CN117736872A - 冻干保护剂和菌粉制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及菌粉制剂领域，公开了冻干保护剂和菌粉制剂及其制备方法和应用。所述冻干保护剂包括奶粉、糖、谷氨酸盐、维生素、山梨醇和甘油，所述奶粉、糖、谷氨酸盐、维生素、山梨醇和甘油的重量比为1:(0.1‑4):(0.01‑1):(0.01‑1):(0.1‑3):(0.01‑3)。本发明提供的冻干保护剂，可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期。
Description
技术领域
本发明涉及菌粉制剂领域，具体涉及冻干保护剂和菌粉制剂及其制备方法和应用。
背景技术
乳酸菌是一类能利用碳水化合物发酵产乳酸的细菌的总称，在自然界中分布广泛，主要包括乳杆菌属、片球菌属和双歧杆菌属等，是公认安全的食品制造和饲料添加剂微生物之一。
植物乳杆菌是乳酸菌的一种，属于同型发酵乳酸菌。由于此菌是厌氧细菌(兼性好氧)，在繁殖过程中能产出特有的乳酸杆菌素，乳酸杆菌素是一种生物型的防腐剂。植物乳杆菌具有一定的免疫调节作用，对致病菌有抑制作用，降低血清胆固醇含量和预防心血管疾病，维持肠道内菌群平衡，促进营养物质吸收，缓解乳糖不耐症，抑制肿瘤细胞的形成等功效。随着研究的深入，植物乳杆菌也逐渐因其益生作用进入大众视野，同时被广泛应用于食品、医药与畜牧行业。
目前，植物乳杆菌的耐温性一般，制备菌剂时经常采用真空冻干方式。但植物乳杆菌菌粉存在稳定性差、质保期短的问题，限制了植物乳杆菌的使用。CN109303166A中使用海藻酸钠微胶囊包埋方式增加鼠李糖乳杆菌LGG的耐热性，但其发明使用的是菌液制备胶囊颗粒，无法长期保存，生产实用性也不强。CN115197880A提供了一株乳酸片球菌及菌粉制剂，但其益生特性与植物乳杆菌大不相同。
发明内容
在菌粉领域，菌粉通常推荐低温保藏，常温保藏时，菌粉稳定性差、质保期短，本发明的目的是为了克服菌粉在常温保藏时菌粉稳定性差、质保期短问题，提供冻干保护剂和菌粉制剂及其制备方法和应用。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种冻干保护剂，所述冻干保护剂包括奶粉、糖、谷氨酸盐、维生素、山梨醇和甘油，所述奶粉、糖、谷氨酸盐、维生素、山梨醇和甘油的重量比为1:(0.1-4):(0.01-1):(0.01-1):(0.1-3):(0.01-3)。
本发明第二方面提供了一种制备菌粉制剂的方法，所述方法包括：将活菌与上述的冻干保护剂混合后进行干燥。
本发明第三方面提供了上述的方法制备得到的菌粉制剂。
本发明第四方面提供了上述的冻干保护剂在延长菌粉制剂在常温下的保质期中的应用。
通过上述技术方案，本发明提供的冻干保护剂，可以更好地保护活菌，能延长菌粉制剂在常温下的保质期；含有该冻干保护剂的菌粉制剂，即便在常温保藏的条件下保藏较长的时间也具有较高的存活率；而且采用本发明提供的冻干保护剂，有利于降低菌粉制剂的保存成本和运输成本。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在本发明中，CFU是指菌落形成单位，即由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基平板上经过一定温度和时间培养后，生长繁殖所形成的集落。
本发明第一方面提供了一种冻干保护剂，所述冻干保护剂包括奶粉、糖、谷氨酸盐、维生素、山梨醇和甘油。
本发明中，为了使得冻干保护剂可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和保藏较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期，所述奶粉和糖的重量比为1:(0.1-4)，可以为1:0.1、1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4或以上任意两数值形成的范围及范围内的值，优选为1:(0.5-2)。
本发明中，为了使得冻干保护剂可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和保藏较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期，所述奶粉和谷氨酸盐的重量比为1:(0.01-1)，可以为1:0.01、1:0.02、1:0.03、1:0.04、1:0.05、1:0.1、1:0.15、1:0.2、1:0.25、1:0.3、1:0.35、1:0.4、1:0.45、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1或以上任意两数值形成的范围及范围内的值，优选为1:(0.03-0.5)。
本发明中，为了使得冻干保护剂可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和保藏较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期，所述奶粉和维生素的重量比为1:(0.01-1)，可以为1:0.01、1:0.02、1:0.03、1:0.04、1:0.05、1:0.1、1:0.15、1:0.2、1:0.25、1:0.3、1:0.35、1:0.4、1:0.45、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1或以上任意两数值形成的范围及范围内的值，优选为1:(0.03-0.5)。
本发明中，为了使得冻干保护剂可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和保藏较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期，所述奶粉和山梨醇的重量比为1:(0.1-3)，可以为1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3或以上任意两数值形成的范围及范围内的值，优选为1:(0.2-1)。
本发明中，为了使得冻干保护剂可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和保藏较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期，所述奶粉和甘油的重量比为1:(0.01-3)，可以为1:0.01、1:0.02、1:0.03、1:0.04、1:0.05、1:0.1、1:0.15、1:0.2、1:0.25、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3或以上任意两数值形成的范围及范围内的值，优选为1:(0.03-1)。
本发明中，为了使得冻干保护剂可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和保藏较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期，所述冻干保护剂中奶粉的含量为5-12重量％，可以为5重量％、5.5重量％、6重量％、6.5重量％、7重量％、7.5重量％、8重量％、8.5重量％、9重量％、9.5重量％、10重量％、10.5重量％、11重量％、11.5重量％、12重量％或以上任意两数值形成的范围及范围内的值。
本发明中，为了使得冻干保护剂可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和保藏较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期，所述冻干保护剂中糖的含量为5-15重量％，可以为5重量％、5.5重量％、6重量％、6.5重量％、7重量％、7.5重量％、8重量％、8.5重量％、9重量％、9.5重量％、10重量％、10.5重量％、11重量％、11.5重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％或以上任意两数值形成的范围及范围内的值。
本发明中，为了使得冻干保护剂可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和保藏较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期，所述冻干保护剂中谷氨酸盐的含量为0.1-1重量％，可以为0.1重量％、0.2重量％、0.3重量％、0.4重量％、0.5重量％、0.6重量％、0.7重量％、0.8重量％、0.9重量％、1重量％或以上任意两数值形成的范围及范围内的值。
本发明中，为了使得冻干保护剂可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和保藏较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期，所述冻干保护剂中维生素的含量为0.1-1重量％，可以为0.1重量％、0.2重量％、0.3重量％、0.4重量％、0.5重量％、0.6重量％、0.7重量％、0.8重量％、0.9重量％、1重量％或以上任意两数值形成的范围及范围内的值。
本发明中，为了使得冻干保护剂可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和保藏较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期，所述冻干保护剂中山梨醇的含量为1-4重量％，可以为1重量％、1.5重量％、2重量％、2.5重量％、3重量％、3.5重量％、4重量％或以上任意两数值形成的范围及范围内的值。
本发明中，为了使得冻干保护剂可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和保藏较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期，所述冻干保护剂中甘油的含量为0.2-4重量％，可以为0.2重量％、0.5重量％、1重量％、1.5重量％、2重量％、2.5重量％、3重量％、3.5重量％、4重量％或以上任意两数值形成的范围及范围内的值。
优选的，所述冻干保护剂还包括水，所述冻干保护剂余量为水。
本发明中，为了使得冻干保护剂可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和保藏较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期，所述维生素为维生素C和/或维生素E。
本发明中，为了使得冻干保护剂可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期，所述维生素与山梨醇的重量比为1:(2-20)，可以为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20或以上任意两数值形成的范围及范围内的值，优选为1:(2-10)。
本发明中，所述奶粉没有限制，为本领域常见的奶粉，优选为脱脂奶粉。
本发明中，所述谷氨酸盐没有限制，可以提供谷氨酸离子即可，优选为谷氨酸钠和/或谷氨酸钾。
本发明中，所述糖没有限制，为本领域常见的糖，优选为海藻糖、蔗糖和淀粉中的至少一种，更优选为海藻糖、蔗糖和任选的淀粉。
本发明中，为了使得冻干保护剂可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和保藏较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期，所述海藻糖和蔗糖的重量比为1:(0.1-2)，可以为1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.7、1:0.9、1:1、1:1.5、1:2或以上任意两数值形成的范围及范围内的值。
本发明中，为了使得冻干保护剂可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和保藏较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期，所述海藻糖与淀粉的重量比为1:(0-1)。
本发明中，所述淀粉没有限制，本领域常见的淀粉，优选为玉米淀粉、小麦淀粉、土豆淀粉和木薯淀粉中的至少一种。。
本发明中，为了使得冻干保护剂可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和保藏较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期，所述冻干保护剂中海藻糖的含量为1-8重量％，可以为1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％或以上任意两数值形成的范围及范围内的值。
本发明中，为了使得冻干保护剂可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和保藏较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期，所述冻干保护剂中蔗糖的含量为1-5重量％，可以为1重量％、2重量％、3重量％、4重量％、5重量％或以上任意两数值形成的范围及范围内的值。
本发明中，为了使得冻干保护剂可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和保藏较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期，所述冻干保护剂中淀粉的含量为0-5重量％，可以为0重量％、0.1重量％、0.2重量％、0.4重量％、0.6重量％、0.8重量％、1重量％、1.5重量％、2重量％、2.5重量％、3重量％、3.5重量％、4重量％、4.5重量％、5重量％或以上任意两数值形成的范围及范围内的值。
本发明第二方面提供了一种制备菌粉制剂的方法，所述方法包括：将活菌与上述的冻干保护剂混合后进行干燥。
本发明中，为了可以更好地保护活菌，即便是在常温保藏的条件下和保藏较长的时间下也可以有较高的存活率，延长菌粉制剂的保质期，所述相对于1g的冻干保护剂，所述活菌数为500亿-1500亿CFU，例如500亿CFU、600亿CFU、700亿CFU、800亿CFU、900亿CFU、1000亿CFU、1100亿CFU、1200亿CFU、1300亿CFU、1400亿CFU、1500亿CFU或以上任意两数值形成的范围及范围内的值。
本发明中，所述活菌没有限制，为本领域常见的细菌，优选的，所述活菌为乳酸菌(Lactobacillus)活菌；更优选为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)中的至少一种。
本发明中，所述干燥没有限制，可以将水分去除且不损伤活菌即可，优选为冷冻干燥。
优选的，所述冷冻干燥的条件包括：在温度为-30℃至-10℃，时间为3-4h的条件下进行第一预冷冻；然后在-90℃至-70℃，时间为9-10h条件下进行第二预冷冻；后在-90℃至-70℃，时间为24-48h，压力为0-1Pa条件下进行冷冻干燥。
本发明第三方面提供了上述的方法制备得到的菌粉制剂。
本发明第四方面提供了上述的冻干保护剂在延长菌粉制剂(特别是乳酸菌的菌粉制剂)在常温下的保质期(保藏较长的时间后维持了80％以上的存活率)中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，菌落计数按照GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验所述的方法进行，计算其存活率，存活率为单位体积内菌粉复水至冻干前的乳酸菌总数与冷冻干燥前的乳酸菌总数的比值，所述复水是指菌粉加生理盐水复溶至冻干前体积。
植物乳杆菌菌液的制备
平板培养基：蛋白胨10g/L、牛肉粉5g/L、酵母粉4g/L、葡萄糖2g/L、吐温80 1ml/L、磷酸氢二钾2g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸三铵2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L、琼脂粉15g/L。
种子培养基：蛋白胨10g/L、牛肉粉5g/L、酵母粉4g/L、葡萄糖2g/L、吐温80 1ml/L、磷酸氢二钾2g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸三铵2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L。
发酵培养基：葡萄糖50g/L、酵母浸粉20g/L、玉米浆20g/L、蛋白胨10g/L、柠檬酸三铵2g/L、吐温80 1g/L、K2HPO4 2g/L、MgSO4·7H2O 1.0g/L、MnSO4·H2O 0.25g/L、pH 6.5-6.8，115℃灭菌30min。
培养流程：
步骤1：甘油菌划线平板培养基，35-37℃厌氧培养箱中培养30h。
步骤2：挑取单克隆至50mL种子培养基中，35-37℃厌氧培养箱中培养14h，制备一级种子液。
步骤3：一级种子液按3重量‰转接至装有500mL种子培养基的蓝盖瓶中，35-37℃厌氧培养箱中培养14h，制备二级种子液。
步骤4：二级种子液在无菌条件下按3‰接种至发酵培养基(10L发酵罐)，35-37℃，转速150rpm，不通气，发酵过程控制pH在6-6.5之间。
步骤5：发酵过程待检测残糖在0.5g/L以下时，停止发酵。
结果表明，发酵终点植物乳杆菌的OD达到40，活菌数达到300亿CFU/mL。
实施例和对比例
步骤1：将发酵制备的植物乳杆菌菌液在4℃、8000rpm条件下离心10min，用无菌水清洗2次，将收集到的菌泥浓液梯度稀释后涂布于平板培养基，测定其冻干前的活菌数。
步骤2：冻干保护剂由表1所述的组分构成，余量为无菌水。将菌泥与冻干保护剂按1:5的重量比(相对于1g的冻干保护剂，活菌数的量为500亿CFU)充分混匀后，在温度为-20℃、冷冻时间为3.5h的条件下预冷冻；然后放置在-80℃、冷冻时间为9.5h条件下预冷冻。
步骤3：预冷冻后迅速取出放置在压力0-1Pa、温度-80℃的冷冻干燥条件下的冷冻干燥机中制得植物乳杆菌菌粉。
表1
注：单位为重量％
实施例7
按照实施例2的方法，不同的是，将玉米淀粉更换成小麦淀粉。
实施例8
按照实施例1的方法，不同的是，将维生素C更换成维生素E。
实施例9
按照实施例1的方法，不同的是，将蔗糖更换成麦芽糖。
对比例4
按照实施例1的方法，不同的是，将山梨醇更换成甘露醇。
对比例5
按照实施例1的方法，不同的是，将谷氨酸钠更换成甘氨酸。
测试例
1、将上述实施例和对比例得到的植物乳杆菌菌粉加生理盐水复溶至冻干前体积，测定活菌数和计算存活率，结果见表2。
表2
2、保藏试验：在干燥环境中将上述得到的干燥的植物乳杆菌菌粉制剂与辅料(麦芽糊精)混合均匀，使混合后的菌粉菌数在100亿CFU/g，以5g每袋装入5×15cm铝箔袋中真空封口。同时准备市场上常见的两种植物乳杆菌菌粉竞品1和竞品2(包装标称菌数均为100亿CFU/g，推荐保藏温度为-20℃)，然后室温(25℃)下，进行15d、30d和60d的保藏试验，每个时间点抽取菌粉一袋，采用稀释平板涂布法测其菌数。具体结果如表3。
表3
通过表2可以看出，采用本发明的冻干保护剂在低温的条件下也可以保证植物乳杆菌有较高的存活率；通过表3可以看出，市场上的竞品1和2于常温保藏15d后存活率最高的也只有约57％(60/105)，30d后检测存活率最高为39％(41/105)，60d后仅9.5％(10/105)存活率。与市场上的竞品相比，本发明的植物乳杆菌菌粉于常温保藏60d后存活率为20-80％，甚至在50％以上(实施例1-8)。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种冻干保护剂，其特征在于，所述冻干保护剂包括奶粉、糖、谷氨酸盐、维生素、山梨醇和甘油，所述奶粉、糖、谷氨酸盐、维生素、山梨醇和甘油的重量比为1:(0.1-4):(0.01-1):(0.01-1):(0.1-3):(0.01-3)。
2.根据权利要求1所述的冻干保护剂，其中，所述奶粉、糖、谷氨酸盐、维生素、山梨醇和甘油的重量比为1:(0.5-2):(0.03-0.5):(0.03-0.5):(0.2-1):(0.03-1)；
和/或，所述冻干保护剂中奶粉的含量为5-12重量％；
和/或，所述冻干保护剂中糖的含量为5-15重量％；
和/或，所述冻干保护剂中谷氨酸盐的含量为0.1-1重量％；
和/或，所述冻干保护剂中维生素的含量为0.1-1重量％；
和/或，所述冻干保护剂中山梨醇的含量为1-4重量％；
和/或，所述冻干保护剂中甘油的含量为0.2-4重量％；
和/或，所述冻干保护剂还包括水，所述冻干保护剂余量为水。
3.根据权利要求1或2所述的冻干保护剂，其中，所述维生素为维生素C和/或维生素E；
和/或，所述维生素与山梨醇的重量比为1:(2-20)，优选为1:(2-10)；
和/或，所述奶粉为脱脂奶粉；
和/或，所述谷氨酸盐为谷氨酸钠和/或谷氨酸钾。
4.根据权利要求1或2所述的冻干保护剂，其中，所述糖为海藻糖、蔗糖和淀粉中的至少一种；
优选的，所述糖为海藻糖、蔗糖和任选的淀粉，所述海藻糖、蔗糖和淀粉的重量比为1:(0.1-2):(0-1)；
优选的，所述淀粉为玉米淀粉、小麦淀粉、土豆淀粉和木薯淀粉中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的冻干保护剂，其中，所述冻干保护剂中海藻糖的含量为1-8重量％；
和/或，所述冻干保护剂中蔗糖的含量为1-5重量％；
和/或，所述冻干保护剂中淀粉的含量为0-5重量％。
6.一种制备菌粉制剂的方法，其特征在于，所述方法包括：将活菌与权利要求1-5中任意一项所述的冻干保护剂混合后进行干燥。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述相对于1g的冻干保护剂，所述活菌数为500亿-1500亿CFU；
和/或，所述活菌为乳酸菌(Lactobacillus)活菌；优选为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)中的至少一种。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述干燥的方式为冷冻干燥；
优选的，所述冷冻干燥的条件包括：在温度为-30℃至-10℃，时间为3-4h的条件下进行第一预冷冻；然后在-90℃至-70℃，时间为9-10h条件下进行第二预冷冻；后在-90℃至-70℃，时间为24-48h，压力为0-1Pa条件下进行冷冻干燥。
9.权利要求6-8中任意一项所述的方法制备得到的菌粉制剂。
10.权利要求1-5中任意一项所述的冻干保护剂在延长菌粉制剂在常温下的保质期中的应用。
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