L-Phe-OH，Smoc-L-Thr(OtBu)-OH，Smoc-Gly-OH，Smoc-L-Gln-OH，Smoc-Aib-OH，每缩合一个氨基酸后均进行脱除Smoc保护基的操作，最后缩合Boc-L-Tyr(OtBu)-OH，最终得到多肽片段IV树脂；
裂解多肽片段IV树脂，得到多肽片段IV粗肽，对其进行干燥、纯化、冻干后得到式IV所示多肽片段。
其中，Smoc-L-Leu(αMe)-OH的结构如式X所示：
在本发明的一些实施方式中，树脂的溶胀方法包括：将氨基PEGA树脂加入纯化水中溶胀1.0～2.0小时，再用纯化水洗涤树脂两次。
在本发明的一些实施方式中，所述缩合剂由EDC-HCl、Oxyma和碳酸氢钠组成，其中，EDC-HCl、Oxyma和碳酸氢钠的摩尔比为3～5:3～4:3～5。
本发明的一些实施方式中，缩合反应的温度为10～30℃，缩合反应的时间为0.5～3小时。
在本发明的一些实施方式中，脱除Smoc保护基的试剂为氢氧化钠和乙醇胺的混合溶液，其中，所述氢氧化钠和乙醇胺的混合溶液由0.5～1.0M的氢氧化钠和20～25％(质量分数)乙醇胺溶液混合得到。比如，在本发明的一些实施方式中，脱除Smoc保护基的方法包括：加入0.5～1.0M氢氧化钠/20～25％乙醇胺溶液脱Smoc两次，两次脱除分别在10～30℃条件下进行20分钟和30分钟，再用纯化水洗涤树脂至pH达到7左右。
在本发明的一些实施方式中，所述乙腈水溶液为10～20％乙腈(质量分数)。
在本发明的一些实施方式中，裂解多肽片段时加入裂解液，所述裂解液为10～20％(质量分数)的六氟异丙醇。
在本发明的一些实施方式中，所述干燥、纯化的操作包括对反应液进行抽滤，滤液浓缩至干后使用反相高效液相色谱法对粗肽纯化，流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为三氟乙酸乙腈溶液。比如，在本发明的一些实施方式中，所述干燥、纯化的操作包括对反应液进行抽滤，滤液浓缩至干后用C18制备柱(50*250mm，10μm)进行反相高效液相色潽法对粗肽纯化，流动相A相为0.1％三氟乙酸/水溶液，流动相B相为0.1％三氟乙酸/乙腈溶液。
在本发明的一些实施方式中，所述Retatrutide的合成方法包括：
获取式I至式IV所示的多肽片段；
将式I和式II所示多肽片段偶联并脱除Smoc保护基以获得式V所示多肽片段；
将式V和式III所示多肽片段偶联并脱除Smoc保护基以获得式VI所示多肽片段；
将式VI和式IV所示多肽片段偶联并脱除氨基酸残基上的保护基以获得Retatrutide粗肽；
所述Retatrutide粗肽经干燥、纯化、冻干后获得纯品Retatrutide。
式V所示多肽片段的制备
进一步地，根据本发明的上述实施方式，式V所示多肽片段的制备方法包括：
将式I所示多肽片段、式II所示多肽片段和缩合剂加入乙腈中反应，脱除Smoc保护基后得到多肽片段V粗肽，对其干燥、纯化、冻干得到式V所示多肽片段。
片段V的序列为H2N-Phe-Ile-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Leu-Glu(tBu)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH2；其结构如式V所示：
在本发明的一些实施方式中，所述缩合剂由EDC-HCl、Oxyma和碳酸氢钠组成，其中，EDC-HCl、Oxyma和碳酸氢钠的摩尔比为6～8:3～4:6～8。
在本发明的一些实施方式中，式V所示多肽片段的制备方法包括：将式I所和式II所示多肽片段(1:1当量)和缩合剂在乙腈中进行偶联，其中，缩合剂为EDC-HCl(6～8当量，缩合剂相对于多肽片段的摩尔当量)/Oxyma(3～4当量)/碳酸氢钠(6～8当量)，反应温度为10～30℃，反应时间为12～16小时，使用20～30当量二乙胺脱Smoc保护基1～2小时，干燥、纯化、冻干后得到式V所示多肽片段。
在本发明的一些实施方式中，所述干燥、纯化的操作包括对反应液进行抽滤，滤液浓缩至干后使用反相高效液相色谱法对粗肽纯化，流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为三氟乙酸乙腈溶液。比如，在本发明的一些实施方式中，所述干燥、纯化的操作包括对反应液进行抽滤，滤液浓缩至干后用C18制备柱(50*250mm，10μm)进行反相高效液相色潽法对粗肽纯化，流动相A相为0.1％三氟乙酸/水溶液，流动相B相为0.1％三氟乙酸/乙腈溶液。
式VI所示多肽片段的制备
进一步地，根据本发明的一些实施方式，式VI所示多肽片段包括：
将式III所示多肽片段溶解于乙腈中，加入式V所示多肽片段和缩合剂，反应结束后脱除Smoc保护基得到多肽片段VI粗肽，对其干燥、纯化、冻干得到式VI所示多肽片段；
片段VI的序列：H2N-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Lys{diacid-C20(tBu)-gamma-Glu(tBu)-(AEEA)}-Ala-Gln-Aib-Ala-Phe-Ile-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Leu-Glu(tBu)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH2；其结构如式VI所示：
在本发明的一些实施方式中，所述缩合剂由EDC-HCl、Oxyma和碳酸氢钠组成，其中，EDC-HCl、Oxyma和碳酸氢钠的摩尔比为6～8:3～4:6～8。
在本发明的一些实施方式中，式VI所示多肽片段的制备方法包括：将式III所示多肽片段在乙腈中与式V所示多肽片段进行偶联，缩合剂为EDC-HCl(6～8当量，缩合剂相对于多肽片段的摩尔当量)/Oxyma(3～4当量)/碳酸氢钠(6～8当量)，在10～30℃条件下进行缩合反应12～16小时，20～30当量二乙胺脱Smoc保护基1～2小时，干燥、纯化、冻干后得到式VI所示多肽片段。
在本发明的一些实施方式中，所述干燥、纯化的操作包括对反应液进行抽滤，滤液浓缩至干后使用反相高效液相色谱法对粗肽纯化，流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为三氟乙酸乙腈溶液。比如，在本发明的一些实施方式中，所述干燥、纯化的操作包括对反应液进行抽滤，滤液浓缩至干后用C18制备柱(50*250mm，10μm)进行反相高效液相色潽法对粗肽纯化，流动相A相为0.1％三氟乙酸/水溶液，流动相B相为0.1％三氟乙酸/乙腈溶液。
Retatrutide的制备
将式IV所示多肽片段、式VI所示多肽片段和缩合剂加入乙腈中进行偶联，得到式VII所示多肽片段，反应完成后脱除氨基酸残基上的保护基得到Retatrutide粗肽，对其进行干燥、纯化、冻干得到Retatrutide；
片段VII具有如下结构：
Retatrutide的结构如图1所示。
在本发明的一些实施方式中，所述缩合剂由EDC-HCl、Oxyma和碳酸氢钠组成，其中，EDC-HCl、Oxyma和碳酸氢钠的摩尔比为6～8:3～4:6～8。
在本发明的一些实施方式中，在制备式VI所示多肽片段的过程中，使用二乙胺脱除Smoc保护基。
在本发明的一些实施方式中，在制备Retatrutide粗肽的过程中，使用三氟乙酸、三异丙基硅烷和二硫苏糖醇的组合脱除氨基酸残基上的保护基，其中，三氟乙酸、三异丙基硅烷和二硫苏糖醇的质量比为15～30：0.3～0.5：0.3～0.5。
在本发明的一些实施方式中，Retatrutide的制备方法包括：将式VI所示多肽片段在乙腈中与式IV所示多肽片段进行偶联，缩合剂为EDC-HCl(6～8当量，缩合剂相对于多肽片段的摩尔当量)/Oxyma(3～4当量)/碳酸氢钠(6～8当量)，在10～30℃条件下进行缩合反应12～16小时，得到式VII所示多肽片段，加入三氟乙酸(15～30倍片段VI的重量)/三异丙基硅烷(0.3～0.5倍片段VI的重量)/二硫苏糖醇(0.3～0.5倍片段VI的重量)脱保护基2～4小时，干燥、纯化、冻干后得到Retatrutide。
在本发明的一些实施方式中，所述干燥、纯化的操作包括对反应液进行抽滤，滤液浓缩至干后使用反相高效液相色谱法对粗肽纯化，流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为三氟乙酸乙腈溶液。比如，在本发明的一些实施方式中，所述干燥、纯化的操作包括对反应液进行抽滤，滤液浓缩至干后用C18制备柱(50*250mm，10μm)进行反相高效液相色潽法对粗肽纯化，流动相A相为0.1％三氟乙酸/水溶液，流动相B相为0.1％三氟乙酸/乙腈溶液。
通过上述一个或多个技术手段，可实现以下有益效果：
本发明提供了Retatrutide的水基固相合成方法，所述方法具有环境友好性：通过使用水基溶剂、绿色偶联剂(缩合剂)、新型绿色树脂，以及整个偶联过程以乙腈水溶液或乙腈为溶剂，本发明显著减少了对有害化学溶剂(比如合成多肽常用的毒性较高溶剂N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、叔丁基甲基醚、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑、1-羟基苯并三氮唑、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基及哌啶等)的依赖，从而降低了对环境的影响。所述方法具有成本效益：由于减少了昂贵和有害溶剂的使用，以及提高了合成过程的原子经济性，本方法大幅降低了多肽生产的成本。所述方法降低了化学废物：本发明的合成方法减少了化学废物的产生，使之符合当前对可持续发展和环保的全球趋势。所述方法工艺简化：相比传统方法，本发明的合成流程更为简化和高效，有助于工业化生产。因此，本发明不仅提供了一种环境友好、经济高效的Retatrutide合成方法，同时也为类似复杂多肽的合成提供了可行的技术方案。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：
图1为Retatrutide的化学结构式。
图2为Retatrutide的合成示意图。
图3为Retatrutide的质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。如无特殊说明，本发明中所述百分含量均为质量百分含量。
在本发明权利要求书和说明书中出现的物质英文缩写对应中文含义见下表：
本发明分别用水基固相多肽合成法制备四个带保护基的片段I、II、III和IV，液相法偶联四个片段脱保护基后得到Retatrutide粗品肽，纯化得Retatrutide。合成示意图见图2。
其中，按照Retatrutide主链C端至N端的氨基酸顺序，片段I为第30～39氨基酸多肽片段，序列为H2N-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH2，结构如式I所示：
片段II为第22～29氨基酸多肽片段，序列为：SmocHN-Phe-Ile-Glu(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Leu-Glu(tBu)-Gly-CO2H，结构如式II所示：
片段III为带有侧链的第15～21氨基酸多肽片段，序列为：SmocHN-Asp(tBu)-Lys(Boc)-Lys{diacid-C20(tBu)-gamma-Glu(tBu)-(AEEA)}-Ala-Gln-Aib-Ala-CO2H，结构如式III所示：
片段IV为第1～14氨基酸多肽片段，序列为：BocHN-Tyr(tBu)-Aib-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(tBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Leu(αMe)-Leu-CO2H，结构如式IV所示：
实施例1：片段I的制备
1.树脂的溶胀：取20g氨基PEGA树脂(替代度为0.5mmol/g)加入200ml纯化水将树脂溶胀2h，抽干溶剂；再用100ml纯化水洗涤树脂两次，抽干溶剂。
2.Smoc-L-Ser(OtBu)-OH-树脂的制备：将Smoc-L-Ser(OtBu)-OH(3当量)和EDC-HCl(5当量)/Oxyma(4当量)/碳酸氢钠(5当量)加入适量15％乙腈中，混合后活化30分钟加入至树脂(1当量)中，在25℃条件下反应3h；重复以上操作得到Smoc-L-Ser(OtBu)-OH-树脂。
3.Smoc保护基的脱除：在25℃条件下加入100ml 1.0M氢氧化钠/25％乙醇胺溶液溶液脱除Smoc保护基两次，反应时间分别为20分钟和30分钟，再用纯化水洗涤树脂至pH达到7左右，抽干溶剂。
4.氨基酸、肽片段的活化：分别将Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Ala-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Pro-OH和Smoc-Gly-OH各30mmol与EDC-HCl(30mmol)/Oxyma(30mmol)/碳酸氢钠(30mmol)加入适量15％乙腈中，在25℃条件下反应30分钟。
5.氨基酸、肽片段与L-Ser(OtBu)-OH-树脂的偶联：将活化后的Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Ala-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-Gly-OH依次加至脱除Smoc保护基的树脂中(氨基酸依次缩合，每次缩合一个活化的氨基酸，每缩合一个氨基酸后均脱除Smoc保护基)，在25℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h，茚三酮显色反应监控反应进程，最终得到片段I树脂。
6.片段I树脂的裂解
向肽树脂中加入10倍体积的裂解试剂(15％六氟异丙醇二氯甲烷溶液)，在25℃条件下反应3h，抽滤；滤液浓缩至干后用C18制备柱(50*250mm，10μm)进行反相高效液相色潽法对粗肽纯化，流动相A相为0.1％三氟乙酸/水溶液，流动相B相为0.1％三氟乙酸/乙腈溶液。紫外检测波长220nm。经浓缩、冻干得到4.05g纯品，纯度98.6％，收率35.3％。
实施例2：片段II的制备
1.树脂的溶胀：取20g PEGA树脂(替代度为0.5mmol/g)加入200ml纯化水将树脂溶胀2h，抽干溶剂；再用100ml纯化水洗涤树脂两次，抽干溶剂。
2.Smoc-Gly-OH-树脂的制备：将Smoc-Gly-OH(3当量)和EDC-HCl(5当量)/Oxyma(4当量)/碳酸氢钠(5当量)加入适量15％乙腈中，混合后活化30分钟加入至树脂(1当量)中，在25℃条件下反应3h；重复以上操作得到Smoc-Gly-OH-树脂。
3.Smoc保护基的脱除：在25℃条件下加入100ml 1.0M氢氧化钠/25％乙醇胺溶液溶液脱除Smoc保护基两次，反应时间分别为20分钟和30分钟；再用纯化水洗涤树脂至pH达到7左右，抽干溶剂。
4.氨基酸、肽片段的活化：分别将Smoc-L-Glu(OtBu)-OH，Smoc-L-Leu-OH，Smoc-L-Leu-OH，Smoc-L-Tyr(tBu)-OH，Smoc-L-Glu(OtBu)-OH，Smoc-L-Ile-OH和Smoc-L-Phe-OH各30mmol与EDC-HCl(30mmol)/Oxyma(30mmol)/碳酸氢钠(30mmol)加入适量15％乙腈中，在25℃条件下反应30分钟。
5.氨基酸、肽片段与Gly-OH-树脂的偶联：将活化后的Smoc-L-Glu(OtBu)-OH，Smoc-L-Leu-OH，Smoc-L-Leu-OH，Smoc-L-Tyr(tBu)-OH，Smoc-L-Glu(OtBu)-OH，Smoc-L-Ile-OH依次加至脱除Smoc保护基的树脂中，前述氨基酸依次缩合，每次缩合一个活化的氨基酸，每缩合一个氨基酸后均脱除Smoc保护基，最后缩合Smoc-L-Phe-OH，其中，在25℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h，茚三酮显色反应监控反应进程，最终得到片段II树脂。
6.片段II树脂的裂解
向肽树脂中加入10倍体积的裂解试剂(15％六氟异丙醇二氯甲烷溶液)，在25℃条件下反应3h，抽滤；滤液浓缩至干后用C18制备柱(50*250mm，10μm)进行反相高效液相色潽法对粗肽纯化，流动相A相为0.1％三氟乙酸/水溶液，流动相B相为0.1％三氟乙酸/乙腈溶液。紫外检测波长220nm。经浓缩、冻干得到7.12g纯品，纯度97.8％，收率46.4％。
实施例3：片段III的制备
1树脂的溶胀：取20gPEGA树脂(替代度为0.5mmol/g)加入200ml纯化水将树脂溶胀2h，抽干溶剂；再用100ml纯化水洗涤树脂两次，抽干溶剂。
2Smoc-L-Ala-OH-树脂的制备：将Smoc-L-Ala-OH(3当量)和EDC-HCl(5当量)/Oxyma(4当量)/碳酸氢钠(5当量)加入适量15％乙腈中，混合后活化30分钟加入至树脂(1当量)中，在25℃条件下反应3h；重复以上操作得到Smoc-L-Ala-OH-树脂。
3.Smoc保护基的脱除：在25℃条件下加入100ml 1.0M氢氧化钠/25％乙醇胺溶液溶液脱除Smoc保护基两次，反应时间分别为20分钟和30分钟；再用纯化水洗涤树脂至pH达到7左右，抽干溶剂。
4.氨基酸、肽片段的活化：分别将Smoc-Aib-OH，Smoc-L-Gln-OH，Smoc-L-Ala-OH，Smoc-L-Lys{diacid-C20(tBu)-gamma-Glu(tBu)-(AEEA)}，Smoc-L-Lys(Boc)-OH和Smoc-L-Asp(OtBu)-OH各30mmol与EDC-HCl(30mmol)/Oxyma(30mmol)/碳酸氢钠(30mmol)加入适量50％乙腈中，在25℃条件下反应30分钟。
5.氨基酸、肽片段与L-Ala-OH-树脂的偶联：将活化后的Smoc-Aib-OH，Smoc-L-Gln-OH，Smoc-L-Ala-OH，Smoc-L-Lys{diacid-C20(tBu)-gamma-Glu(tBu)-(AEEA)}和Smoc-L-Lys(Boc)-OH依次加至脱除Smoc保护基的树脂中，前述氨基酸依次缩合，每次缩合一个活化的氨基酸，每缩合一个氨基酸后均脱除Smoc保护基，最后缩合Smoc-L-Asp(OtBu)-OH，其中，在25℃条件下Smoc-L-Lys{diacid-C20(tBu)-gamma-Glu(tBu)-(AEEA)}共进行缩合反应16小时，并且反应8小时后需要补加一次缩合剂，其余氨基酸在25℃条件下缩合反应2h，茚三酮显色反应监控反应进程，最终得到片段III树脂。
6.片段III树脂的裂解
向肽树脂中加入10倍体积的裂解试剂(15％六氟异丙醇二氯甲烷溶液)，在25℃条件下反应3h，抽滤；滤液浓缩至干后用C18制备柱(50*250mm，10μm)进行反相高效液相色潽法对粗肽纯化，流动相A相为0.1％三氟乙酸/水溶液，流动相B相为0.1％三氟乙酸/乙腈溶液。紫外检测波长220nm。经浓缩、冻干得到5.24g纯品，纯度98.4％，收率26.3％。
实施例4：片段IV的制备
1.树脂的溶胀：取20gPEGA树脂(替代度为0.5mmol/g)加入200ml纯化水将树脂溶胀2h，抽干溶剂；再用100ml纯化水洗涤树脂两次，抽干溶剂。
2.Smoc-L-Leu-OH-树脂的制备：将Smoc-L-Leu-OH(3当量)和EDC-HCl(5当量)/Oxyma(4当量)/碳酸氢钠(5当量)加入适量15％乙腈中，混合后活化30分钟加入至树脂(1当量)中，在25℃条件下反应3h；重复以上操作得到Smoc-L-Leu-OH-树脂。
3.Smoc保护基的脱除：在25℃条件下加入100ml 1.0M氢氧化钠/25％乙醇胺溶液溶液脱除Smoc保护基两次，反应时间分别为20分钟和30分钟；再用纯化水洗涤树脂至pH达到7左右，抽干溶剂。
4.氨基酸、肽片段的活化：分别将Smoc-L-Leu(αMe)-OH，Smoc-L-Ile-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Tyr(tBu)-OH，Smoc-L-Asp(OtBu)-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Thr(OtBu)-OH，Smoc-L-Phe-OH，Smoc-L-Thr(OtBu)-OH，Smoc-Gly-OH，Smoc-L-Gln-OH，Smoc-Aib-OH和Boc-L-Tyr(OtBu)-OH各30mmol与EDC-HCl(30mmol)/Oxyma(30mmol)/碳酸氢钠(30mmol)加入适量50％乙腈中，在25℃条件下反应30分钟。
5.氨基酸、肽片段与L-Leu-OH-树脂的偶联：将活化后的Smoc-L-Leu(αMe)-OH，Smoc-L-Ile-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Tyr(tBu)-OH，Smoc-L-Asp(OtBu)-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Thr(OtBu)-OH，Smoc-L-Phe-OH，Smoc-L-Thr(OtBu)-OH，Smoc-Gly-OH，Smoc-L-Gln-OH，Smoc-Aib-OH和Boc-L-Tyr(OtBu)-OH依次加至脱除Fmoc保护基的树脂中(氨基酸依次缩合，每次缩合一个活化的氨基酸，每缩合一个氨基酸后均脱除Smoc保护基)，在25℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h，茚三酮显色反应监控反应进程，最终得到片段IV树脂。
6.片段IV树脂的裂解
向肽树脂中加入10倍体积的裂解试剂(15％六氟异丙醇二氯甲烷溶液)，在25℃条件下反应3h，抽滤；滤液浓缩至干后用C18制备柱(50*250mm，10μm)进行反相高效液相色潽法对粗肽纯化，流动相A相为0.1％三氟乙酸/水溶液，流动相B相为0.1％三氟乙酸/乙腈溶液。紫外检测波长220nm。经浓缩、冻干得到6.19g纯品，纯度99.4％，收率30.3％。
实施例5：片段V的制备
将片段I 4.05g、片段II 5.48g和缩合剂：EDC-HCl(8当量)/Oxyma(4当量)/碳酸氢钠(8当量)加入至40ml乙腈中，在25℃下进行反应16小时，加入30当量二乙胺脱Smoc保护基1～2小时，浓缩至干后用C18制备柱(50*250mm，10μm)进行反相高效液相色潽法对粗肽纯化，流动相A相为0.1％三氟乙酸/水溶液，流动相B相为0.1％三氟乙酸/乙腈溶液。紫外检测波长220nm。经浓缩、冻干得到6.67g纯品，纯度96.6％，收率78.0％。
实施例6：片段VI的制备
将6.18g片段III溶解于60ml乙腈中，加入6.67g实施例五片段V和缩合剂：EDC-HCl(8当量)/Oxyma(4当量)/碳酸氢钠(8当量)，在25℃下进行反应16小时，加入30当量二乙胺脱Smoc保护基1～2小时，浓缩至干后用C18制备柱(50*250mm，10μm)进行反相高效液相色潽法对粗肽纯化，流动相A相为0.1％三氟乙酸/水溶液，流动相B相为0.1％三氟乙酸/乙腈溶液。紫外检测波长220nm。经浓缩、冻干得到8.01g纯品，纯度97.6％，收率69.1％。
实施例7：Retatrutide的合成及纯化
将8.01g片段VI、4.37g片段IV和缩合剂：EDC-HCl(8当量)/Oxyma(4当量)/碳酸氢钠(8当量)加入至80ml乙腈中，在25℃下进行反应16小时，加入三氟乙酸(18倍片段VI的重量)/三异丙基硅烷(0.4倍片段VI的重量)/二硫苏糖醇(0.4倍片段VI的重量)脱保护基4小时，浓缩至干后用C18制备柱(50*250mm，10μm)进行反相高效液相色潽法对粗肽纯化，流动相A相为0.1％三氟乙酸/水溶液，流动相B相为0.1％三氟乙酸/乙腈溶液。紫外检测波长220nm。经浓缩、冻干得到8.21g纯品，纯度98.6％，收率81.2％。Retatrutide质谱见图3。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种合成Retatrutide的方法，其包括以水基固相合成法分别合成式I至式IV所示的多肽片段，然后偶联所述多肽片段并脱除多肽片段上的保护基以合成Retatrutide；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，式I所示多肽片段的制备方法包括：以氨基PEGA树脂为固相合成载体，依次从C端至N端缩合Smoc-L-Ser(OtBu)-OH,Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Ala-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-Gly-OH，裂解、干燥、纯化、冻干后得到式I所示多肽片段；
优选地，式II所示多肽片段的制备方法包括：以PEGA树脂为固相合成载体，依次从C端至N端缩合Smoc-Gly-OH，Smoc-L-Glu(OtBu)-OH，Smoc-L-Leu-OH，Smoc-L-Leu-OH，Smoc-L-Tyr(tBu)-OH，Smoc-L-Glu(OtBu)-OH，Smoc-L-Ile-OH，Smoc-L-Phe-OH，裂解、干燥、纯化、冻干后得到式II所示多肽片段；
优选地，式III所示的多肽片段的制备方法包括：以PEGA树脂为固相合成载体，依次从C端至N端缩合Smoc-L-Ala-OH，Smoc-Aib-OH，Smoc-L-Gln-OH，Smoc-L-Ala-OH，Smoc-L-Lys{diacid-C20(tBu)-gamma-Glu(tBu)-(AEEA)}，Smoc-L-Lys(Boc)-OH，Smoc-L-Asp(OtBu)-OH，裂解、干燥、纯化、冻干后得到式III所示多肽片段；
优选地，式IV所示多肽片段的制备方法包括：以PEGA树脂为固相合成载体，依次从C端至N端缩合Smoc-L-Leu-OH，Smoc-L-Leu(αMe)-OH，Smoc-L-Ile-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Tyr(tBu)-OH，Smoc-L-Asp(OtBu)-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Thr(OtBu)-OH，Smoc-L-Phe-OH，Smoc-L-Thr(OtBu)-OH，Smoc-Gly-OH，Smoc-L-Gln-OH，Smoc-Aib-OH，Boc-L-Tyr(OtBu)-OH，裂解、干燥、纯化、冻干后得到式IV所示多肽片段。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，式I所示多肽片段的制备方法包括：
取PEGA树脂在纯化水中溶胀，并以纯化水进行洗涤；
将首个氨基酸Smoc-L-Ser(OtBu)-OH和缩合剂加入乙腈水溶液中活化，然后加至溶胀后的树脂中反应制备得到Smoc-L-Ser(OtBu)-OH-树脂，脱除Smoc保护基，制备得到L-Ser(OtBu)-OH-树脂；
分别活化Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Ala-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-Gly-OH；
将活化后的Smoc-L-Pro-OH加入至L-Ser(OtBu)-OH-树脂中缩合，缩合完成后脱除Smoc保护基，然后继续依次缩合Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-L-Ala-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Pro-OH，Smoc-Gly-OH，每缩合一个氨基酸后均进行脱除Smoc保护基的操作，最终得到多肽片段I树脂；
裂解多肽片段I树脂，得到多肽片段I粗肽，对其进行干燥、纯化、冻干后得到式I所示多肽片段。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，式II所示多肽片段的制备方法包括：
取PEGA树脂在纯化水中溶胀，并以纯化水进行洗涤；
将首个氨基酸Smoc-Gly-OH和缩合剂加入乙腈水溶液中活化，然后加入至溶胀后的树脂中反应制备得到Smoc-Gly-OH-树脂，脱除Smoc保护基，制备得到Gly-OH-树脂；
分别活化Smoc-L-Glu(OtBu)-OH，Smoc-L-Leu-OH，Smoc-L-Leu-OH，Smoc-L-Tyr(tBu)-OH，Smoc-L-Glu(OtBu)-OH，Smoc-L-Ile-OH，Smoc-L-Phe-OH；
将活化后的Smoc-L-Glu(OtBu)-OH加入至Gly-OH-树脂中缩合，缩合完成后脱除Smoc保护基，然后继续依次缩合Smoc-L-Leu-OH，Smoc-L-Leu-OH，Smoc-L-Tyr(tBu)-OH，Smoc-L-Glu(OtBu)-OH，Smoc-L-Ile-OH，每缩合一个氨基酸后均进行脱除Smoc保护基的操作，最后缩合Smoc-L-Phe-OH，得到多肽片段II树脂
裂解多肽片段II树脂，得到多肽片段II粗肽，对其进行干燥、纯化、冻干后得到式II所示多肽片段。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，式III所示多肽片段的制备方法包括：
取PEGA树脂在纯化水中溶胀，并以纯化水进行洗涤；
将首个氨基酸Smoc-L-Ala-OH和缩合剂加入乙腈水溶液中活化，然后加入至溶胀后的树脂中反应制备得到Smoc-L-Ala-OH-树脂，脱除Smoc保护基，制备得到L-Ala-OH-树脂；
分别活化Smoc-Aib-OH，Smoc-L-Gln-OH，Smoc-L-Ala-OH，Smoc-L-Lys{diacid-C20(tBu)-gamma-Glu(tBu)-(AEEA)}，Smoc-L-Lys(Boc)-OH，Smoc-L-Asp(OtBu)-OH；
将活化后的Smoc-Aib-OH加入至L-Ala-OH-树脂中缩合，缩合完成后脱除Smoc保护基，然后继续依次缩合Smoc-L-Gln-OH，Smoc-L-Ala-OH，Smoc-L-Lys{diacid-C20(tBu)-gamma-Glu(tBu)-(AEEA)}，Smoc-L-Lys(Boc)-OH，每缩合一个氨基酸后均进行脱除Smoc保护基的操作，最后缩合Smoc-L-Asp(OtBu)-OH，得到多肽片段III树脂；
裂解多肽片段III树脂，得到多肽片段III粗肽，对其进行干燥、纯化、冻干后得到式III所示多肽片段。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，式IV所示多肽片段的制备方法包括：
取PEGA树脂在纯化水中溶胀，并以纯化水进行洗涤；
将首个氨基酸Smoc-L-Leu-OH和缩合剂加入乙腈水溶液中活化，然后加入至溶胀后的树脂中反应制备得到Smoc-L-Leu-OH-树脂，脱除Smoc保护基，制备得到L-Leu-OH-树脂；
分别活化Smoc-L-Leu(αMe)-OH，Smoc-L-Ile-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Tyr(tBu)-OH，Smoc-L-Asp(OtBu)-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Thr(OtBu)-OH，Smoc-L-Phe-OH，Smoc-L-Thr(OtBu)-OH，Smoc-Gly-OH，Smoc-L-Gln-OH，Smoc-Aib-OH，Boc-L-Ty(OtBu)r-OH；
将活化后的Smoc-L-Leu(αMe)-OH加入至L-Leu-OH-树脂中缩合，缩合完成后脱除Smoc保护基，然后继续依次缩合Smoc-L-Ile-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Tyr(tBu)-OH，Smoc-L-Asp(OtBu)-OH，Smoc-L-Ser(OtBu)-OH，Smoc-L-Thr(OtBu)-OH，Smoc-L-Phe-OH，Smoc-L-Thr(OtBu)-OH，Smoc-Gly-OH，Smoc-L-Gln-OH，Smoc-Aib-OH，每缩合一个氨基酸后均进行脱除Smoc保护基的操作，最后缩合Boc-L-Tyr(OtBu)-OH，最终得到多肽片段IV树脂；
裂解多肽片段IV树脂，得到多肽片段IV粗肽，对其进行干燥、纯化、冻干后得到式IV所示多肽片段。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其包括：
获取式I至式IV所示多肽片段；
将式I和式II所示多肽片段偶联并脱除Smoc保护基以获得式V所示多肽片段；
将式V和式III所示多肽片段偶联并脱除Smoc保护基以获得式VI所示多肽片段；
将式VI和式IV所示多肽片段偶联并脱除氨基酸残基上的保护基以获得Retatrutide粗肽；
所述Retatrutide粗肽经干燥、纯化、冻干后获得纯品Retatrutide；
优选地，所述方法包括：将式I所示多肽片段、式II所示多肽片段和缩合剂加入乙腈中反应，脱除Smoc保护基后得到多肽片段V粗肽，对其干燥、纯化、冻干得到式V所示多肽片段；
将式III所示多肽片段溶解于乙腈中，加入式V所示多肽片段和缩合剂，反应结束后脱除Smoc保护基得到多肽片段VI粗肽，对其干燥、纯化、冻干得到式VI所示多肽片段；
将式IV所示多肽片段、式VI所示多肽片段和缩合剂加入乙腈中进行缩合反应，反应完成后脱除氨基酸残基上的保护基得到Retatrutide粗肽，对其进行干燥、纯化、冻干得到Retatrutide；
8.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述缩合剂由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、2-肟氰乙酸乙酯和碳酸氢钠组成，其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、2-肟氰乙酸乙酯和碳酸氢钠的摩尔比为3～5:3～4:3～5；
优选地，脱除Smoc保护基的试剂为氢氧化钠和乙醇胺的混合溶液，其中，所述氢氧化钠和乙醇胺的混合溶液由0.5～1.0M的氢氧化钠和20～25％乙醇胺溶液混合得到；
优选地，裂解多肽片段时加入裂解液，所述裂解液为10～20％的六氟异丙醇。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述缩合剂由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、2-肟氰乙酸乙酯和碳酸氢钠组成，其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、2-肟氰乙酸乙酯和碳酸氢钠的摩尔比为6～8:3～4:6～8；
优选地，在制备式VI所示多肽片段的过程中，使用二乙胺脱除Smoc保护基；
优选地，在制备Retatrutide粗肽的过程中，使用三氟乙酸、三异丙基硅烷和二硫苏糖醇的组合脱除氨基酸残基上的保护基，其中，三氟乙酸、三异丙基硅烷和二硫苏糖醇的质量比为15～30：0.3～0.5：0.3～0.5。
10.根据权利要求2至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述干燥、纯化的操作包括对反应液进行抽滤，滤液浓缩至干后使用反相高效液相色谱法对粗肽纯化，流动相A为三氟乙酸水溶液，流动相B为三氟乙酸乙腈溶液。
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