CN117757803A - 一种刺葡萄VdMYB4基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种刺葡萄VdMYB4基因及其编码蛋白和应用。所述刺葡萄VdMYB4基因位于刺葡萄的5号染色体上，分布于8020439‑8021562区域。所述刺葡萄VdMYB4基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。以及所述刺葡萄VdMYB4基因在沉默后提高植物对病原菌的抗性中的应用。本发明提供的VdMYB4基因在沉默后能提高巨峰葡萄对炭疽病的抗性，为葡萄抗炭疽病育种提供理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种刺葡萄VdMYB4基因及其编码蛋白和应用。
背景技术
葡萄(Vit is vinifera L.)是世界最古老的果树树种之一，原产亚洲西部，世界各地均有栽培，世界各地的葡萄约95％集中分布在北半球，是世界上种植最广泛的水果之一。炭疽病(Anthracnose)是由半知菌亚门刺盘孢属真菌侵染所致，是葡萄上世界性的重要病害，不仅影响葡萄产量，还严重影响葡萄的品质。葡萄炭疽病主要发生在葡萄果实穗轴上，也能侵害叶片、新梢、卷须、果梗等部位，但症状不如果实和穗轴上明显。
目前在葡萄栽培生产中，主要用杀菌剂来控制炭疽病菌，但杀菌剂的使用不仅危害环境与健康，还会增强病原菌的抗药性。由于使用杀菌剂控制炭疽病传播的不良影响，人们越来越关注杂交来选育抗炭疽病的鲜食葡萄。
前期研究表明在葡萄响应炭疽病侵染的防御反应机制只有少数抗病基因的功能得到报道，尤其是有关葡萄属植物与炭疽病互作网络、关键应答基因的分离与功能分析的研究报道更少。本发明通过解析转录因子参与炭疽病胁迫响应的功能特点与作用机制，为丰富葡萄抗炭疽病胁迫理论和葡萄抗炭疽病育种提供依据。
发明内容
本发明要解决的技术问题，在于提供一种刺葡萄VdMYB4基因及其编码蛋白，敲除后可以提高植物对炭疽病的抗性。
本发明是这样实现的：
本发明首先提供了一种刺葡萄VdMYB4基因，位于刺葡萄的5号染色体上，分布于8020439-8021562区域。
具体地，所述刺葡萄VdMYB4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了所述刺葡萄VdMYB4基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，含有myb DNA-binding结构域，且与欧洲葡萄同源性最高。
最后，本发明提供了所述刺葡萄VdMYB4基因在沉默后提高植物对病原菌的抗性中的应用。病原菌胁迫下VdMYB4基因表达量先下调后上调，在巨峰葡萄果实沉默VdMYB4后发现其可增强对炭疽病侵染的抗性。
进一步地，所述病原菌为致病炭疽菌。
进一步地，所述植物包括葡萄。
进一步地，通过构建沉默载体用于沉默所述刺葡萄VdMYB4基因。
更进一步地，所述沉默载体包含所述刺葡萄VdMYB4基因、与其可操作连接的pCambia2300-GFP载体及病毒诱导基因沉默载体pTRV-GATEWAY。
本发明具有如下优点：
本发明提供了一种刺葡萄VdMYB4基因，其核酸序列为SEQ ID No.1所示，全长762bp，编码253个氨基酸，氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，含有myb DNA-binding结构域，且与欧洲葡萄高度同源，编码的蛋白位于细胞核上。
本发明分析了刺葡萄果实经炭疽菌侵染后，其果皮中VdMYB4的表达情况，实验证明，随侵染的进行，VdMYB4表达量先降低后升高，表明VdMYB4可响应葡萄炭疽病侵染。
本发明通过克隆VdMYB4序列，构建沉默载体TRV::VdMYB4，转化巨峰果实，果实接种炭疽菌后，相较于TRV::00(对照)发病症状较轻。验证了VdMYB4沉默后可增强巨峰葡萄对炭疽病的抗性。因此，本发明提供的VdMYB4基因在沉默后能提高巨峰葡萄对炭疽病的抗性，为葡萄抗炭疽病育种提供理论基础。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为刺葡萄与部分物种VdMYB4同源蛋白序列聚类分析，其中黄色字体代表刺葡萄(Vi tis davidii)VdMYB4。
图2为VdMYB4基因构建到pCambia2300-GFP以及pTRV2-GATEWAY载体上示意图。
图3为刺葡萄VdMYB4蛋白结构域分析图。
图4为刺葡萄VdMYB4染色体定位。
图5为VdMYB4响应葡萄炭疽病诱导表达量分析图。
图6为VdMYB4亚细胞定位分析图(标尺为25μm)以及酵母转录激活活性分析。
图7为干扰后巨峰葡萄RT-qPCR检测结果及对炭疽菌抗性的分析图；A:RT-qPCR检测葡萄的干扰效率；B为病毒诱导基因沉默VdMYB4巨峰果实接种炭疽菌5d后表型(左为对照，右为沉默VdMYB4)，其中白色部分为接种的菌块，黑色虚线圈起来的部分为病斑。
具体实施方式
下面结合附图通过实施例来对本发明进行详细说明，但并不是对本发明的限制，仅作为示例说明。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中所用的菌种及质粒：
试验所用的过表达载体pCambia2300-GFP，干扰载体pTRV2-GATEWAY；烟草表皮细胞定位分析及病毒诱导基因沉默实验所用的侵染农杆菌为GV3101(p19+pSoup)菌株；所用的大肠杆菌Top10感受态细胞从TianGen公司购买。
实施例中所用的主要试剂包括反转录试剂盒，qRT-PCRsupperMix(Transgen公司)，质粒提取试剂盒，植物RNA提取试剂盒，胶回收试剂盒，LA高保真酶，蔗糖，MS粉末，Tris，琼脂粉，CTAB，75％乙醇，无水乙醇。
实施例中诱导实验过程中的培养基：1/2MS液体培养基。
实施例1MYB4CDS序列克隆与载体构建
1.分别利用下列引物对刺葡萄(Vitis davidii(Rom.Caill.))cDNA文库中克隆MYB4的全长以及特异片段
SEQ ID No.3：
p2300-VdMYB4-BamHI-F:
tcggtacccggggatccATGGTAAGAGCTCCTTGTTG
SEQ ID No.4：
p2300-VdMYB4-Sal I-R:
gctcaccatggtgtcgacCTTACAGGAGCTTTGA
SEQ ID No.5：
Attb1-VdMYB4:
ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcACGCGCTGTCCTCTGATAAT
SEQ ID No.6：
Attb2-VdMYB4:
ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcGCCGCCAGATCTAATGAAAA
注：小写序列为接头引物(载体序列)，大写为基因序列。
2.构建载体
参照博迈德公司和英潍捷基公司的无缝克隆试剂盒进行同源重组反应(如图2)，将上述获得的胶回收产物，与线性化载体(pCambia2300-GFP和pTRV2载体)混合，同时加入反应液，反应体系为10μL/1μL，在37℃/250℃下反应60min，随后冰浴15min，进行后续的反应。经过PCR验证以及测序检测序列正确方可用于后续实验。
实施例2VdMYB4生物信息学分析
将VdMYB4的氨基酸序列放到BLAST网站上进行序列比对，并将不同物种的同源序列下载，用于构建系统进化树(图1)。VdMYB4的氨基酸序列相似性，使用MEGA6进行多重比较。刺葡萄VdMYB4基因位于刺葡萄的12号染色体上，分布于5138849-5140246区域(图4)。系统进化树的构建采用最大似然法(NJ)进行。以VdMYB4氨基酸序列应用Clustw程序与欧洲葡萄、拟南芥、栽培稻、烟草、番茄和大豆进行了比对。结果如图3所示，VdMYB4全长762bp，编码253个氨基酸。
实施例3VdMYB4基因的表达模式分析
采用针刺法对刺葡萄进行炭疽菌(盘长孢状刺盘孢)接种，并采集在炭疽菌侵染后的葡萄果皮为试验材料。进行RT-qPCR并对VdMYB4基因的表达模式进行分析。
结果如图5所示，刺葡萄接种葡萄炭疽菌后的0d、1d、2d、4d和6d果皮中的VdMYB4表达量随着侵染的进行，先降低后升高，在第6d达到最大值。表明VdMYB4可以响应葡萄炭疽病而诱导表达。
实施例4烟草亚细胞定位及转录自激活分析
将测序正确的重组质粒使用电激法，转入农杆菌GV3101中将正确的菌液在含有同样生素的10mL LB液体培养基中扩大培养。5000rpm离心5min，弃去上清液，用重悬液(MES2.130g/L+MgCl 22.03g/L+蔗糖20g/L)重悬菌体并清洗3次。将重悬菌液稀释至OD600＝0.4，随后加入AS(200mmol·L-1)避光条室温静置3h激活农杆菌。用无针头的1mL注射器在健康的本氏烟草叶背面注射入重悬菌液，在光照培养箱中培养48h，通过激光共聚焦显微镜下(莱卡TCSSP8)观察烟草叶片中GFP融合蛋白的分布，并保存图片。
结果如图6所示，表明VdMYB4-GFP蛋白定位在细胞核上。为了验证VdMYB4是否具有转录激活活性，本发明利用酵母体系进行转录激活活性进行验证。将VdMYB4全长CDS构建到pGBKT7载体上，转化到酵母菌株Y2H Gold后在缺失色氨酸的培养基上生长，检测VdMYB4全长是否具有激活报告基因ADE2和HIS3表达的能力，空载pGBKT7作为阴性对照(单独表达GAL4的结合区域)。结果显示，而VdMYB4全长具有自激活活性(CaWRKY41作为阳性对照，已公开)。
实施例5病毒诱导基因沉默VdMYB4在葡萄上以及对炭疽病的抗性分析
本发明所用的基因沉默是采用烟草花叶病病毒(TRV)介导的VIGS，即通过设计基因的特异性片段，利用Gateway载体构建方法将VdMYB4特异部分片段最终连接到pTRV2载体上。通过农杆菌转化，挑取单克隆验证，摇菌。将最终重悬的农杆菌的浓度调至OD600＝1左右，随即将空载pTRV2以及携带目的基因VdMYB4的pTRV2分别与pTRV1按1：1混匀，在28℃，80-100rpm，混匀3-4h。随后将转色后2-3周后的巨峰葡萄果实浸泡在pTRV1和pTRV2-MYB4的单独混合物中，真空浸润10分钟。空pTRV2和pTRV1载体共浸润作为阴性对照实验。用干净的吸水纸擦拭葡萄果实表面，去除任何残留的菌液，在26℃和60％相对湿度的黑暗条件下孵育24h，然后在26℃，100μmol m-2s-1，16/8h(光照/黑暗)下培养3d后可进行后续实验。将果实采用针刺接种法，取直径为5mm的盘长孢状刺盘孢块接种于针刺部位，置于25℃恒温培养箱内培养并保持湿度，5d后观察葡萄果实病害症状及果实上病斑的大小，评估炭疽病在葡萄的发病程度。
为了深入了解VdMYB4在葡萄中对于病原菌的耐性，通过病毒诱导基因沉默VdMYB4在转色后的巨峰葡萄果实中。RT-qPCR结果显示，沉默后的植株(TRV::VdMYB4)中VdMYB4的表达水平显著下降(图7中A)；通过对沉默以及对照的葡萄果实接种炭疽病5d后结果显示，相比于对照(TRV::00)，TRV::VdMYB4沉默的果实具有更不明显的病斑(图7中B)，表明沉默TRV::VdMYB4后可增强葡萄果实对炭疽病的抗性。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
Claims (8)
1.一种刺葡萄VdMYB4基因，其特征在于：位于刺葡萄的5号染色体上，分布于8020439-8021562区域。
2.根据权利要求1所述的刺葡萄VdMYB4基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
3.如权利要求1或2所述刺葡萄VdMYB4基因编码的蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.如权利要求1或2所述刺葡萄VdMYB4基因在沉默后提高植物对病原菌的抗性中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述病原菌为致病炭疽菌。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物包括葡萄。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：通过构建沉默载体用于沉默所述刺葡萄VdMYB4基因。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述沉默载体包含所述刺葡萄VdMYB4基因、与其可操作连接的pCambia2300-GFP载体及病毒诱导基因沉默载体pTRV-GATEWAY。
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