CN117757651A - 优化苏氨酸脱水酶或脱氨酶表达提高l-异亮氨酸产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过筛选及优化启动子表达苏氨酸脱水酶或脱氨酶ilvA以提高L‑异亮氨酸产量的方法，采用基因工程的方法获得基因工程菌株，通过筛选不同类型的启动子用于表达解除了L‑异亮氨酸抑制的苏氨酸脱水酶或脱氨酶的基因。将所述基因工程菌株进行发酵培养，培养过程中加入苏氨酸，培养结束后从培养物中分离出L‑异亮氨酸。本发明还公开了高产L‑异亮氨酸的基因工程菌株。
Description
技术领域
本发明属于生化工程领域，涉及高产L-异亮氨酸的基因工程菌以及应用该菌种发酵生产L-异亮氨酸的方法。
背景技术
L-异亮氨酸又称“L-异白氨酸”，是人体必需的三种支链氨基酸(Branched chainamino acid，BCAA)之一，具有多种生理功能，参与人体内激素、酶类的合成，促进蛋白质生成并抑制其分解，对人体和动物健康有重要的调节作用，因此在食品、医药和饲料等行业具有广泛的应用及商业价值。
目前工业上生产L-异亮氨酸的生产方法主要是微生物发酵法，微生物发酵法是利用微生物的代谢途径，生物合成并过量积累L-异亮氨酸的方法，包括直接发酵法和添加前体发酵法两类。其中直接发酵法借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对特定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性变异株，以解除代谢调控中的反馈抑制与阻遏，达到过量积累某种氨基酸的目的。目前直接发酵生产L-异亮氨酸的菌株大多由谷氨酸产生菌(黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌等)诱变选育而来。添加前体发酵法又称微生物转化法，微生物使用葡萄糖作为发酵碳源、能源，并在发酵过程中添加特异的前体物质以避免氨基酸生物合成途径中的反馈调节作用，经微生物作用将其高效转化为目的氨基酸。对于L-异亮氨酸，其前体物质主要包括α-氨基丁酸、α-羟基丁酸、α-酮基丁酸和苏氨酸等，采用的微生物主要有大肠杆菌、芽孢杆菌和假单胞菌等。
苏氨酸脱水酶或脱氨酶是异亮氨酸合成途径中的关键酶，可催化苏氨酸形成关键前体物质α-酮基丁酸，它的活性受异亮氨酸的反馈抑制。另一方面，α-酮基丁酸的积累会抑制菌体生长，干扰宿主菌的正常代谢，不利于异亮氨酸的生产。因此，在发酵生产异亮氨酸的过程中合理的表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶或脱氨酶可能会增加异亮氨酸的产量。
目前，国内已有多家企业通过发酵法进行L-异亮氨酸的生产，但仍存在产酸水平低、转化率低、副产物多且发酵产物提取技术差等问题。因此，改进L-异亮氨酸的发酵菌株及技术工艺，提高产酸水平和转化率，进而降低提取难度，对于推动L-异亮氨酸产业的可持续发展及增强产品的市场竞争力具有重要意义。
发明内容
本发明涉及一种通过筛选及优化启动子表达苏氨酸脱水酶或脱氨酶以提高L-异亮氨酸产量的方法，采用基因工程的方法获得基因工程菌株，通过筛选不同类型的启动子用于表达解除了L-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱水酶或脱氨酶的基因。将所述基因工程菌株进行发酵培养，培养过程中加入苏氨酸，培养结束后从培养物中分离出L-异亮氨酸。本发明还公开了高产L-异亮氨酸的基因工程菌株。
本发明提供一种用于生产L-异亮氨酸的基因工程菌株，所述基因工程菌株通过以下启动子表达解除了L-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱水酶或脱氨酶的基因：
微氧启动子Padhe、微氧启动子Ppfl、生长稳定期启动子PbolA、生长稳定期启动子Pfic、丙酮酸响应启动子Pbtss、丙酮酸响应启动子Pbtst、胁迫响应启动子PrpoS、来源于透明颤菌的血红蛋白启动子Pvgb、组成型启动子P1-93、组成型启动子P1-37、组成型启动子P1-30、组成型启动子P1-46、组成型启动子P1-64。
在一些实施方案中，所述解除了L-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱水酶或脱氨酶的基因为解除型ilvA基因或tdcB基因，优选为解除型ilvA基因。
在一些实施方案中，所述解除型ilvA基因片段编码的ilvA蛋白具有L447F和/或L451A突变。
在一些实施方案中，所述解除型ilvA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一些实施方案中，微氧启动子Padhe、微氧启动子Ppfl、生长稳定期启动子PbolA、生长稳定期启动子Pfic、丙酮酸响应启动子Pbtss、丙酮酸响应启动子Pbtst、胁迫响应启动子PrpoS、来源于透明颤菌的血红蛋白启动子Pvgb、组成型启动子P1-93、组成型启动子P1-37、组成型启动子P1-30、组成型启动子P1-46、组成型启动子P1-64的序列分别如SEQ ID NO:2-14所示。
所述基因工程菌株中包含重组质粒，重组质粒包括所述启动子和解除了L-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱水酶或脱氨酶的基因，优选解除型ilvA基因或tdcB基因，最优选解除型ilvA基因。
在一些实施方案中，所述基因工程菌株中进一步表达乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因，优选地上述基因为实质上解除了L-异亮氨酸和/或L-缬氨酸抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶基因，进一步优选地，所述实质上解除了L-异亮氨酸和/或L-缬氨酸的抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因为解除型ilvIH基因、解除型ilvBN基因、解除型ilvGM基因、解除型alsS基因中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述基因工程菌株进一步表达苏氨酸转运蛋白基因、乙酰羟酸异构酶基因(ilvC)、二羟酸脱水酶或脱氨酶基因(ilvD)、支链氨基酸氨基转移酶基因(ilvE)、支链氨基酸脱氢酶基因中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述基因工程菌株通过基因工程改造将碳代谢流最大化集中到丙酮酸并导向目标氨基酸，所述基因工程菌株中乙醇、乙酸、乳酸为代表的杂酸杂醇代谢副产物的生成通路被减弱或阻断，例如下列基因ldhA、adhE、pta、poxB的活性分别或同时被减弱或消除。
在一些实施方案中，所述基因工程菌株敲除下列基因：ldhA、pta、poxB、adhE、pflB、mgsA、frdA、dadA、avtA、ilvE。
在一些实施方案中，所述工程菌株为野生或者基因工程改造过的大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、短杆菌(Brevibacterium)、酵母(Yeast)、棒杆菌(Corynebacterium)或链霉菌(Streptomyces)。
在一些实施方案中，所述工程菌株具有比野生型菌株低30％以上的从培养基吸收BCAA的能力，和/或所述工程菌株具有比野生型菌株高30％以上的从胞内向胞外外排分泌BCAA的能力；优选地，所述工程菌株中的支链氨基酸-阳离子同向转运蛋白活性或支链氨基酸-苯丙氨酸ABC转运系统活性被分别或同时被减弱或消除，进一步优选地，敲除或突变brnQ基因或抑制brnQ基因的表达；进一步优选地敲除或突变livJKHMGF基因的一个或多个或抑制livJKHMGF基因一个或多个的表达；优选地，转运蛋白(外排)基因ygaZH、brnEF、yjeH或leuE的表达被增强，进一步优选，增强ygaZH、brnEF、yjeH或leuE表达的方式包括过表达内源性或外源性相应基因、或强启动子替换或敲除抑制元件。
本发明提供上述基因工程菌株在制备L-异亮氨酸中的应用。
本发明提供一种L-异亮氨酸的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
1)在培养基中培养上述基因工程菌株；
2)分离L-异亮氨酸。
所述培养基中加入能转化为2-酮丁酸的原料；优选地，所述能转化为2-酮丁酸的原料包括苏氨酸、富马酸、天冬氨酸、高丝氨酸、丙酸、2-氨基丁酸中的一种或几种。
本发明提供一种含有ilvA基因启动子序列的生物材料，所述生物材料包括启动子和解除了L-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱水酶或脱氨酶的基因，优选解除型ilvA基因或tdcB基因，最优选解除型ilvA基因；
所述启动子选自微氧启动子Padhe、微氧启动子Ppfl、生长稳定期启动子PbolA、生长稳定期启动子Pfic、丙酮酸响应启动子Pbtss、丙酮酸响应启动子Pbtst、胁迫响应启动子PrpoS、来源于透明颤菌的血红蛋白启动子Pvgb、组成型启动子P1-93、组成型启动子P1-37、组成型启动子P1-30、组成型启动子P1-46、组成型启动子P1-64。
在一些实施方案中，所述解除型ilvA基因片段编码的ilvA蛋白具有L447F和/或L451A突变。
在一些实施方案中，所述解除型ilvA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一些实施方案中，微氧启动子Padhe、微氧启动子Ppfl、生长稳定期启动子PbolA、生长稳定期启动子Pfic、丙酮酸响应启动子Pbtss、丙酮酸响应启动子Pbtst、胁迫响应启动子PrpoS、来源于透明颤菌的血红蛋白启动子Pvgb、组成型启动子P1-93、组成型启动子P1-37、组成型启动子P1-30、组成型启动子P1-46、组成型启动子P1-64的序列分别如SEQ ID NO:2-14所示。
所述生物材料为表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体或病毒载体。
本发明提供上述生物材料在制备L-异亮氨酸合成菌株中的应用。
本发明提供上述生物材料在制备L-异亮氨酸中的应用。
有益效果：
本发明提供包含不同的ilvA基因启动子序列的重组质粒、包括所述重组质粒的工程菌株，以及利用所述工程菌株发酵培养制备L-异亮氨酸的方法。其中，利用所述工程菌株能够显著有效的提高L-异亮氨酸的产量。
具体实施方式
定义
在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。
也应理解本文使用的术语仅是为了描述具体实施方式的目的，并不意欲是限制性的。本文中使用冠词“一”和“所述”来指代冠词的语法宾语中的一个或多于一个。替代方案(例如，“或”)的使用应当被理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。术语“和/或”应当被理解为意指替代方案中的一个或两个。如本文使用的和除非另作说明，术语“大约”指的是可测量的值诸如量、时间期间等时，表示包括从给定值±10％的变化，更优选±5％，甚至更优±1％，和还要更优选±0.1％的变化，只要这种变化适于实施公开的方法。如本文所用，术语“基因合成”，指利用重组DNA技术产生或利用本领域可用和公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。“编码”指的是多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特异性序列用作模板合成在生物学过程中的其他多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一个和由其产生的生物学性质。因此，如果相应于那个基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物学系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。核苷酸序列等同mRNA序列并通常提供在序列表中的编码链，和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链两者，都可被称为编码那个基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
如本文所用，术语“内源的”指的是来自有机体、细胞、组织或系统的或在有机体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。
如本文所用，术语“外源的”指的是任何从有机体、细胞、组织或系统引入的或在有机体、细胞、组织或系统外产生的物质。
如本文所用，术语“表达”被定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
除非另有规定，“编码氨基酸序列的多核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有的核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可在某些版本中包含内含子(一个或多个)。
如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有的核酸序列，所述手段包括但不限于重组手段，即从重组文库或细胞基因组，利用克隆技术等克隆核酸序列，或者利用合成手段。
在各个说明性实施例中，本文所设想的多核苷酸包含但不限于包括表达载体、病毒载体、转移质粒、表达盒的多核苷酸和编码细胞因子抗体或抗体片段或抗原结合片段的多肽的多核苷酸。
如本文别处公开的或如本领域已知的，不管编码序列自身的长度如何，多核苷酸可以与其它DNA序列组合，如启动子和/或增强子、未转译区域(UTR)、聚腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多个克隆位点、内部核糖体进入位点(IRES)、重组酶识别位点、终止密码子、转录终止信号、转录后应答元件以及编码自切割多肽的多核苷酸、表位标签，从而使得其整体长度可以显著变化。因此，设想可以采用几乎任何长度的多核苷酸片段，总长度优选地受限于容易制备和用于预期重组DNA方案。
如本文所用的，术语“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。转移的核酸通常连接到例如插入到载体核酸分子中。载体可以包含引导细胞中的自主复制的序列或可以包含足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。很多载体在本领域中是已知的，包含但不限于质粒、噬菌粒、人工染色体、细菌噬菌体以及动物病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。
表达载体中存在的“表达控制序列”、“控制元件”或“调节序列”是载体的那些非转译区域——复制起点、选择盒、启动子、增强子、转译起始信号内含子、转录后调节元件、聚腺苷酸化序列、5′和3′未转译区域-其与宿主细胞蛋白交互以进行转录和转译。此类元件的长度和特异性可以变化。根据所利用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的适合的转录和转译元件，包含普遍存在的启动子和诱导型启动子。在特定实施例中，多核苷酸是包含但不限于表达载体和病毒载体的载体并且包含外源性、内源性或异源性控制序列，如启动子和/或增强子。“内源性”控制序列是与基因组中的给定基因天然连接的序列。“外源性”控制序列是通过遗传操纵(即分子生物技术)置于与基因并置从而使得那个基因的转录由连接的增强子/启动子引导的序列。“异源性”控制序列是来自与遗传操纵的细胞不同的物种的外源性序列。“合成”控制序列可以包括一个或多个内源性和/或外源性序列的元件和/或提供最佳启动子和/或增强子活性以用于特定基因治疗的在体外或计算机模拟确定的序列。如本文所用，术语“启动子”指代RNA聚合酶所结合的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。RNA聚合酶引发并转录与启动子可操作地连接的多核苷酸。
术语“启动子”指代含有能够提供启动子功能的序列的、DNA的片段。
术语“条件表达”可以指代任何类型的条件表达，包含但不限于：诱导型表达；可阻遏型表达；在具有特定生理、生物或疾病状态等的细胞或组织中的表达。这个定义不旨在排除细胞类型或组织特异性表达。某些实施例提供了感兴趣多核苷酸的条件表达，例如，表达通过使细胞、组织、生物体等经受使多核苷酸被表达或使感兴趣多核苷酸编码的多核苷酸的表达增加或减少的处理或条件来控制。
诱导型启动子/系统的说明性实例包含但不限于类固醇诱导型启动子，如编码糖皮质激素或雌性激素受体的基因的启动子、金属硫蛋白启动子；MX-1启动子、“基因开关”米非司酮可调系统、四环素依赖性调节系统等。
在一些实施例中，基因修饰细胞包括进一步包含实现属于体外阴性选择性表型的细胞的选择的阳性标记的多核苷酸。阳性选择性标记可以是基因，所述基因在被引入宿主细胞时表达允许阳性选择携带基因的细胞的显性表型。这一类型的基因在本领域中是已知。
在一个实施例中，阳性选择性标记和阴性选择性标记相连接，使得阴性选择性元件的丧失还伴随着阳性选择性标记的丧失。在特定实施例中，阳性和阴性选择性标记相融合，使得一个的丧失必定导致另一个的丧失。
如本文所用的，术语“转染”或“转化”或“转导”指的是如此过程，通过该过程外源的核酸被转移或引入受体菌株。“转染的”或“转化的”或“转导的”菌株是已经由外源核酸转染、转化或转导的菌株。该菌株包括原代和它的子代。所述受体菌株可以是大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、需钠弧菌(Vibrionatriegens)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。
在本申请说明书中，将编码实质上解除了L-异亮氨酸的抑制的苏氨酸脱水酶或脱氨酶的ilvA基因或tdcB基因称为“解除型ilvA基因”或“解除型tdcB基因”。
下文将结合具体实施例对本发明的合成方法做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为普遍市售商品，或者可以通过已知方法制备。
LB培养基：蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 1％，用30％ NaOH调节pH 7.2，1×105Pa灭菌20min。制成平板时另加琼脂1.5％。抗性筛选时根据抗性基因种类加入终浓度为100mg/L的氨苄青霉素和/或50mg/L的卡那霉素。
发酵罐发酵氨基酸流程：菌种超低温冰箱-80℃保存→平板活化→摇瓶培养→1L或5L发酵罐。培养菌种活化平板：每个平板用1mL移液器吸取0.12mL菌液涂布平板，于37℃恒温培养24h，挑取菌落形态正常的单菌落；LB种子摇瓶培养(培养体积100mL/500mL三角瓶)：温度37℃，转速200r/min，pH 7.2左右，培养时间8-10h，每2h中间过程取样，测定pH和OD600值；待OD满足要求时接入发酵罐。发酵培养基组分及流加条件见相应实施例具体内容说明。
氨基酸浓度的测定：L氨基酸标准品均购自Sigma-Aldrich公司(www.sigmaaldrich.cn)。取1mL发酵液，10000r/min离心5min去除菌体，经孔径0.22μm的滤膜过滤所得滤液，稀释合适倍数后，用高效液相色谱HPLC法(https://www.agilent.com/library/applications/5990-4547EN.pdf)测定样品中的支链氨基酸浓度。高效液相色谱仪为岛津Nexera LC-40，色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，4.6×250mm 5μm。检测器为DAD二极管阵列检测器，检测波长338nm，参比波长390nm。流动相组成，比例变化，流速及色谱柱温度均按照上述方法设置。
实施例1：不同启动子表达ilvA重组质粒及质粒pZSlac-ilvAIH的构建
通过PCR反应从质粒pZA-ilvAIH(见中国专利公开号：CN 114410701A)上扩增得到解除型ilvA基因片段(编码的ilvA蛋白具有L447F L451A突变)，利用重组克隆试剂盒，一步无缝连接解除型ilvA基因片段至质粒pZAlac(p15A复制子，卡那霉素抗性，lac启动子)上，得到重组质粒pZAlac-ilvA。以E.coli BW25113基因组为模板，PCR扩增得到微氧启动子(Padhe，Ppfl)、生长稳定期启动子(PbolA，Pfic)、胁迫响应启动子PrpoS以及丙酮酸响应启动子(Pbtss、Pbtst)；以pZAlac-ilvA质粒为模板，PCR扩增得到带有ilvA基因的载体骨架片段pZA-ilvA；利用重组克隆试剂盒，一步无缝连接各启动子片段与pZA-ilvA连接，同时替换原有的lac启动子，得到重组质粒pZA-Padhe-ilvA、pZA-Ppfl-ilvA、pZA-PbolA-ilvA、pZA-Pfic-ilvA、pZA-Pbtss-ilvA、pZA-Pbtst-ilvA和pZA-PrpoS-ilvA。此外，以pZAlac-ilvA为模板，通过环化PCR，将启动子替换为来源于透明颤菌的血红蛋白启动子Pvgb，及组成型启动子P1-93、P1-37、P1-30，P1-46及P1-64(启动子表达强度P1-93>P1-37>P1-30>P1-46>P1-64)得到重组质粒pZA-Pvgb-ilvA、pZA-P1-93-ilvA、pZA-P1-37-ilvA、pZA-P1-30-ilvA、pZA-P1-46-ilvA和pZA-P1-64-ilvA。
通过PCR从质粒pZA-ilvAIH上扩增得到ilvAIH片段，另通过PCR从质粒pZS-Pcsc-cscBKA(中国专利申请号2022116667471)上扩增pZSlac载体(pSC101复制子，壮观霉素抗性,lac启动子)片段，利用重组克隆试剂盒，一步无缝连接ilvAIH基因片段至pZSlac载体上，获得重组质粒pZS-ilvAIH。
实施例2：L-异亮氨酸生产菌的构建及摇瓶发酵
将实施例1中构建的不同启动子表达ilvA的pZA重组质粒分别转化异亮氨酸生产菌DV10(携带质粒pZE-ilvCmD-ilvE-ygaZH和实施例1构建的pZS-ilvAIH)(ΔldhAΔptaΔpoxBΔadhEΔpflBΔmgsAΔfrdAΔdadAΔavtAΔilvE)(相关菌株及质粒信息见中国专利公开号：CN 114410701A)，将得到的重组菌株按照下列方法进行摇瓶发酵。
培养基为在现有普遍采用的发酵培养基：葡萄糖4％、苏氨酸2％、丝氨酸0.1％、酵母提取物0.5％、MgSO4 0.12％、CaCl2 0.01％、NH4Cl 0.26％、NaCl 0.05％、Na2HPO40.6％、KH2PO40.3％、VB1 0.0005％、甜菜碱0.1％、MnSO4·5H2O 0.002％、烟酸0.01％。用NaOH和盐酸调节pH至7.0～7.2，121℃灭菌15min。
培养方法：将菌种接入带有适合浓度的抗生素LB培养基中，于37℃下培养10小时，转速220rpm。将LB培养物按照10％(V/V)接种量接入含有氨苄青霉素，卡那霉素和壮观霉素的发酵培养基中，置于250mL三角瓶中发酵(装液量30mL，含有0.6g CaCO3粉末)；在37℃，220rpm条件下培养至OD600为1，加入IPTG诱导(终浓度为0.2mM)，继续培养至48h停止发酵。其中发酵液中异亮氨酸的产量见表1。
表1实例2摇瓶发酵结果
| pZA质粒 | 异亮氨酸(g/L) |
| pZAlac-ilvA | 12.6 |
| pZA-Padhe-ilvA | 13.5 |
| pZA-Ppfl-ilvA | 10.3 |
| pZA-PbolA-ilvA | 9.8 |
| pZA-Pfic-ilvA | 12.3 |
| pZA-Pbtss-ilvA | 13.2 |
| pZA-Pbtst-ilvA | 14.9 |
| pZA-PrpoS-ilvA | 11.7 |
| pZA-P1-93-ilvA | 4.3 |
| pZA-P1-37-ilvA | 7.2 |
| pZA-P1-30-ilvA | 9.7 |
| pZA-P1-46-ilvA | 13.4 |
| pZA-P1-64-ilvA | 16.1 |
| pZA-Pvgb-ilvA | 15.8 |
实施例3：5-L发酵罐培养重组菌生产L-异亮氨酸
采用实例2中带有pZA-Pbtst-ilvA、pZA-Pvgb-ilvA与pZA-P1-64-ilvA的异亮氨酸生产菌株，并以pZAlac-ilvA菌株为对照，进行5-L发酵罐实验。
生产方法：将菌种接入带有适合浓度的抗生素的LB培养基，37℃培养12h，按5％的接种量接入含有氨苄青霉素，卡那霉素和壮观霉素的发酵培养基中(葡萄糖20g/L，硫酸铵8g/L，酵母抽提物5g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，五水硫酸锰0.02g/L，苏氨酸15g/L，甜菜碱1g/L，丝氨酸1g/L，尼古丁酸0.01g/L，VB1 0.005g/L，IPTG 0.1mM)的5-L自动控制发酵罐中，控制发酵液温度采用分段控制模式：0～10h为37℃，10～40h为30℃，通入空气并维持通气量为1vvm，调节搅拌转速控制溶氧(转速最大800rpm)。其他控制条件为自动流加氨水控制pH在6.8～7.2；通过流加适量泡敌消泡；通过流加浓度为500g/L的葡萄糖溶液将残糖控制在1％以内；同时流加浓度为100g/L的苏氨酸母液，维持罐内发酵液苏氨酸浓度小于1％(每0.5小时取样，根据测定的样品氨基酸浓度调节)；发酵至40h停止。放罐时，pZA-Pbtst-ilvA、pZS-Pvgb-ilvA与pZS-P1-64-ilvA的L-异亮氨酸的产量分别为48.7g/L、53.2g/L和56.3g/L，而对照菌株pZAlac-ilvA产量为44.2g/L。
本发明提供的筛选最优启动子表达苏氨酸脱水酶或脱氨酶提高异亮氨酸产量的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明采用的培养基试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列信息
序列编号：1
序列长度：1545bp
序列类型：DNA
序列来源：大肠杆菌
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序列编号：2
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序列来源：大肠杆菌
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序列来源：透明颤菌
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Claims (10)
1.一种用于生产L-异亮氨酸的工程菌株，所述工程菌株通过以下启动子表达解除了L-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱水酶或脱氨酶的基因：
微氧启动子Padhe、微氧启动子Ppfl、生长稳定期启动子PbolA、生长稳定期启动子Pfic、丙酮酸响应启动子Pbtss、丙酮酸响应启动子Pbtst、胁迫响应启动子PrpoS、来源于透明颤菌的血红蛋白启动子Pvgb、组成型启动子P1-93、组成型启动子P1-37、组成型启动子P1-30、组成型启动子P1-46、组成型启动子P1-64。
2.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述解除了L-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱水酶或脱氨酶的基因为解除型ilvA基因或tdcB基因，优选为解除型ilvA基因；
优选地，所述解除型ilvA基因片段编码的ilvA蛋白具有L447F和/或L451A突变；
优选地，所述解除型ilvA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，微氧启动子Padhe、微氧启动子Ppfl、生长稳定期启动子PbolA、生长稳定期启动子Pfic、丙酮酸响应启动子Pbtss、丙酮酸响应启动子Pbtst、胁迫响应启动子PrpoS、来源于透明颤菌的血红蛋白启动子Pvgb、组成型启动子P1-93、组成型启动子P1-37、组成型启动子P1-30、组成型启动子P1-46、组成型启动子P1-64的序列分别如SEQ ID NO:2-14所示。
3.根据权利要求1或2所述的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株中进一步表达乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因，优选地上述基因为实质上解除了L-异亮氨酸和/或L-缬氨酸抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶基因，进一步优选地，所述实质上解除了L-异亮氨酸和/或L-缬氨酸的抑制的乙酰乳酸合成酶/乙酰羟基丁酸合成酶的基因为解除型ilvIH基因、解除型ilvBN基因、解除型ilvGM基因、解除型alsS基因中的一种或多种；
和/或，所述工程菌株进一步表达苏氨酸转运蛋白基因、乙酰羟酸异构酶基因(ilvC)、二羟酸脱水酶或脱氨酶基因(ilvD)、支链氨基酸氨基转移酶基因(ilvE)、支链氨基酸脱氢酶基因中的一种或多种；
和/或，所述工程菌株通过基因工程改造将碳代谢流最大化集中到丙酮酸并导向目标氨基酸，所述工程菌株中乙醇、乙酸、乳酸为代表的杂酸杂醇代谢副产物的生成通路被减弱或阻断，例如下列基因ldhA、adhE、pta、poxB的活性分别或同时被减弱或消除。
4.根据权利要求3所述的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株敲除下列基因：ldhA、pta、poxB、adhE、pflB、mgsA、frdA、dadA、avtA、ilvE。
5.根据权利要求1-4任一项所述的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株具有比野生型菌株低30％以上的从培养基吸收BCAA的能力，和/或所述工程菌株具有比野生型菌株高30％以上的从胞内向胞外外排分泌BCAA的能力；
优选地，所述工程菌株中的支链氨基酸-阳离子同向转运蛋白活性或支链氨基酸-苯丙氨酸ABC转运系统活性被分别或同时被减弱或消除，进一步优选地，敲除或突变brnQ基因或抑制brnQ基因的表达；进一步优选地敲除或突变livJKHMGF基因的一个或多个或抑制livJKHMGF基因一个或多个的表达；优选地，转运蛋白(外排)基因ygaZH、brnEF、yjeH或leuE的表达被增强，进一步优选，增强ygaZH、brnEF、yjeH或leuE表达的方式包括过表达内源性或外源性相应基因、或强启动子替换或敲除抑制元件。
6.权利要求1-5任一项所述的工程菌株在制备L-异亮氨酸中的应用。
7.一种L-异亮氨酸的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
1)在培养基中培养权利要求1-5任一项所述的工程菌株；
2)分离L-异亮氨酸。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述培养基中加入能转化为2-酮丁酸的原料；优选地，所述能转化为2-酮丁酸的原料包括苏氨酸、富马酸、天冬氨酸、高丝氨酸、丙酸、2-氨基丁酸中的一种或几种。
9.一种含有ilvA基因启动子序列的生物材料，所述生物材料包括启动子和解除了L-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱水酶或脱氨酶的基因；
所述启动子选自微氧启动子Padhe、微氧启动子Ppfl、生长稳定期启动子PbolA、生长稳定期启动子Pfic、丙酮酸响应启动子Pbtss、丙酮酸响应启动子Pbtst、胁迫响应启动子PrpoS、来源于透明颤菌的血红蛋白启动子Pvgb、组成型启动子P1-93、组成型启动子P1-37、组成型启动子P1-30、组成型启动子P1-46、组成型启动子P1-64；
所述解除了L-异亮氨酸抑制的苏氨酸脱水酶或脱氨酶的基因优选为解除型ilvA基因或tdcB基因，最优选解除型ilvA基因；
优选地，所述解除型ilvA基因片段编码的ilvA蛋白具有L447F和/或L451A突变；
优选地，所述解除型ilvA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
优选地，微氧启动子Padhe、微氧启动子Ppfl、生长稳定期启动子PbolA、生长稳定期启动子Pfic、丙酮酸响应启动子Pbtss、丙酮酸响应启动子Pbtst、胁迫响应启动子PrpoS、来源于透明颤菌的血红蛋白启动子Pvgb、组成型启动子P1-93、组成型启动子P1-37、组成型启动子P1-30、组成型启动子P1-46、组成型启动子P1-64的序列分别如SEQ ID NO:2-14所示；
优选地，所述生物材料为表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体或病毒载体。
10.权利要求9所述的生物材料在制备L-异亮氨酸合成菌株以及在制备L-异亮氨酸中的应用。
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