CN117777218A - 一种从云南土沉香中提取得到的劳丹烷型二萜苷及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从云南土沉香中提取得到的劳丹烷型二萜苷及其用途,属于天然药物化学技术领域。本发明劳丹烷型二萜苷是式I所示的化合物或其盐。本发明化合物对三阴性乳腺癌细胞有良好的抑制活性,有望用于制备预防和/或治疗三阴性乳腺癌的药物,应用前景良好。
Description
技术领域
本发明属于天然药物化学技术领域,具体涉及一种从云南土沉香中提取得到的劳丹烷型二萜苷及其用途。
背景技术
云南土沉香(Excoecaria acerifolia Didr.)为大戟科海漆属云南土沉香的全株,主要分布于海拔1200-3000米处,我国云南、贵州、四川和湖北等地,云南和四川省境内的横断山区河谷的山坡和溪边的灌木丛、大山竹丛之间,怒江、澜沧江和金沙江及各大支流为其核心分布区。在彝族、傣族、拉祜族、藏族和黎族等云南少数民族中,该化合物植物被用于治疗中毒、炎症、风湿骨痛、便秘和风寒等多种疾病。
研究表明民族药云南土沉香中含有多种萜类和酮类等活性成分,但是目前从云南土沉香中提取得到的具体化合物种类较少,成分不明确。如果能从云南土沉香提取得到具有抗肿瘤活性的具体化合物结构,对民族药云南土沉香的发展则具有重要意义。
劳丹烷型二萜苷类化合物虽然是二萜家族的类型之一,但具有抗肿瘤活性的化学成分较少。文献《两种瑞香和刮筋板的化学成分、生物活性和化学分类学研究[D]》(黄圣卓.中国科学院,昆明,2012.)中公开的劳丹烷型二萜化合物ent-11α-hydroxy-3-oxo-13-epi-manoyl oxide没有活性。文献《Terpenoids and their anti-HIV-1activities fromExcoecaria acerifolia》(Huang S.Z.等,Fitoterapia 2013,91224-230.)中公开的劳丹烷型二萜化合物ribenone没有抗肿瘤活性。文献《Two new penterpenoid saponins and anew diterpenoid glycoside from Hemsleya chinensis》(Na-Li Song等,Phytochemistry Letters,2015,13,103-107.)中公开的劳丹烷型二萜苷类化合物Hemsloside-Ma6对多种癌细胞(包括乳腺癌细胞MCF7)均没有抑制活性。文献《Five NewLabdane-Type Diterpenes from Excoecaria agallocha.IV》(Konishi T.等,Chemical&Pharmaceutical Bulletin,1998,46(9):1393-1398.)中公开的化合物ent-13-epi-8,13-epoxy-14S,15-dihydroxylabdan-3-one也未表现出细胞毒活性。因此,研发一种具有抗肿瘤活性的劳丹烷型二萜苷类化合物十分有意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种从云南土沉香中提取得到的劳丹烷型二萜苷及其用途。
本发明提供了式I所示的化合物或其盐:
进一步地,所述化合物为式II所示:
本发明还提供了一种制备前述化合物的方法,它包括如下步骤:
(1)浸膏提取:取云南土沉香粉末,用85~95%甲醇回流提取,提取液减压蒸馏除去溶剂,得甲醇粗提物;
(2)有机溶剂萃取:将甲醇粗提物悬浮于水中,依次使用乙酸乙酯和正丁醇萃取,减压蒸馏除去溶剂,得正丁醇萃取部位;
(3)第一次正相硅胶柱层析:使用二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解正丁醇萃取部位,将溶解后的样品吸附在硅胶上,干法装柱,以体积比为1:0、50:1、20:1、10:1、1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶液进行梯度洗脱,减压蒸馏除去溶剂后,得到相对应洗脱样品Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5;用甲醇溶解Fr.3,将溶解后的样品吸附在RP-18反相硅胶柱层析色谱柱上,干法反相柱层析,依次以浓度为40%、60%、85%的甲醇水溶液进行洗脱,减压蒸馏除去溶剂后,得到相对应洗脱样品Fr.3a、Fr.3b、Fr.3c;
(4)第二次正相硅胶柱层析:使用二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解洗脱样品Fr.3b,将其吸附在硅胶上,干法装柱,以体积比为3:1的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂进行等度洗脱,以石油醚与乙酸乙酯的体积比为2:1的展开剂检测硫酸显色为紫红色的斑点,Rf值为0.3~0.5,合并馏分,减压除去溶剂得到化合物粗品;
(5)凝胶色谱柱纯化:将化合物粗品溶解在甲醇中,进行葡聚糖凝胶色谱柱层析,以甲醇为洗脱剂,以石油醚与乙酸乙酯的体积比为2:1的展开剂检测硫酸显色为紫红色的斑点,Rf值为0.3~0.5,取斑点梯形的馏分,减压除去溶剂,即得化合物。
进一步地,
步骤(1)中,所述回流提取的次数为1~3次,每次回流提取时云南土沉香粉末和甲醇的质量体积比为1kg:5~10L,每次回流提取的时间为1~5小时,温度为60~80℃;
和/或,步骤(3)中,所述二氯甲烷和甲醇混合溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比为1:1;
和/或,步骤(3)中,所述硅胶为200~300目硅胶;
和/或,步骤(3)中,所述体积比为1:0、50:1、20:1、10:1、1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶液与正丁醇萃取部位浸膏的体积质量比依次为50L:355.0g、50L:355.0g、50L:355.0g、50L:355.0g、20L:355.0g;
和/或,步骤(3)中,所述浓度为40%、60%、85%的甲醇水溶液和Fr.3的体积质量比依次为8.0L:13.0g、8.0L:13.0g、5.0L:13.0g;
和/或,步骤(4)中,所述二氯甲烷和甲醇混合溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1;
和/或,步骤(4)中,所述硅胶为300~400目硅胶。
进一步地,
步骤(1)中,所述回流提取的次数为3次,每次回流提取时云南土沉香粉末和甲醇的质量体积比为1kg:5L,每次回流提取的时间为4小时,温度为70℃。
本发明还提供了前述的化合物或其盐在制备预防和/或治疗癌症的药物中的用途。
进一步地,所述癌症为乳腺癌。
进一步地,所述乳腺癌为三阴乳腺癌。
本发明还提供了一种预防和/或治疗癌症的药物,它是以前述的化合物或其盐为活性成分,加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而得。
进一步地,所述癌症为乳腺癌;优选地,所述癌症为三阴性乳腺癌。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明从云南土沉香中提取得到一种劳丹烷型二萜苷化合物,该化合物对三阴性乳腺癌细胞有良好的抑制活性,有望用于制备预防和/或治疗三阴性乳腺癌的药物,应用前景良好。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明的劳丹烷型二萜苷的核磁共振氢谱(1H NMR谱)。
图2为本发明的劳丹烷型二萜苷的核磁共振碳谱(13C NMR和DEPT谱)。
具体实施方式
本发明具体实施方式中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过购买获得的常规产品。
除非另有说明,本发明的比例为体积比,浓度为体积百分比浓度。
实施例1、本发明劳丹烷型二萜苷的制备与鉴定
1、本发明劳丹烷型二萜苷的制备
(1)浸膏提取:取干燥的云南土沉香粉末18.0kg,粉碎后用90%的甲醇(MeOH)加热回流提取3次(70℃;每次提取时间为4小时;每次云南土沉香粉末与90%甲醇的质量体积比为1kg:5L),将提取液减压浓缩除去溶剂合并浸膏,得甲醇粗提取物。
(2)有机溶剂萃取:将甲醇粗提物悬浮于水(15.5L)中,依次以乙酸乙酯、正丁醇分别萃取(15L×3),减压浓缩除去溶剂,得到正丁醇萃取部位355.0g。
(3)第一次正相硅胶柱层析:以二氯甲烷:甲醇(体积比1:1)的混合溶剂(4.0L)溶解正丁醇萃取部位浸膏355.0g,将样品吸附在200~300目的硅胶(0.80kg)上;干法装柱,以体积比二氯甲烷:甲醇(1:0;50:1;20:1;10:1;1:1,体积分别是50L、50L、50L、50L、20L)进行梯度洗脱,减压蒸馏除去溶剂后,得到相对应洗脱样品Fr.1(56.0g)、Fr.2(7.0g)、Fr.3(13.0g)、Fr.4(76.0g)和Fr.5(152.5g)。以甲醇溶解样品Fr.3(13.0g),将其吸附在RP-18反相硅胶柱层析色谱柱上,干法反相柱层析,依次以40%甲醇(8.0L)、60%甲醇(8.0L)、85%甲醇(5.0L)洗脱,减压浓缩除去溶剂后,得到相对应洗脱样品Fr.3a(3.6g)、Fr.3b(4.0g)、Fr.3c(2.0g)。
(4)第二次正相硅胶柱层析分离:以二氯甲烷与甲醇体积比10:1的混合溶剂溶解洗脱样品Fr.3b,然后吸附在300~400目的硅胶上,干法装柱;以石油醚与乙酸乙酯的体积比为3:1的混合溶剂进行等度洗脱,以石油醚与乙酸乙酯的体积比为2:1的展开剂检测硫酸显色为紫红色的斑点(Rf值0.3~0.5),合并馏分,减压除去溶剂即得到所述的劳丹烷型二萜苷粗品。
(5)凝胶色谱柱纯化:将劳丹烷型二萜苷粗品溶解在甲醇中,取甲醇2mL~3mL,使粗品和甲醇的质量体积比1g:1mL,进行葡聚糖凝胶色谱柱层析,以甲醇为洗脱剂,以石油醚与乙酸乙酯的体积比为2:1的展开剂检测硫酸显色为紫红色的斑点(Rf值0.3~0.5),取斑点梯形的馏分,减压除去溶剂,即得劳丹烷型二萜苷纯品(8.2mg)。
以上方法制得的劳丹烷型二萜苷纯品的结构通过以下方法进行测定。
所得劳丹烷型二萜苷纯品为白色无定型粉末。劳丹烷型二萜苷纯品的高分辨傅里叶变换质谱(HR-FT-MS)显示其准分子离子峰m/z 523.2874[M+Na]+(C26H44O9Na+,[M+Na]+calcd.for 523.2877),提示该化合物的分子式是C26H44O9,不饱和度为5。红外光谱νmax3440cm-1和1702cm-1提示该化合物含有羟基和羰基。1H-NMR谱中的特征信号(见表1):δH5.00(d,J=7.7Hz,1H),δH 4.54(d,J=10.3Hz,1H)和4.37(dd,J=11.6,5.3Hz,1H)提示该化合物中含有一个β-葡萄糖结构片段。该化合物酸水解所得单糖经GC分析,与D-Glc的保留时间一致(Rt=23.18min),鉴定该化合物的糖片段为D-吡喃葡萄糖。1H-NMR谱中含有5个角甲基的特征信号:δH 1.27(s)、1.34(s)、1.09(s)、0.98(s)、0.75(s)。13C-NMR和DEPT谱含有糖基信号δC 105.8(d),76.4(d),78.8(d),72.0(d),78.8(d),63.1(t)和20个碳的苷元信号,包括5个甲基:δC 26.2(q,C-16),24.4(q,C-17),26.8(q,C-18),21.4(q,C-19),15.1(q,C-20),7个亚甲基:δC 38.1(t,C-1),34.3(t,C-2),21.2(t,C-6),43.5(t,C-7),15.7(t,C-11),31.5(t,C-12),73.0(t,C-15),3个次甲基:δC 55.0(d,C-5),54.9(d,C-9),75.7(d,C-14)和5个季碳:δC 216.3(s,C-3),47.6(s,C-4),75.2(s,C-8),36.9(s,C-10),75.2(s,C-13),这些信息提示该化合物拥有劳丹烷型二萜的骨架。仔细比较该化合物与已知化合物ent-13-epi-8,13-epoxy-14S,15-dihydroxylabdan-3-one(按照文献Konishi T.,Fujiwara Y.,Konoshima T.,Kiyosawa S.Five New Labdane-Type Diterpenes fromExcoecaria agallocha.IV[J].Chemical&Pharmaceutical Bulletin,1998,46(9):1393-1398.制备得到,结构见下图)的核磁数据,该化合物的NMR图谱多出β-葡萄糖结构片段的信号,C-15位的化学位移由δC 63.5向低场移动至δC 73.0,提示该化合物是化合物ent-13-epi-8,13-epoxy-14S,15-dihydroxylabdan-3-one的糖苷。
ent-13-epi-8,13-epoxy-14S,15-dihydroxylabdan-3-one的结构式
在HMBC谱中,δH 5.00(d,J=7.7Hz,H-1')与δC 73.0(t,C-15)存在明显的相关性,进一步证明β-葡萄糖结构片段连在苷元的C-15位。另外,在HMBC谱中,δH1.09(3H,s,C-18)、δH 0.98(3H,s,C-18)与δC 216.3有明显的相关性。在NOESY图中,δH 4.09(m,H-14)和δH1.27(s,H-16)存在NOE相关,提示OH-14的构型是-α。因此鉴定本发明制得的化合物为ent-13-epi-8,13-epoxy-14(α),15-dihydroxylabdan-3-one-15-O-β-D-glucopyranoside,其结构如下所示:
本发明制得的化合物的结构式
表1.本发明化合物与已知化合物的核磁数据(δinppm,Jin Hz)
以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
试验例1、本发明化合物实施例1制得的化合物ent-13-epi-8,13-epoxy-14(α),15-dihydroxylabdan-3-one-15-O-β-D-glucopyranoside对肿瘤细胞的抑制活性
1、检测原理
采用MTT法测定本发明制得的化合物的抗肿瘤活性。MTT法是在活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的作用下,外源性噻唑蓝(MTT)被还原,成为蓝紫色结晶物,此过程与死细胞反应不同。随后,用细胞级二甲基亚砜溶解甲臜,混合均匀,使用酶标仪在570nm波长处测定其吸收(OD)值,在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比,根据OD值从而计算抗肿瘤细胞活性。
本部分实验使用以下细胞株:恶性三阴性乳腺癌(TNBC)细胞株(HCC1806),人B淋巴细胞细胞株(ST486),结肠癌细胞株(CT26),人宫颈癌细胞株(HeLa)和人肺癌细胞株(A549)。
2、检测步骤
1)用10%的胎牛血清的RPMI1640培养液培养细胞,根据细胞株生长特点,取对数生长期细胞,按5.0×103的细胞个数加入到培养板,100μL/孔,平铺于96孔培养板,为避免边缘效应,边缘孔填充等体积PBS。
2)在5%CO2,37℃孵育条件下,培养24h,分别设2.5、5、10、20、40和80μM浓度的化合物处理细胞,DMSO溶解后使用;加入各浓度的药物100μL/孔,作为空白对照。每个浓度设置3个复孔,取平均值计算。
3)在培养箱中5%CO2,37℃孵育条件下孵育48h后,观察细胞生长情况。取MTT称重,用PBS配置成5mg/mL的溶液,重复震荡混匀。
4)加入MTT溶液20μL/孔,5%CO2,37℃孵育条件下持续培养4h。
5)轻轻移去每孔上清培养基至完全,加入DMSO 150μL/孔,为使MTT-formazan溶解均匀,用微孔板振荡器均匀震荡数秒。
6)打开酶标仪,于570nm处测定吸光度值。
7)Origin软件(www.originlab.com)计算每个化合物的半数抑制浓度(IC50,half-maximal inhibitory concentration)。
3、结果
本发明化合物对各肿瘤细胞的抑制活性如表2所示。
表2.本发明化合物对各肿瘤细胞的抑制活性
a IC50数据用表示,分别用3孔重复检测
由表2可知:文献《Five New Labdane-Type Diterpenes from Excoecariaagallocha.IV》(Konishi T.等,Chemical&Pharmaceutical Bulletin,1998,46
(9):1393-1398.)中已知劳丹烷型二萜化合物ent-13-epi-8,13-epoxy-14S,15-dihydroxylabdan-3-one,文献《两种瑞香和刮筋板的化学成分、生物活性和化学分类学研究[D]》(黄圣卓.中国科学院,昆明,2012.)中化合物ent-11α-
hydroxy-3-oxo-13-13-epi-manoyl oxide、ent-11α-hydroxy-3-oxo-13-epi-manoyl oxide,文献《Terpenoids and their anti-HIV-1activities from Excoecariaacerifolia》(Huang S.Z.等,Fitoterapia 2013,91224-230.)中化合物ribenone对肿瘤细胞都没有抑制活性。
此外,文献《Two new penterpenoid saponins and a new diterpenoidglycoside from Hemsleya chinensis》(Na-Li Song等,Phytochemistry Letters,
2015,13,103-107.)中记载化合物Hemsloside-Ma6对包括对乳腺癌细胞株(MCF7)、肝癌细胞株(HepG2)、结肠癌细胞株(HT29)和胃癌细胞株(MKN28)细胞株均都无抑制活性。
而本发明化合物对三阴性乳腺癌细胞(HCC1806)显示出好的抑制活性,IC50为(61.91±7.99)μM。
综上,本发明从云南土沉香中提取得到一种劳丹烷型二萜苷化合物,该化合物对三阴性乳腺癌细胞有良好的抑制活性,有望用于制备预防和/或治疗三阴性乳腺癌的药物,应用前景良好。
Claims (10)
1.式I所示的化合物或其盐:
2.根据权利要求1所述的化合物或其盐,其特征在于:所述化合物为式II所示:
3.一种制备权利要求2所述化合物的方法,其特征在于:它包括如下步骤:
(1)浸膏提取:取云南土沉香粉末,用85~95%甲醇回流提取,提取液减压蒸馏除去溶剂,得甲醇粗提物;
(2)有机溶剂萃取:将甲醇粗提物悬浮于水中,依次使用乙酸乙酯和正丁醇萃取,减压蒸馏除去溶剂,得正丁醇萃取部位;
(3)第一次正相硅胶柱层析:使用二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解正丁醇萃取部位,将溶解后的样品吸附在硅胶上,干法装柱,以体积比为1:0、50:1、20:1、10:1、1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶液进行梯度洗脱,减压蒸馏除去溶剂后,得到相对应洗脱样品Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5;用甲醇溶解Fr.3,将溶解后的样品吸附在RP-18反相硅胶柱层析色谱柱上,干法反相柱层析,依次以浓度为40%、60%、85%的甲醇水溶液进行洗脱,减压蒸馏除去溶剂后,得到相对应洗脱样品Fr.3a、Fr.3b、Fr.3c;
(4)第二次正相硅胶柱层析:使用二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解洗脱样品Fr.3b,将其吸附在硅胶上,干法装柱,以体积比为3:1的石油醚和乙酸乙酯混合溶剂进行等度洗脱,以石油醚与乙酸乙酯的体积比为2:1的展开剂检测硫酸显色为紫红色的斑点,Rf值为0.3~0.5,合并馏分,减压除去溶剂得到化合物粗品;
(5)凝胶色谱柱纯化:将化合物粗品溶解在甲醇中,进行葡聚糖凝胶色谱柱层析,以甲醇为洗脱剂,以石油醚与乙酸乙酯的体积比为2:1的展开剂检测硫酸显色为紫红色的斑点,Rf值为0.3~0.5,取斑点梯形的馏分,减压除去溶剂,即得化合物。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:
步骤(1)中,所述回流提取的次数为1~3次,每次回流提取时云南土沉香粉末和甲醇的质量体积比为1kg:5~10L,每次回流提取的时间为1~5小时,温度为60~80℃;
和/或,步骤(3)中,所述二氯甲烷和甲醇混合溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比为1:1;
和/或,步骤(3)中,所述硅胶为200~300目硅胶;
和/或,步骤(3)中,所述体积比为1:0、50:1、20:1、10:1、1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶液与正丁醇萃取部位浸膏的体积质量比依次为50L:355.0g、50L:355.0g、50L:355.0g、50L:355.0g、20L:355.0g;
和/或,步骤(3)中,所述浓度为40%、60%、85%的甲醇水溶液和Fr.3的体积质量比依次为8.0L:13.0g、8.0L:13.0g、5.0L:13.0g;
和/或,步骤(4)中,所述二氯甲烷和甲醇混合溶剂中二氯甲烷和甲醇的体积比为10:1;
和/或,步骤(4)中,所述硅胶为300~400目硅胶。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:
步骤(1)中,所述回流提取的次数为3次,每次回流提取时云南土沉香粉末和甲醇的质量体积比为1kg:5L,每次回流提取的时间为4小时,温度为70℃。
6.权利要求1或2所述的化合物或其盐在制备预防和/或治疗癌症的药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途,其特征在于:所述癌症为乳腺癌。
8.根据权利要求7所述的用途,其特征在于:所述乳腺癌为三阴乳腺癌。
9.一种预防和/或治疗癌症的药物,其特征在于:它是以权利要求1或2所述的化合物或其盐为活性成分,加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而得。
10.根据权利要求9所述的药物,其特征在于:所述癌症为乳腺癌;优选地,所述癌症为三阴性乳腺癌。
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