CN116178478A - 一种从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物、方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物、方法及应用。本发明公开了一种从宽叶重楼中提取的名为薯蓣皂苷元‑3‑O‑β‑D‑呋喃果糖基‑(1→6)‑[α‑L‑吡喃鼠李糖基‑(1→2)]‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷的甾体皂苷类化合物、从宽叶重楼中提取该甾体皂苷类化合物的方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。甾体皂苷类化合物为天然产物，能够明显一种肿瘤细胞的增殖，尤其对胶质瘤细胞、U251人胶质瘤细胞、capan‑2人胰腺癌细胞、Hela人宫颈癌细胞和HepG2人肝癌细胞具有显著的抑制作用，为治疗和治愈肿瘤提供了新的药物研发方向。

Description

一种从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物、方法及应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物技术领域，具体涉及从一种从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物、方法及应用。

背景技术

肿瘤作为机体在各种致癌因素催化作用下，在基因水平上局部组织失去其对生长正常的调控作用，导致克隆性异常增生而形成的病变，是人类死亡的主要原因之一。抗肿瘤药物的研发一直是医药领域研究的重点和难点。抗肿瘤类药物因机制单一、毒副作用大、易产生耐药性以及不良的预后，使得越来越多的研究者将目光转向天然药物。其中，皂苷的抗肿瘤作用备受关注，它们广泛存在于植物体内，具有复杂的种类和特点。甾体皂苷中主要受到关注的为重楼皂苷，如重楼皂苷I.、重楼皂苷II.、重楼皂苷V.、重楼皂苷VI.、重楼皂苷VII.等，以及人参皂苷、柴胡皂苷、甘草皂苷等三萜皂苷。

中药重楼为百合科(Liliaceae)重楼属云南重楼(Paris polyphylla Smithvar.yunnanensis)或七叶一枝花(P.polyphylla var.chinensis)的干燥根茎，具有清热解毒、消肿止痛和凉定肝惊的功效，常用于疔疮痈肿、喉咽伤、虫蛇咬伤、跌打损伤、惊风抽搐等证，是著名中成药云南白药胶囊、痛血康胶囊、热毒清片等主要组成药材。药理研究发现，重楼的主要药效物质即为甾体皂苷，亦称为重楼皂苷，现代临床上常用于炎症的治疗。

宽叶重楼(Paris polyphyllavar.latifolia)属于重楼属植物，为重楼属南重楼组的一个变种，主要分布于我国山西、甘肃、安徽等地，在陕西省华阴市、耀州区、黄龙、镇巴县和秦岭南北坡也多有分布，但在现有技术中还缺乏对其较为完整的化学成分研究和药理活性探究。

发明内容

本发明提供了从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物、制备方法及用途，目的在于提供一种从宽叶重楼中提取甾体皂苷类化合物及其方提取方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物，甾体皂苷类化合物为：薯蓣皂苷元-3-O-β-D-呋喃果糖基-(1→6)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷；其结构式如下：

一种从宽叶重楼中提取甾体皂苷类化合物的方法，包括如下步骤，

步骤一：取宽叶重楼原料，并将其根茎粉碎；

步骤二：按照1kg:(8～9)L的比例,取步骤一粉碎后的根茎，加入比例份的浓度为70％的乙醇，每间隔预设时间，进行回流提取；

步骤三：将步骤二中的回流提取液合并后，减压回收乙醇，得提取物；

步骤四：将步骤三得到的提取物分散于与所取粉碎后的根茎重量数相同升数的水中，再用石油醚萃取，至少进行3次萃取，每次萃取3L；

步骤五：萃取后的水相再用水饱和正丁醇萃取至少3次，每次萃取3L，合并水饱和正丁醇萃取液，减压回收正丁醇后得到总皂苷提取物；

步骤六：取步骤五得到的总皂苷提取物样品，采用羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇洗脱，按500mL为一个流份接收，薄层层析检测，合并含甾体皂苷类化合物的第4～8流份，减压蒸干溶剂后得1g样品；

步骤七：将1g样品再用中压制备液相色谱，以甲醇：水按体积比1：4～1：0洗脱，按500mL为一个流份接收，薄层层析检测，合并含甾体皂苷类化合物的第8～10流份，减压蒸干溶剂后得120.4mg样品；

步骤八：经分离纯化得到甾体皂苷类化合物的纯品。

所述步骤二中预设的回流提取时间为2个小时，共提取5次；所述步骤八中采用的是半制备高效液相色谱法分离纯化得到甾体皂苷类化合物的纯品。

将从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物应用于制备抗肿瘤药物中。

所述的抗肿瘤药物为抗胶质瘤、宫颈癌、肝癌或胰腺癌的药物。

所述的胶质瘤为LN229人胶质瘤细胞或U251人胶质瘤细胞。

所述的宫颈癌为Hela人宫颈癌细胞。

所述的胰腺癌为capan-2人胰腺癌细胞。

所述的肝癌为HepG2人肝癌细胞。

所述甾体皂苷类化合物单独使用或与其他药物混合，配制成在临床上使用的注射剂、散剂、丸剂、片剂、微囊剂、软胶囊剂、膜剂、膏剂、酊剂、颗粒剂或气雾剂。

有益效果：

(1)本发明提供了一种从宽叶重楼中提取甾体皂苷类化合物及从宽叶重楼中提取甾体皂苷类化合物的方法。甾体皂苷类化合物是天然的产物，能够有效的抑制肿瘤细胞的增殖。

(2)本发明中的甾体皂苷类化合物作为新抗肿瘤药物或者辅助成分应用于抗肿瘤药物中，抑制肿瘤的效果明显。

(3)本发明中甾体皂苷类化合物是从宽叶重楼中分离得到，具有较好的生物活性，该甾体皂苷类化合物糖基中的β-D-呋喃果糖基非常罕见。该甾体皂苷类化合物尤其对胶质瘤细胞、宫颈癌细胞、胰腺癌细胞和肝癌细胞都有明显的抑制作用，为治疗和治愈肿瘤提供了新的药物研发方向。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚的了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中化合物PPL1的结构示意图。

图2为本发明中化合物PPL1的核磁共振¹H-NMR谱图。

图3为本发明中化合物PPL1的核磁共振¹³C-NMR谱图。

图4为本发明中化合物PPL1的核磁共振¹H-¹H COSY谱图。

图5为本发明中化合物PPL1的核磁共振HMBC谱图。

图6为本发明中化合物PPL1的核磁共振NOESY谱图。

图7为本发明中化合物PPL1的核磁共振HSQC谱图。

上述化合物PPL1为薯蓣皂苷元-3-O-β-D-呋喃果糖-(1→6)-[α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷的简称。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中采用的测试方法和英文缩写属本行业的公知常识，这里不一一叙述。

实施例一：

如图1所示，一种从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物，甾体皂苷类化合物为：薯蓣皂苷元-3-O-β-D-呋喃果糖基-(1→6)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷；其结构式如下：

甾体皂苷类化合物PPL1从自然界中的宽叶重楼中提取，该甾体皂苷类化合物对胶质瘤细胞、宫颈癌细胞、胰腺癌细胞和肝癌细胞都有明显的抑制作用，可将其用于制备新的抗肿瘤药物研发。

实施例二：

一种从宽叶重楼中提取甾体皂苷类化合物的方法，包括如下步骤，

步骤一：取宽叶重楼原料，并将其根茎粉碎；

步骤二：按照1kg:(8～9)L的比例,取步骤一粉碎后的根茎，加入比例份的浓度为70％的乙醇，每间隔预设时间，进行回流提取；

步骤三：将步骤二中的回流提取液合并后，减压回收乙醇，得提取物；

步骤四：将步骤三得到的提取物分散于与所取粉碎后的根茎重量数相同升数的水中，再用石油醚萃取，至少进行3次萃取，每次萃取3L；

步骤五：萃取后的水相再用水饱和正丁醇萃取至少3次，每次萃取3L，合并水饱和正丁醇萃取液，减压回收正丁醇后得到总皂苷提取物；

步骤六：取步骤五得到的总皂苷提取物样品，采用羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇洗脱，按500mL为一个流份接收，薄层层析检测，合并含甾体皂苷类化合物的第4～8流份，减压蒸干溶剂后得1g样品；

步骤七：将1g样品再用中压制备液相色谱，以甲醇：水按体积比1：4～1：0洗脱，按500mL为一个流份接收，薄层层析检测，合并含甾体皂苷类化合物的第8～10流份，减压蒸干溶剂后得120.4mg样品；

步骤八：经分离纯化得到甾体皂苷类化合物的纯品。

所述步骤二中预设的回流提取时间为2个小时，共提取5次。

进一步的，所述步骤八中采用的是半制备高效液相色谱法分离纯化得到甾体皂苷类化合物的纯品。

采用上述技术方案，将存在于宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物进行了提取。提取的甾体皂苷类化合物具有较好的生物活性，能够有效的抑制肿瘤细胞的增殖。该甾体皂苷类化合物糖基中的β-D-呋喃果糖基非常罕见。

本发明提取的甾体皂苷类化合物，可作为新抗肿瘤药物或者辅助成分应用于抗肿瘤药物中，抑制肿瘤的效果明显，为治疗和治愈肿瘤提供了新的药物研发方向。

实施例三：

一种从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物应用于制备抗肿瘤药物中。

进一步的，从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物应用于制备抗肿瘤药物中。

进一步的，所述的抗肿瘤药物为抗胶质瘤、宫颈癌、肝癌或胰腺癌的药物。

更进一步的，所述的胶质瘤为LN229人胶质瘤细胞或U251人胶质瘤细胞；所述的宫颈癌为Hela人宫颈癌细胞。

更进一步的，所述的胰腺癌为capan-2人胰腺癌细胞；所述的肝癌为HepG2人肝癌细胞。

进一步的，所述甾体皂苷类化合物单独使用或与其他药物混合，配制成在临床上使用的注射剂、散剂、丸剂、片剂、微囊剂、软胶囊剂、膜剂、膏剂、酊剂、颗粒剂或气雾剂。

实施例四：

一种从宽叶重楼中提取甾体皂苷类化合物的方法。

甾体皂苷类化合物的化学名称为：薯蓣皂苷元-3-O-β-D-呋喃果糖基-(1→6)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷，以下简称PPL1。

以宽叶重楼为原料，将其根茎粉碎后，取2.8kg，加入24L浓度为70％的乙醇进行回流提取，共提取5次，每次2小时，将5次的提取液进行合并，之后减压回收乙醇，得提取物；将该提取物分散于3L水中，用石油醚萃取3次，每次3L；萃取后的水相再用水饱和正丁醇萃取3次，每次3L，合并水饱和正丁醇萃取液，减压回收正丁醇后得到总皂苷提取物。

样品采用羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇洗脱，按500mL为一个流份接收，薄层层析检测，合并含PFP1的第4～8流份，减压蒸干溶剂后得1g样品。

将1g样品再用中压制备液相色谱，以甲醇：水按体积比1：4～1：0洗脱，按500mL为一个流份接收，薄层层析检测，合并含PPL1的第8～10流份，减压蒸干溶剂后得120.4mg样品。

最后经半制备高效液相色谱HPLC分离纯化得到PPL1的纯品。

实施例五：

一种从宽叶重楼中提取甾体皂苷类化合物的方法。

制备PPL1的宽叶重楼原料采自陕西省宝鸡市眉县。将其根茎2.8kg粉碎成粗粉后，加入24L质量百分比浓度为70％的乙醇进行回流提取，共提取5次，每次2小时，将5次提取液进行合并后，减压回收乙醇，得提取物611g；将提取物分散于3L水中，用石油醚萃取3次，每次3L；萃取后的水相再用水饱和正丁醇萃取3次，每次3L，合并水饱和正丁醇萃取液，减压回收正丁醇后得到总皂苷提取物135g。

样品采用羟丙基葡聚糖凝胶(GE-Healthcare公司)柱层析，以甲醇洗脱，按200mL为一个流份接收，薄层层析检测，合并含PPL1的第4～8流份，减压蒸干溶剂后得1g样品。将1g样品用中压制备液相色谱(Burch公司)，以甲醇：水按体积比1：4～1：0洗脱，按500mL为一个流份接收，薄层层析检测，合并含PPL1的第8～10流份，减压蒸干溶剂后得120.4mg样品。

最后经高效液相色谱仪(Gilson公司)分离纯化(HPLC条件为：Hedra ODS-2色谱柱20×250mm，40％乙腈为流动相，流速12mL/min，25℃，206nm紫外检测)，得到PPL1的纯品15.6mg。

实施例六：

如图2-图7所示，对实施例五提取的化合物PPL1的结构进行鉴定。具体鉴定过程如下：

化合物PPL1为白色粉末，溶于甲醇，Liebermann-Burchard即乙酸酐-浓硫酸反应和Molish反应即紫环反应呈阳性，20％硫酸乙醇溶液显色反应呈紫红色，表明该化合物可能是甾体皂苷类化合物。ESI-MS给出其准分子离子峰m/z 885.4854[M+H]⁺，(calc.forC₄₅H₇₃O₁₇,885.48)，结合¹³C-NMR(200MHz，氘代甲醇)谱图(如图3)中数据，如表1所示，确定其分子式为C₄₅H₇₂O₁₇。

在¹H-NMR谱(如图2)中显示高场区有5个特征甲基氢信号，分别为：δ_H 0.96(d,J＝7.02Hz)、0.80(s)、0.79(d,J＝6.49Hz)、1.23(d,J＝6.21Hz)和1.05(s)，分别与δ_C 14.88、16.77、17.49、17.98和19.85信号相对应。1个烯氢质子信号δ_H 5.20和其对应的烯烃碳信号δ_C122.65(C-6)，δ_C 141.89(C-5)，1个半缩醛季碳信号δ_C 110.60(C-22)。在¹³C-NMR谱中一共存在着四个季碳的信号δ_C 141.89(C-5)、δ_C 38.03(C-10)、δ_C 41.43(C-13)、δ_C110.60(C-22)，结合上述数据，可以确定PPL1的苷元为薯蓣皂苷元。同时H-6(δ_H5.38)与H-7(δ_H 1.98)在¹H-¹H COSY(如图4所示)谱中相关，表明三取代双键为Δ⁵⁽⁶⁾，在NOESY(如图6所示)谱中，H₃-19β/H-1a(δ_H 1.88)和H-1b(δ_H1.10)/H-3(δ_H 3.58)的NOE相关峰表明3-OH是β构型；C-16、C-17的化学位移值分别为δ_C82.22,63.74，表明C-17位没有羟基；通过H₂-26化学位移值差δ_Ha-δ_Hb＝3.44-3.32＝0.12<0.48，可以确定C₂₅为R构型。

化合物PPL1经过离子色谱以及酸水解后的衍生化反应分析表明其糖基为D-葡萄糖，L-鼠李糖和D-果糖，组成比为1：1：1。在¹H-NMR谱中(如图2所示)显示D-葡萄糖和L-鼠李糖的端基氢信号δ_H 4.49(d,J＝7.84Hz,Glc H-1′),5.20(br s,Rha H-1″)，在HSQC(如图7所示)谱中找到其对应的碳信号(δ_C 100.85,102.15)，和D-果糖的碳信号(δ_C105.15)。由Glc端基氢耦合常数可以确定其苷键为β构型。通过鼠李糖C-3和C-5的化学位移可以推测其形成的苷键构型为α构型。在HMBC谱中(如图5所示)，葡萄糖H-1和苷元C-3存在远程相关信号，说明葡萄糖连接在苷元C-3位；鼠李糖H-1与葡萄糖C-2存在远程相关，表明鼠李糖连接于葡萄糖的C-2位；果糖H-1与葡萄糖Glc C-6位存在远程相关，表明果糖的H-1连接于葡萄糖的C-6位。综上所述，PPL1的结构被鉴定为薯蓣皂苷元-3-O-β-D-呋喃果糖基-(1→6)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。

表一：

化合物的¹H和¹³C核磁共振数据(测试溶剂：氘代甲醇)

实施例七：

一种从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物的应用，将从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物应用于制备抗肿瘤药物中。

进一步的，所述的抗肿瘤药物为抗胶质瘤、宫颈癌、胰腺癌、肝癌或胃癌的药物。

进一步的，所述的胶质瘤为LN229人胶质瘤细胞或U251人胶质瘤细胞。

进一步的，所述的宫颈癌为Hela人宫颈癌细胞。

进一步的，所述的胰腺癌为capan-2人胰腺癌细胞。

进一步的，所述的肝癌为HepG2人肝癌细胞。

对实施例五分离提纯得到的化合物PPL1进行体外抗肿瘤试验。

试验所采用的细胞为人胶质瘤细胞(LN229、U251)、人宫颈癌细胞(Hela)、人胰腺癌细胞(capan-2)、人肝癌细胞(HepG2)；采用常规的CCK-8法测试。

实施方法为：取在对数生长期生长状态良好的肿瘤细胞U251、LN229、Hela、HepG2和capan-2细胞，调整细胞密度至6×104个/mL。取细胞悬液接种于96孔板上，100μL/孔，置恒温CO2培养箱中孵育24h后给药。将细胞分为空白对照组、阳性对照组和实验组，PPL1、重楼皂苷Ⅰ(PolyphyllinⅠ)、重楼皂苷Ⅱ(PolyphyllinⅡ)和薯蓣皂苷(Dioscin)的浓度均设置为0.5、1、2、4、8、16、32和64μM，每组分别设置3个复孔。细胞培养24小时后，按照CCK-8试剂使用说明操作，每孔加入10μL CCK-8试剂，恒温培养箱孵育2个小时，用酶联免疫检测仪在波长为450nm处测定每孔的吸光值(OD值)。并计算药物对肿瘤细胞的抑制率(计算公式：细胞抑制率＝(实验组OD值-空白组对照组OD值)/空白对照组OD值×100％)。再采用SPSS16.0计算半数抑制浓度(IC50)，IC50＞20μM表示无细胞毒性作用。

其中，所述的重楼皂苷I、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷是在制备甾体皂苷类化合物PPL1过程中总皂苷混合物根据薄层层析检测和体外抗肿瘤活性筛选所得的产物。

试验结果见下表2。

表2

化合物PPL1、重楼皂苷I、重楼皂苷Ⅱ和薯蓣皂苷对五种肿瘤细胞株LN229、U251、Capan-2、Hela和HepG2的抑制作用对比实验数据(IC50值，μM)

结果显示，化合物PPL1对五种肿瘤细胞的作用均强于重楼皂苷Ⅱ和薯蓣皂苷。其中对于HepG2(人肝癌细胞)的抑制作用略弱于重楼皂苷Ⅰ，Hela(人宫颈癌细胞)的抑制作用与重楼皂苷Ⅰ相当，其余肿瘤细胞的抑制作用均强于重楼皂苷Ⅰ。

总结：本发明的甾体皂苷类化合物PPL1对LN229(人胶质瘤细胞)、U251(人胶质瘤细胞)、capan-2(人胰腺癌细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)和HepG2(人肝癌细胞)这几种人肿瘤细胞系均有显著的抑制作用，其半数抑制浓度(IC50值)分别为4.18±0.31、3.85±0.44、3.26±0.34、3.30±0.38、4.32±0.51。

实施例八：

一种从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物的应用，所述甾体皂苷类化合物单独使用或与其他药物混合，配制成在临床上使用的注射剂、散剂、丸剂、片剂、微囊剂、软胶囊剂、膜剂、膏剂、酊剂、颗粒剂或气雾剂。

在不冲突的情况下，本领域的技术人员可以根据实际情况将上述各示例中相关的技术特征相互组合，以达到相应的技术效果，具体对于各种组合情况在此不一一赘述。

需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。

另外，在本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。

以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖性特点相一致的最宽的范围。依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物，其特征在于：甾体皂苷类化合物为：薯蓣皂苷元-3-O-β-D-呋喃果糖基-(1→6)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷；其结构式如下：

2.如权利要求1所述的一种从宽叶重楼中提取甾体皂苷类化合物的方法，其特征在于：包括如下步骤，

步骤一：取宽叶重楼原料，并将其根茎粉碎；

步骤二：按照1kg:(8～9)L的比例,取步骤一粉碎后的根茎，加入比例份的浓度为70％的乙醇，每间隔预设时间，进行回流提取；

步骤三：将步骤二中的回流提取液合并后，减压回收乙醇，得提取物；

步骤四：将步骤三得到的提取物分散于与所取粉碎后的根茎重量数相同升数的水中，再用石油醚萃取，至少进行3次萃取，每次萃取3L；

步骤五：萃取后的水相再用水饱和正丁醇萃取至少3次，每次萃取3L，合并水饱和正丁醇萃取液，减压回收正丁醇后得到总皂苷提取物；

步骤六：取步骤五得到的总皂苷提取物样品，采用羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇洗脱，按500mL为一个流份接收，薄层层析检测，合并含甾体皂苷类化合物的第4～8流份，减压蒸干溶剂后得1g样品；

步骤七：将1g样品再用中压制备液相色谱，以甲醇：水按体积比1：4～1：0洗脱，按500mL为一个流份接收，薄层层析检测，合并含甾体皂苷类化合物的第8～10流份，减压蒸干溶剂后得120.4mg样品；

步骤八：经分离纯化得到甾体皂苷类化合物的纯品。

3.如权利要求2所述的一种从宽叶重楼中提取甾体皂苷类化合物的方法，其特征在于：所述步骤二中预设的回流提取时间为2个小时，共提取5次；所述步骤八中采用的是半制备高效液相色谱法分离纯化得到甾体皂苷类化合物的纯品。

4.如权利要求1所述的一种从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物的应用，其特征在于：将从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物应用于制备抗肿瘤药物中。

5.如权利要求5所述的一种从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物的应用，其特征在于：所述的抗肿瘤药物为抗胶质瘤、宫颈癌、肝癌或胰腺癌的药物。

6.如权利要求5所述的一种从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物的应用，其特征在于：所述的胶质瘤为LN229人胶质瘤细胞或U251人胶质瘤细胞。

7.如权利要求5所述的一种从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物的应用，其特征在于：所述的宫颈癌为Hela人宫颈癌细胞。

8.如权利要求5所述的一种从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物的应用，其特征在于：所述的胰腺癌为capan-2人胰腺癌细胞。

9.如权利要求5所述的一种从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物的应用，其特征在于：所述的肝癌为HepG2人肝癌细胞。

10.如权利要求5所述的一种从宽叶重楼中提取的甾体皂苷类化合物的应用，其特征在于：所述甾体皂苷类化合物单独使用或与其他药物混合，配制成在临床上使用的注射剂、散剂、丸剂、片剂、微囊剂、软胶囊剂、膜剂、膏剂、酊剂、颗粒剂或气雾剂。

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