CN117736957A - 高产麦角硫因的基因工程菌及其在生产麦角硫因中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高产麦角硫因的基因工程菌及其在生产麦角硫因中的应用，该基因工程菌包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因；所述目的基因包含egt1基因和egt2基因；所述egt1基因来源于嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)；所述egt2基因来源于长枝木霉菌(Trichoderma longibrachiatum)或哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)。本发明以特定来源的egt1基因和egt2基因作为目的基因获得的基因工程菌不仅具有较高的酶活，还能够在较短反应时间内达到较高的转化率，且ee值高。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程菌株构建技术领域，尤其涉及一种高产麦角硫因的基因工程菌及其在生产麦角硫因中的应用。
背景技术
麦角硫因是一种具有独特生物学功能和药理活性的手性组氨酸衍生物，具有广泛的生物医药应用前景。由于其独特的化学性质和生物活性，麦角硫因在食品、化妆品、医药等领域具有广泛的应用前景和市场前景。
麦角硫因的合成方法主要包括化学合成法、提取法、生物发酵法和生物催化法。化学法合成麦角硫因光学纯度低，难度大，原料2-巯基咪唑制备工艺复杂成本较高，且存在原料昂贵和得率低等问题。提取法是以蘑菇等担子菌为原料提取麦角硫因，尽管该方法比较普遍，但是其生产成本高，存在原料来源不足和提取困难等问题，并且可能会有药物残留。发酵法是通过发酵技术，对天然来源富集含麦角硫因的微生物进行发酵，或通过基因工程和代谢工程等生物技术，在大肠杆菌、酵母菌等模式微生物中构建麦角硫因合成通路，通过发酵获得麦角硫因。例如，将来自耻垢分枝杆菌的egtABCDE基因簇或真菌生物合成途径中麦角硫因合成基因egt1和egt2在大肠杆菌中进行异源表达，将基因簇中的基因拆分连接到多个质粒中，再将质粒转化进大肠杆菌中，优化表达重组酶来提高麦角硫因产量。该方法相较于化学法和提取法有了巨大进步，产物产量进一步提升。但是，发酵周期长，一般为72-120小时，发酵过程控制难度大，往往产生杂菌污染等生产事故，导致生产效率低，产物品质不稳定。此外，该方法还需要利用溶剂提取技术从细胞体内提取麦角硫因，得率较低，产量仅为毫克级别。
目前，酶催化是研究最为广泛的麦角硫因生产方法。在真核生物中的麦角硫因合成主要涉及Egt1和Egt2两个关键酶，Egt1催化半胱氨酸和组氨酸甜菜碱合成亚砜中间体(图1)。然后，在强还原环境中，Egt2裂解亚砜中间体生成麦角硫因(图2)。然而，目前麦角硫因的酶催化合成方法仍然存在一些问题。一、工程菌培养时间长，蛋白表达量低。二、酶活不高，生产效率降低。三、酶底物耐受性差，转化率低。需钠弧菌Vibrio natriegens传代时间小于10min，是已知代时最短的非寄生细菌，需钠弧菌Vibrio natriegens的生长速率高，作为宿主表达外源蛋白发酵周期短，而且通过提高培养基盐浓度可以在不使用抗生素条件下抑制杂菌生长，有潜力成为新一代蛋白表达系统。
因此，进一步挖掘催化活性高的麦角硫因合成酶，利用基因工程技术构建培养时间短、蛋白表达量高的生物工程菌催化合成麦角硫因具有重要的意义。
发明内容
本发明针对现有麦角硫因合成工艺存在的缺陷，提供了高产麦角硫因的基因工程菌以及利用该基因工程菌一锅法制备麦角硫因的方法；该基因工程菌不仅具有较高的酶活，还能够在较短反应时间内达到较高的转化率，且ee值高。
具体技术方案如下：
本发明提供了高产麦角硫因的基因工程菌，该基因工程菌包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因；所述目的基因包含egt1基因和egt2基因；
所述egt1基因来源于嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)；所述egt2基因来源于长枝木霉菌(Trichoderma longibrachiatum)或哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)。
本发明对分别来自于Trichoderma harzianum(Thegt1)、Chaetomiumthermophilum(Ctegt1)、Neurospora tetrasperma(Ntegt1)、Fusarium longipes(Flegt1)、Xylaria grammica(Xgegt1)等物种的egt1基因(数据库UniProt的登录号分别依次为A0A0F9XQS5、G0S440、G4UKZ4、A0A395SUF0、A0A439D8X8和分别来自于Trichodermalongibrachiatum(Tlegt2)、Trichoderma harzianum(Thegt2)等物种的egt2基因(数据库UniProt的登录号分别为A0A2T4BWP1、A0A0G0A2B8)进行了筛选和配组。
发现：来源于嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)的egt1基因与来源于长枝木霉菌(Trichoderma longibrachiatum)和哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)的egt2基因进行表达能够获得高酶活、高转化率和高ee值的高产麦角硫因的基因工程菌。
进一步地，所述高产麦角硫因的基因工程菌为基因工程菌I，或者由基因工程菌II-1和基因工程菌II-2混合而成；
所述基因工程菌I由egt1基因和egt2基因共同插入至同一游离型质粒I上并转入同一宿主细胞内获得；
所述基因工程菌II-1由egt1基因单独插入至游离型质粒II上再分别转入同类的宿主细胞内获得；所述基因工程菌II-2由egt2基因单独插入至游离型质粒II上再分别转入同类的宿主细胞内获得。
本发明提供了包含所述麦角硫因合成酶基因egt1的表达载体。所述的表达载体为将egt1插入pET28-a(+)表达质粒BamH I和Hind III酶切位点之间，包括pET28a-Thegt1、pET28a-Ctegt1、pET28a-Ntegt1、pET28a-Flegt1、pET28a-Xgegt1。
本发明提供了包含所述麦角硫因合成酶基因egt2的表达载体。所述的表达载体为将egt2插入pET28-a(+)表达质粒BamH I和Hind III酶切位点之间，包括pET28a-Tlegt2、pET28a-Thegt2。
本发明提供了包含所述麦角硫因合成酶基因egt1和egt2的共表达载体。使用pETDuet-1共表达质粒，将麦角硫因合成基因egt1插入多克隆位点BamH I和Hind III之间，将麦角硫因合成基因egt2插入多克隆位点Nde I和Xho I之间，包括pETDuet-Thegt1-Tlegt2、pET Duet-Ctegt1-Tlegt2、pETDuet-Ntegt1-Tlegt2、pETDuet-Flegt1-Tlegt2、pETDuet-Xgegt1-Tlegt2。
本发明提供了包含所述egt1基因的Escherichia coli BL21(DE3)工程菌：BL21-pET28a-Thegt1、BL21-28a-Ctegt1、BL21-28a-Ntegt1、BL21-28a-Flegt1、BL21-28a-Xgegt1。
本发明提供了包含所述egt2基因的Escherichia coli BL21(DE3)工程菌：BL21-28a-Tlegt2、BL21-28a-Thegt2。
本发明提供了包含所述egt1基因的Vibrio natriegens VnDX工程菌：VNDX-pET28a-Th egt1、VNDX-28a-Ctegt1、VNDX-28a-Ntegt1、VNDX-28a-Flegt1、VNDX-28a-Xgegt1。
本发明提供了包含所述egt2基因的Vibrio natriegens VnDX工程菌：VNDX-28a-Tlegt2、VNDX-28a-Thegt2。
本发明提供了包含所述egt1和Tlegt2基因的Escherichia coli BL21(DE3)共表达工程菌BL21-Duet-Thegt1-Tlegt2、BL21-Duet-Ctegt1-Tlegt2、BL21-Duet-Ntegt1-Tlegt2、BL21-Duet-Flegt1-Tlegt2、BL21-Duet-Xgegt1-Tlegt2。
本发明提供了包含所述egt1和Thegt2基因的Escherichia coli BL21(DE3)共表达工程菌：BL21-Duet-Thegt1-Thegt2、BL21-Duet-Ctegt1-Thegt2、BL21-Duet-Ntegt1-Thegt2、BL21-Duet-Flegt1-Thegt2、BL21-Duet-Xgegt1-Thegt2。
本发明提供了包含所述egt1和Tlegt2基因的Vibrio natriegens VnDX共表达工程菌VNDX-Duet-Thegt1-Tlegt2、VNDX-Duet-Ctegt1-Tlegt2、VNDX-Duet-Ntegt1-Tlegt2、VNDX-Duet-Flegt1-Tlegt2、VNDX-Duet-Xgegt1-Tlegt2。
本发明提供了包含所述egt1和Thegt2基因的Vibrio natriegens VnDX共表达工程菌：VNDX-Duet-Thegt1-Thegt2、VNDX-Duet-Ctegt1-Thegt2、VNDX-Duet-Ntegt1-Thegt2、VNDX-Duet-Flegt1-Thegt2、VNDX-Duet-Xgegt1-Thegt2。
更进一步地，所述基因工程菌II-1和基因工程菌II-2的混合比例为0.3:1～1:5；所述宿主细胞为大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)或者需钠弧菌Vibrio natriegensVnDX。
更进一步地，所游离型质粒I为pETDuet-1质粒，egt1基因插入质粒多克隆位点的BamH I和Hind III之间；egt2基因插入质粒多克隆位点的Nde I和Xho I之间；
所述游离型质粒II为pET28-a(+)质粒，egt1基因和egt2基因均单独插入至质粒多克隆位点的BamH I和Hind III之间。
更进一步地，所述egt1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述egt2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
更进一步地，所述需钠弧菌为基因组的dns位点整合有T7 RNA聚合酶表达盒的需钠弧菌Vibrio natriegens ATCC14048。
本发明还提供了如上所述的基因工程菌在生产麦角硫因中的应用。
本发明还提供了一种麦角硫因的生产方法，包括：以组氨酸甜菜碱和L-半胱氨酸为底物，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐或1,4-二硫苏糖醇为还原剂，磷酸吡哆醛和亚铁离子为辅酶，如上所述基因工程菌的全细胞、湿菌体或粗酶液为催化剂，催化反应得到麦角硫因。
进一步地，所述催化反应以水为溶剂，反应温度为25℃～40℃，pH值为6～9；
所述组氨酸甜菜碱的浓度为50mM～500mM，L-半胱氨酸的浓度为75mM～750mM，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐或1,4-二硫苏糖醇的浓度为25mM～75mM，磷酸吡哆醛的浓度为50μM～200μM，亚铁离子的浓度为50μM～200μM。
所述基因工程菌II-1的粗酶液和基因工程菌II-2的粗酶液的体积比为0.3:1～1:5。
更进一步地，所述催化反应以水为溶剂，反应温度为30℃，pH值为8；
所述组氨酸甜菜碱的浓度为200mM，L-半胱氨酸的浓度为300mM，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐或1,4-二硫苏糖醇的浓度为50mM，磷酸吡哆醛的浓度为100μM，亚铁离子的浓度为100μM。
进一步地，基因工程菌II-1粗酶液和基因工程菌II-2粗酶液的体积比为1～5：0.3～1。
进一步地，所述基因工程菌II-1粗酶液的体积为300～400mL；所述基因工程菌II-2粗酶液的体积为100～200mL。粗酶液的浓度为8～12g湿菌体/L。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明以特定来源的egt1基因和egt2基因作为目的基因，获得的基因工程菌不仅具有较高的酶活，还能够在较短反应时间内达到较高的转化率，且ee值高。
(2)本发明基因工程菌生长速率快、蛋白表达量高。
(3)本发明基因工程菌粗酶液的酶活力高、反应时间短、反应条件温和。
(4)本发明一锅法制备麦角硫因的方法，获得的产物光学纯度高、无需拆分；底物浓度高、转化率高；生产过程环保、污染较小、符合绿色化学理念；产品分离纯化简单、成本低。
附图说明
图1为Egt1酶催化组氨酸甜菜碱和L-半胱氨酸生成中间体亚砜的反应方程式。
图2为Egt2酶催化中间体亚砜生成麦角硫因的反应方程式。
图3为一锅法制备麦角硫因的反应方程式。
图4为一锅法制备麦角硫因后分析反应液中底物、产物的高效液相检测图谱。
图5为一锅法制备麦角硫因后分析反应液中底物、产物的质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
催化工艺所用试剂：组氨酸甜菜碱、L-半胱氨酸、麦角硫因、磷酸吡哆醛、TCEP、DTT、硫酸亚铁、磷酸盐等均为市售分析纯。
组氨酸甜菜碱结构式，如式(1)所示；L-半胱氨酸结构式，如式(2)所示；麦角硫因，如式(3)所示。
本发明一锅法制备麦角硫因的反应方程式，如图3所示。
本发明通过高效液相色谱(HPLC)分析反应液中底物、产物的浓度，监测反应的进行。
HPLC分析方法如下：色谱柱型号：QS-C18、5μm、4.6×250mm。乙酸钠(50mM)：乙腈＝99:1，pH＝8.0；检测波长：210nm，流速：1.0mL/min，柱温：40℃。出峰情况见图4，中间体亚砜3.6min，麦角硫因4.1min，组氨酸甜菜碱5.2min。
本发明采用LC-MS(Agilent1260/6460LC/Triple Quadrupole MS,AgilentTechnologies)和Agilent ZORBAX NH色谱柱(4.6×250mm5μm)对反应液中底物、产物进行鉴定。流动相为乙腈：4mmol/L乙酸铵(70:30,v/v)。
MS分析方法的参数如下：离子源为ESI；扫描方式为正模式扫描；离子扫描范围50-220；扫描时间500；裂解电压(frag)为135V；加速电压(cell acc)为5V；步长(step size)：0.1；毛细管电压；干燥气温度(Gas Temp)为325℃；干燥气流量(Gas Flow)：10L/min；喷雾气压力(Nebulizer)：20psi；鞘气温度(Sheath Gas Temp)：400℃；鞘气流速(Sheath GasFlow)：11L/min；毛细管电压(Capillary)：4000V。结果如图5所示。
实施例1野生酶工程菌构建
在UniProt数据库中检索麦角硫因合成酶并挑选来源于：
嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum(Ctegt1，数据库UniProt的登录号G0S440，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)；哈茨木霉Trichodermaharzianum(Thegt1，数据库UniProt的登录号A0A0F9XQS5)；四孢脉孢菌Neurosporatetrasperma(Ntegt1，数据库UniProt的登录号G4UKZ4)；长脚镰孢菌Fusarium longipes(Flegt1，数据库UniProt的登录号A0A395SUF0)；条纹炭角菌Xylaria grammica(Xgegt1，数据库UniProt的登录号A0A439D8X8)的Egt1氨基酸序列。以及来源于长枝木霉菌Trichoderma longibrachiatum(Tlegt2，数据库UniProt的登录号A0A2T4BWP1，碱基序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)、哈茨木霉菌Trichoderma harzianum(Thegt2，数据库UniProt的登录号碱基A0A0G0A2B8，序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)的Egt2氨基酸序列。
通过密码子优化将九条氨基酸序列转化为核苷酸序列。将九条核苷酸序列通过化学法全合成(擎科生物)，并且整合在表达载体pET-28a(+)或pETDuet-1多克隆位点；最后将构建的质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)或Vibrio natriegens VnDX宿主细胞中构建高产麦角硫因工程菌。
嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum
碱基序列(如SEQ ID NO.1所示)
ATGCCAGGATTAGAAAATCCCGTACTAGCTTCGCAAACTGGTCAAGGCCGCTTGTTAGCGATTAAAGAGAAAAAGCGCCTACCGGACGTTCGCGTCAAGATCGGTGAAAAAGCCTCCTTTGATATTATTGATATCCGCCAGGGTTCAGTGGAAATGAATTTGAAAGTTGAGATCCTGTCCATGTTTCTGACGAAAAACGGTCCGCGTAAGCTGCCAACCCTGTTGCTGTACGACGAACGTGGTCTGCAACTGTTTGAGAAGATTACGTATCTGGAGGAGTATTATCTGACTAACGACGAAATTGAAGTTCTGCAGAAGTACTCCGCGGATATTGCCAAACTGATCCCGGAAGGTGCTATGCTGATTGAACTGGGTTCTGGCAATCTGCGTAAAGTCAACCTGCTCTTGCGCGCCTTCGAGGATGCCGGCAAAAGCATTGATTATTACGCGCTGGACCTGTCCAAACAAGAGCTGGAGAGGACCCTTGCCCAATTGCCGCATTATCAGTATGTACGTGCGCACGGCCTTCTGGGTACCTACGACGACGGTCGTGCGTGGCTGAAGCACCCAAGCCGTGCGAGCCGCCAGAAATGCATCTTGTCCTTAGGCAGCAGCGTGGGTAATTTCGACCGTGCGGATGCGGCGGCATTCCTGAAGACCTTTGCGGACATCTTGGGCCCGGGTGACACCATGCTAATCGGGTTGGATGCCTGCAACGACCCAGCTCGCGTGTACCATGCGTACAACGATAAAGAGGGTGTGACGCACGAACTTGCTAGCCAGGCGGGCTCCGGTGACAGCGCTGATGAGTCTATTCATCGTTTTATCCTGAATGGCTTGCGTCACGCAAACAAAATCTTGGGTGAAACGGTGTTCGTTGAGGCTGAATGGCGTGTTATTGGTGAATACGTGTATGATGGTCAAGGAGGCCGTCACCAGGCTTTCTACGCACCACTGCATGATACCACGGTTCTGGGTCAGTTGATCCGTCCGCATGATCGCATCCAGGTTGAACAGAGCCTGAAGTACAGCCCGGCAGAAGCGGAATTGCTCTGGAAACGCGCGGGTATGGAAGAGATCGGCCATTGGCGTTGTCGTGACGAATACGGCGTACACATGTTGTCCAAGCCGAAAATGGCATTCGGTCTAATCCCGAGCGTTTACGCAAGATCCGCGCTGCCGTCTTTAGAGGAATGGGAATCGTTGTGGGCAGCGTGGGACACTCTGACCCAGGAGATGCTGCCGCCGGAAGAACTGCTGAGCAAGCCGATCAAACTGCGGAACGCCTGCATTTTTTACTTAGGTCACATTCCGAATTTCCTGGACGTTCAGCTGAGCAAGGTTACTACCGATCCGCTCACCGACCCGGCATGGTATCGTCGCATCTTTGAGCGTGGTATTGACCCGGACGTCGATAACCCGGAAATCTGTCATGATCACAGCGAAATCCCAGATGAGTGGCCTCCGGCGGACGAGATACTGGAGTACCAGACCCGTGTGCGTGCTAGATTGCGTAAGTATTACGAAAACGGCGTGGAAAACATTCCGCGTCACATCGGCCGTGCGATTTGGGTGGGCTTCGAACATGAAATTATGCACCTGGAAACTCTCTTATATATGATGCTGCAATCTGATAAGACCCGTCCGCCACCGAACGTGCCGGTGCCGGATTGGGAGAAGCTTGCGGCTAAAGCTCGCTCGGAACGAGTGCCGAATGAATGGTTTGACATTCCCGAGCAGGAGATCACCATCGGCCTGGATGATCCGGAGGACGAGACAGACCCGAATGTTCACTACGGCTGGGACAACGAGAAGCCGGTGCGCCGTGCGAAAGTTCACGCCTTCCAAGCAAAGGGTCGCCCGATTACCAACGAGGAATACGCGACCTACTTGTATAACACCCACGGTTCGCAAATCCCAGCTAGCTGGGCATATACCAAAGAAAAAGATCCGCAGAATGGTGTGAGCGGTACGAACGGCCACAGCACGATTGCGAATGGCACCGCTCCGTTGCCGGAGAGCTTTCTTGAGGATAAAGCCGTTAAAACCGTATTTGGATTGGTTCCGTTGAAGTACGCGCTGGACTGGCCGGTCTTCGCGAGCTATAACGAACTGGCTGCATGCGCAGCGTGGATGGGTGGTCGCATTCCGACCTTCGAGGAAGTGCGTTCTATTTATGCACATGTTGAGGCGCGGAAGAAGCAGAAGGAAGCGCAAAAGCACCTGGCTCAAACCGTACCGGCGGTGAATGCGCACCTGTGTAACAACGGGGTCGAGATAAGCCCGCCTGCGACCCCGCCCGCGGGTACAGCCGCGGCAACCGCGGAGGGCGACGAGTCGGAGAACAGCCTGTTCATCGACCTGGATGGAGCGAACGTCGGTTTCCAGCATTGGCATCCGGTTCCGGTGACCAATCGTGGCGGCGAGCTGGCTGGCCAGGCGGAGTGCGGTGGCGTGTGGGAGTGGACCAGCTCTGTTTTGCGTCCTTGGGATGGCTTCAAACCGATGACCCTGTACCCGGGTTATACCGCCGACTTTTTTGACGAAAAGCACAACATCGTGCTGGGCGGCTCCTGGGCGACCCATCCGCGTATCGCCGGTAGAAAGTCGTTCGTGAATTGGTACCAACGTAACTATCCGTACGCGTGGGTTGGTGCTCGTCTGGTTCGGGATCTGCCG
氨基酸序列（如SEQ ID NO.4所示）
MPGLENPVLASQTGQGRLLAIKEKKRLPDVRVKIGEKASFDIIDIRQGSVEMNLKVEILSMFLTKNGPRKLPTLLLYDERGLQLFEKITYLEEYYLTNDEIEVLQKYSADIAKLIPEGAMLIELGSGNLRKVNLLLRAFEDAGKSIDYYALDLSKQELERTLAQLPHYQYVRAHGLLGTYDDGRAWLKHPSRASRQKCILSLGSSVGNFDRADAAAFLKTFADILGPGDTMLIGLDACNDPARVYHAYNDKEGVTHELASQAGSGDSADESIHRFILNGLRHANKILGETVFVEAEWRVIGEYVYDGQGGRHQAFYAPLHDTTVLGQLIRPHDRIQVEQSLKYSPAEAELLWKRAGMEEIGHWRCRDEYGVHMLSKPKMAFGLIPSVYARSALPSLEEWESLWAAWDTLTQEMLPPEELLSKPIKLRNACIFYLGHIPNFLDVQLSKVTTDPLTDPAWYRRIFERGIDPDVDNPEICHDHSEIPDEWPPADEILEYQTRVRARLRKYYENGVENIPRHIGRAIWVGFEHEIMHLETLLYMMLQSDKTRPPPNVPVPDWEKLAAKARSERVPNEWFDIPEQEITIGLDDPEDETDPNVHYGWDNEKPVRRAKVHAFQAKGRPITNEEYATYLYNTHGSQIPASWAYTKEKDPQNGVSGTNGHSTIANGTAPLPESFLEDKAVKTVFGLVPLKYALDWPVFASYNELAACAAWMGGRIPTFEEVRSIYAHVEARKKQKEAQKHLAQTVPAVNAHLCNNGVEISPPATPPAGTAAATAEGDESENSLFIDLDGANVGFQHWHPVPVTNRGGELAGQAECGGVWEWTSSVLRPWDGFKPMTLYPGYTADFFDEKHNIVLGGSWATHPRIAGRKSFVNWYQRNYPYAWVGARLVRDLP
长枝木霉菌 Trichoderma longibrachiatum
碱基序列（如SEQ ID NO.2所示）
ATGGCTAGTCTACCCGTAAGGCAAAGAGAAGAGGGCGAGGCGAAAGTTGGCGAGGACGGTTTTAAAGTGTTCGGTGGCGAGATGACCAAAGATTTTCTGTTTGCGCCAAATTGGACCAATCTGAACCACGGTAGCTATGGCAGCATTCCGCGTGCGATTCAGGCAAAGCTGCGCTCTTACCAGGATGACATCGAAGCCCGTCCGGACCCGTTCGTGCGCTTCGAACACGCCCGTCTGACCGATGAAAGCCGTGCGGCGGTTGCTGGTGTGCTCAATGCGCCAGTTGAGACTGTCGTGTTCGTGAATAACGCGACCGAAGGTGTTAATACGGTTTTCCGCAACATCAAATGGGATGCTGATGGCAAGGACGTGGCGCTGTACTTCACCACCGTTTACGAGGCATGTGGTAAGGCGATCGATTTCCTGTACGATTACCACGGTGAGGGCCGTCTGTCGTCCCGCGAGATCGAGATTGCCTATCCGATTGAGGATGACGAAATTCTGCGTCGCTTCCGTGCGGCGGTGGAGCAGGTACGTTCCGAAGGTAAGCGGGCTAAAATCTGCATTTTTGATGTGGTGAGCAGCCGCCCGGGTGTTGTGTTCCCGTGGGAACGTATGGTCGCGGCTTGCCGTGAATTGGGCGTTCTGAGCTTGGTTGATGGCGCTCAAGGCATTGGTATGGTCCGTCTCGACCTGGGTGCGGCGGACCCGGATTTCTTTGTGAGCAACTGCCACAAATGGTTGTTCGCGCCGCGTGGCTGCGCGGTTTTTTATGTTCCGGTGCGTAACCAGGGTCTGTTACCGAGCACGTTGGCGACCAGCCACGGTTATGCGTCCCTGACCGGCAAGCGCCGTGTGGTCCTGCCTCCGCATGTTGGGGACGGCGGTGCCGGTAAATCCGCATTTGTCTCGAACTTTGAGTTCACCGGTACGCGTGACTACGCCCCGAACTATTGCGTGAAAGATGCAGTTGCGTACCGCCGCGACGTACTTGGCGGTGAGGAACGCATCCTGGGCTATCTGTGGGAGCTGAATAAGAAAGGTTCACGGCTCGTCGCTGAACGTTTGGGTACTGAGGTTCTGGAAAACAAGAAGGGCACCCTGACGAACTGCGCTATGTCTAACATCGCAATGCCGCTTTGGAAAGGTGAAAAAGAGGGTAAAGAAGGCGACGATGTCGTAGTGCCGGAAGAGGACGGAGACCGTGTGGTTGCATGGATGATGAGCACGATGGCGCGTGACTACGACACCATTGTTCCGATGTTTTGGTTGGGCAGACGCTTCTGGGTTCGAATCGCGGCCCAAGTGTACCTGGACTTAGGTGACTATGAGTACGGCGCTGAAGTGTTGAAAAAGCTGGTTGAACGTGTTGGTAAGGGCGAGTATAAGAGCGGTCAGCAAAACTAA
氨基酸序列（如SEQ ID NO.5所示）
MASLPVRQREEGEAKVGEDGFKVFGGEMTKDFLFAPNWTNLNHGSYGSIPRAIQAKLRSYQDDIEARPDPFVRFEHARLTDESRAAVAGVLNAPVETVVFVNNATEGVNTVFRNIKWDADGKDVALYFTTVYEACGKAIDFLYDYHGEGRLSSREIEIAYPIEDDEILRRFRAAVEQVRSEGKRAKICIFDVVSSRPGVVFPWERMVAACRELGVLSLVDGAQGIGMVRLDLGAADPDFFVSNCHKWLFAPRGCAVFYVPVRNQGLLPSTLATSHGYASLTGKRRVVLPPHVGDGGAGKSAFVSNFEFTGTRDYAPNYCVKDAVAYRRDVLGGEERILGYLWELNKKGSRLVAERLGTEVLENKKGTLTNCAMSNIAMPLWKGEKEGKEGDDVVVPEEDGDRVVAWMMSTMARDYDTIVPMFWLGRRFWVRIAAQVYLDLGDYEYGAEVLKKLVERVGKGEYKSGQQN
哈茨木霉菌Trichoderma harzianum
碱基序列（如SEQ ID NO.3所示）
GTATCACTAACAATAAGGGAAAGAGATGGAGAGGAAGCTAAGGTTGGTGAGGACGGTTTTAAAGTGTTCGGCCGTGAGATGCGTAAGGACTTCCTGTTTGCACCGGACTGGACCAACCTGAACCACGGCTCTTACGGCTCAATTCCGCGTGCAATTCAAGATAAGCTGCGTGGTTACCAGGACGACATCGAGGCGAGACCAGACCCGTTTATCCGTTTCGCCCTGGCCCGTCTTACGGATGAAAGCCGGGAGGCCGTTGCGGGTGTTGTGAACGCTCCGGTGGAAACCGTTGTTTTCGTCAACAACGCTACCGAAGGCGTTAACACCGTTTTTCGTAACTTGAAGTGGAATCCGGATGGGAAGGACGTTGCCTTGTGCTTCAGCACGGTCTATGATGCGTGCGGTAAAGTTATCGATTTCCTGTACGACTACCACGGTGAGGGCCGTTTCACCTCGCGCGAGATCCCGATCACCTATCCGATCGAGGACGACGAAATTCTGCAACGTTTCCGCGATACCGTCAAGTCCGTGCAGGATGAGGGTAAGCGCGCGAAAGTCTGTATTTTTGATGTCGTTAGCAGCCGTCCGGGTGTGGTGTTCCCGTGGGAACGCATGGTTAAAGCGTGTCGTGAGCTGGGCGTGCTTAGTCTGGTCGATGGTGCGCAAGGTATTGGCATGGTGCGCCTGAACTTGTCCGAAGCGGACCCGGATTTCTTTGTGTCTAATTGCCATAAATGGTTATTTACCCCGCGTGGCTGCGCGGTGTTCTACGTTCCGGTTCGCAACCAGCATCTGCTGCCGACCACCTTAGCGACTTCTCACGGTTACAGCAGCCAGAGCGGTGAGCACAGCATCCGTCCGGAACCGCCATATAAACCGAAAGATAAATCCTTTTTCGTAAATAATTTTGAGTTCACGGGTACGCGTGACTACGCTCCCAACTTGTGTGTTAAGGACGCGGTTAAGTATCGCAAAGAAGTGCTCGGTGGTGAGGAACGTATCCTGAGCTATCTGTGGGATCTGAACAAAAAGGGTTCGAAATTGGTAGCTGAGAAATTGGGTACTGAGGTTCTGGAAAATAACAAAGGCACATTGACCAATTGCAGCATGGCAAATATTTCCATCCCGCTGTGGCGTGGCGACAAAGGTGAGGCGAAGAAGGGCGACGTTGTGGTGCCGGTCGAAGACGGTGACCGCATCGTGGTGTGGATGATGAGCACGATGGCGAGCGATTACAAGACCATTGTTCCTATGTTTTGGCTGGGAAACCGTTTCTTCGTTCGCATGAGCGCACAGATTTATCTGGATCTGGACGACTACGAATTTGGTGCGGAAACCCTGAAAAAGCTCGTGGATCGTGTGGGCAAGGGCGAGTATAAGGCATAA
氨基酸序列(如SEQ ID NO.6所示)
MVSLTIRERDGEEAKVGEDGFKVFGREMRKDFLFAPDWTNLNHGSYGSIPRAIQDKLRGYQDDIEARPDPFIRFALARLTDESREAVAGVVNAPVETVVFVNNATEGVNTVFRNLKWNPDGKDVALCFSTVYDACGKVIDFLYDYHGEGRFTSREIPITYPIEDDEILQRFRDTVKSVQDEGKRAKVCIFDVVSSRPGVVFPWERMVKACRELGVLSLVDGAQGIGMVRLNLSEADPDFFVSNCHKWLFTPRGCAVFYVPVRNQHLLPTTLATSHGYSSQSGEHSIRPEPPYKPKDKSFFVNNFEFTGTRDYAPNLCVKDAVKYRKEVLGGEERILSYLWDLNKKGSKLVAEKLGTEVLENNKGTLTNCSMANISIPLWRGDKGEAKKGDVVVPVEDGDRIVVWMMSTMASDYKTIVPMFWLGNRFFVRMSAQIYLDLDDYEFGAETLKKLVDRVGKGEYKA
实施例2菌体的培养和粗酶液的制备
一、菌体的培养
液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，115℃灭菌30min，待用。
含有egt1和egt2基因的工程菌经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃震荡培养8h。按2％的接种量转接至50mL同样含50μg/mlKan的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.6左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5 mM，28℃下诱导培养18h。培养结束后，将培养液10000rpm离心5 min，弃上清，收集菌体，使用50 mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液洗涤菌体两次。-80℃超低温冰箱中保存，待用。
二、粗酶液的制备
将培养结束后收集到的菌体10倍悬于50 mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液中，400W功率超声破碎30次，每次超声持续3s，间歇7s。将此破碎液12000rpm 4℃离心10 min去除沉淀，得到的上清为含重组麦角硫因合成酶的粗酶液(10g湿菌体/L)。
实施例3利用以pET28-a(+)为载体，Escherichia coli BL21(DE3)为宿主细胞的单基因表达工程菌一锅法制备麦角硫因
按实施例2的方法分别培养表达Egt1的工程菌(BL21-pET28a-Thegt1、BL21-28a-Ctegt1、L21-28a-Ntegt1、BL21-28a-Flegt1、BL21-28a-Xgegt1)以及表达Egt2的工程菌(BL21-28a-Tlegt2、BL21-28a-Thegt2)并获得粗酶液，两种粗酶液相互组合，共进行10个反应。
1L反应液中，组氨酸甜菜碱浓度200mM，L-半胱氨酸浓度为300mM，TCEP或DTT浓度为50mM，磷酸吡哆醛浓度为100μM，亚铁离子浓度为100μM。Egt1粗酶液350mL,Egt2粗酶液150mL。通过水浴控制反应温度为30℃，pH 8.0，搅拌转速150-300rpm，每10分钟检测转化率和ee值，直至反应结束。反应结束数据见表1，序号1-10。
实施例4利用以pET28-a(+)为载体，Vibrio natriegens VnDX为宿主细胞的单基因表达工程菌一锅法制备麦角硫因
按实施例2的方法分别培养表达Egt1的工程菌(VNDX-pET28a-Thegt1、VNDX-28a-Ctegt1、VNDX-28a-Ntegt1、VNDX-28a-Flegt1、VNDX-28a-Xgegt1以及表达Egt2的工程菌(VNDX-28a-Tlegt2、VNDX-28a-Thegt2)并获得粗酶液，两种粗酶液相互组合，共进行10个反应。
1L反应液中，组氨酸甜菜碱浓度200mM，L-半胱氨酸浓度为300mM，TCEP或DTT浓度为50mM，磷酸吡哆醛浓度为100μM，亚铁离子浓度为100μM。Egt1粗酶液350mL，Egt2粗酶液150mL。通过水浴控制反应温度为30℃，pH 8.0，搅拌转速150-300rpm，每10分钟检测转化率和ee值，直至反应结束。反应结束数据见表1，序号11-20。
实施例5利用以pETDuet-1为载体，Escherichia coli BL21(DE3)为宿主细胞的多基因共表达工程菌一锅法制备麦角硫因
按实施例2的方法分别培养共表达Egt1与TlEgt2的Escherichia coli BL21(DE3)工程菌(BL21-Duet-Thegt1-Tlegt2、BL21-Duet-Ctegt1-Tlegt2、BL21-Duet-Ntegt1-Tlegt2、BL21-Duet-Flegt1-Tlegt2、BL21-Duet-Xgegt1-Tlegt2)以及共表达Egt1与ThEgt2的工程菌(BL21-Duet-Thegt1-Thegt2、BL21-Duet-Ctegt1-Thegt2、BL21-Duet-Ntegt1-Thegt2、BL21-Duet-Flegt1-Thegt2、BL21-Duet-Xgegt1-Thegt2)并获得粗酶液，共进行10个反应。
1L反应液中，组氨酸甜菜碱浓度200mM，L-半胱氨酸浓度为300mM，TCEP为50mM，磷酸吡哆醛浓度为100μM，亚铁离子浓度为100μM。粗酶液500mL。通过水浴控制反应温度为30℃，pH 8.0，搅拌转速150rpm，每10分钟检测转化率和ee值，直至反应结束。反应结束数据见表1，序号21-30。
实施例6利用以pETDuet-1为载体，Vibrio natriegens VnDX为宿主细胞的多基因共表达工程菌一锅法制备麦角硫因
按实施例2的方法分别培养共表达Egt1与TlEgt2的Vibrio natriegens VnDX工程菌(VNDX-Duet-Thegt1-Tlegt2、VNDX-Duet-Ctegt1-Tlegt2、VNDX-Duet-Ntegt1-Tlegt2、VNDX-Duet-Flegt1-Tlegt2、VNDX-Duet-Xgegt1-Tlegt2)以及共表达Egt1与ThEgt2的工程菌(VNDX-Duet-Thegt1-Thegt2、VNDX-Duet-Ctegt1-Thegt2、VNDX-Duet-Ntegt1-Thegt2、VNDX-Duet-Flegt1-Thegt2、VNDX-Duet-Xgegt1-Thegt2)并获得粗酶液，共进行10个反应。
1L反应液中，组氨酸甜菜碱浓度200mM，L-半胱氨酸浓度为300mM，DTT浓度为50mM，磷酸吡哆醛浓度为100μM，亚铁离子浓度为100μM。粗酶液500mL。通过水浴控制反应温度为30℃，pH 8.0，搅拌转速150rpm，每10分钟检测转化率和ee值，直至反应结束。反应结束数据见表1，序号31-40。
表1一锅法制备麦角硫因的转化率及ee％值
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Claims (9)
1.高产麦角硫因的基因工程菌，其特征在于，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因；所述目的基因包含egt1基因和egt2基因；所述egt1基因来源于嗜热毛壳菌(Chaetomiumthermophilum)；所述egt2基因来源于长枝木霉菌(Trichoderma longibrachiatum)或哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)。
2.如权利要求1所述的高产麦角硫因的基因工程菌，其特征在于，所述高产麦角硫因的基因工程菌为基因工程菌I，或者由基因工程菌II-1和基因工程菌II-2混合而成；
所述基因工程菌I由egt1基因和egt2基因共同插入至同一游离型质粒I上并转入同一宿主细胞内获得；
所述基因工程菌II-1由egt1基因单独插入至游离型质粒II上再转入宿主细胞内获得；所述基因工程菌II-2由egt2基因单独插入至游离型质粒II上再转入宿主细胞内获得；基因工程菌II-1和基因工程菌II-2的宿主细胞为同种细胞。
3.如权利要求2所述的高产麦角硫因的基因工程菌，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli BL21(DE3))或者需钠弧菌(Vibrio natriegens VnDX)。
4.如权利要求3所述的高产麦角硫因的基因工程菌，其特征在于，游离型质粒I为pETDuet-1质粒，egt1基因插入该质粒多克隆位点的BamHI和Hind III之间；egt2基因插入该质粒多克隆位点的Nde I和Xho I之间；
所述游离型质粒II为pET28-a(+)质粒，egt1基因和egt2基因均单独插入至该质粒多克隆位点的BamHI和Hind III之间。
5.如权利要求3所述的高产麦角硫因的基因工程菌，其特征在于，所述egt1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述egt2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
6.如权利要求3所述的高产麦角硫因的基因工程菌，其特征在于，所述需钠弧菌为基因组的dns位点整合有T7 RNA聚合酶表达盒的需钠弧菌Vibrio natriegens ATCC14048。
7.如权利要求1～6任一项所述的基因工程菌在生产麦角硫因中的应用。
8.一种麦角硫因的生产方法，其特征在于，包括：以组氨酸甜菜碱和L-半胱氨酸为底物，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐或1,4-二硫苏糖醇为还原剂，磷酸吡哆醛和亚铁离子为辅酶，权利要求1～6任一项所述基因工程菌的全细胞、湿菌体或粗酶液为催化剂，催化反应得到麦角硫因。
9.如权利要求8所述的麦角硫因的生产方法，其特征在于，所述催化反应以水为溶剂，反应温度为25℃～40℃，pH值为6～9；所述组氨酸甜菜碱的浓度为50mM～500mM，L-半胱氨酸的浓度为75mM～750mM，三(2-羰基乙基)磷盐酸盐或1,4-二硫苏糖醇的浓度为25mM～75mM，磷酸吡哆醛的浓度为50μM～200μM，亚铁离子的浓度为50μM～200μM。
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