CN117736940A

CN117736940A - 一种改善肠道健康的长双歧杆菌长亚种bn08及其后生元

Info

Publication number: CN117736940A
Application number: CN202410179214.3A
Authority: CN
Inventors: 袁秀丽; 陈华纲; 吴柏峰
Original assignee: Hunan Yibai Yiyou Biotechnology Co ltd; Guangzhou Tongkang Biological Technology Co ltd
Current assignee: Hunan Yibai Yiyou Biotechnology Co ltd; Guangzhou Tongkang Biological Technology Co ltd
Priority date: 2024-02-18
Filing date: 2024-02-18
Publication date: 2024-03-22
Anticipated expiration: 2044-02-18
Also published as: CN117736940B

Abstract

本发明公开了一种改善肠道健康的长双歧杆菌长亚种BN08及其后生元。所述长双歧杆菌长亚种为长双歧杆菌长亚种（Bifidobacterium longum subsp.longum）BN08，于2023年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29105。本发明所提供的长双歧杆菌长亚种BN08能够增强肠道屏障功能完整性、抑制致病菌粘附。本发明所提供的改善肠道健康的益生菌后生元是长双歧杆菌长亚种BN08浓缩菌体溶胞产物的菌剂，具有改善肠道健康的效果。

Description

一种改善肠道健康的长双歧杆菌长亚种BN08及其后生元

技术领域

本发明涉及益生菌技术领域，尤其涉及一种改善肠道健康的长双歧杆菌长亚种BN08及其后生元。

背景技术

肠道，是在消化道中长度最长也是最为重要的器官。口腔、食管和胃，是上消化道。我们摄入的食物在上消化道只进行了初步消化，只有在肠道才会最终被转化为可被吸收的营养物质，并被身体逐步吸收。

现代医学研究表明，肠道通过肠道菌群承担了内分泌激素调节、机体免疫反应、代谢产物转化等一系列复杂的生理作用，并与肝脏、肾脏甚至大脑的功能调节密切相关。因此，肠道健康与人体健康息息相关，改善肠道健康，除了要补充益生菌，还需要增强肠道黏膜屏障功能的完整性，稳固根基，从根本上调节肠道微生态正向平衡。

在保护肠道健康方面的产品主要为益生菌，且为粉剂，虽然有一定效果，但是需要坚持食用、积累到一定量时，效果才会比较显著。如何在保护肠道健康的基础上，高效改善肠道健康，是我们亟待要解决的问题。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种改善肠道健康的长双歧杆菌长亚种BN08，能够增强肠道屏障功能完整性、抑制致病菌粘附。

本发明的目的之二在于提供一种改善肠道健康的益生菌后生元，所述益生菌后生元是长双歧杆菌长亚种BN08浓缩菌体溶胞产物的菌剂，具有改善肠道健康的效果。

本发明的目的之三在于提供一种改善肠道健康的益生菌后生元的制备方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种改善肠道健康的长双歧杆菌长亚种，所述长双歧杆菌长亚种为长双歧杆菌长亚种（Bifidobacterium longum subsp.longum）BN08，所述长双歧杆菌长亚种（Bifidobacterium longum subsp.longum）BN08于2023年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29105。

作为本发明的一个优选方案，所述长双歧杆菌长亚种BN08通过以下方式中的至少一种发挥改善肠道健康的作用：

（Ⅰ）降低肠道黏膜渗透性，保护肠道屏障功能的完整性；

（Ⅱ）抑制致病菌粘附于肠道。

作为本发明的一个优选方案，所述致病菌包括大肠杆菌和沙门氏菌。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种改善肠道健康的产品，所述产品的活性成分包括长双歧杆菌长亚种BN08的活菌体和/或灭活型菌体。

作为本发明的一个优选方案，所述产品包括益生菌冻干粉、益生菌发酵物和益生菌溶胞物。

作为本发明的一个优选方案，本发明提供了一种改善肠道健康的益生菌后生元，所述后生元由所述长双歧杆菌长亚种BN08的发酵培养物制备而成，所述长双歧杆菌长亚种BN08在发酵培养基中发酵获得所述发酵培养物，所述发酵培养基包括按照重量份计的以下组分：黄豆粉35-110份，全脂奶粉15-75份，黄小米粉5-20份，蛋白胨5-20份，橙汁10-30份，葡萄糖5-80份，乳糖20-80份。

本发明采用特定的发酵培养基，能够使得长双歧杆菌长亚种BN08的长势好，用此发酵培养基培养获得的菌液，长双歧杆菌长亚种BN08浓度高。

作为本发明的一个优选方案，所述发酵培养基包括按照重量份计的以下组分：黄豆粉35-110份，全脂奶粉15-75份，黄小米粉5-15份，蛋白胨10-20份，橙汁10-30份，葡萄糖40-80份，乳糖20-40份。

作为本发明的一个优选方案，所述后生元为肠溶软胶囊，所述软胶囊的制备原料包括明胶和甘油；所述肠溶软胶囊经过甲醛浸渍。

作为本发明的一个优选方案，所述肠溶软胶囊经过甲醛浸渍，所述甲醛的浓度为2~4%，优选地为3%。

本发明的目的之三采用如下技术方案实现：

一种改善肠道健康的益生菌后生元的制备方法，包括以下步骤：所述长双歧杆菌长亚种BN08在所述发酵培养基中发酵，发酵菌液通过中空纤维膜滤出滤液，用所述发酵培养基反向冲刷中空纤维膜进行再次发酵，循环至少2次；离心、过滤、取沉淀得到菌体；菌体进行溶胞、冻干后，制备肠溶软胶囊，所述肠溶软胶囊经过甲醛浸渍后，干燥，即得。

本发明所提供的改善肠道健康的益生菌后生元的制备方法，采用膜滤循环培养技术，将连续培养与膜过滤结合，代谢产物通过微滤膜被滤除，菌体因不能透过滤孔被截留，同时向发酵罐中流加新鲜培养基，不仅给增殖的微生物提供充足的营养物质，而且去除了代谢产物的抑制作用，即微生物在生长和繁殖过程中，伴随着也会代谢有机酸等物质于发酵液中，随着发酵液中大量有机酸的积累，其生长环境pH值也在降低，在这种发酵液环境下，H⁺和有机酸中未解离的分子形式能对菌株产生抑制作用。本发明的膜滤循环培养技术极大地促进更多数量的增殖，不仅可以实现高密度培养，而且还可以得到较高的反应产率。此外，所示用的过滤膜为0.06μm的中空纤维膜，具有高度的选择渗透特性，能定向截留菌体，滤除菌体以外的其他大分子物质，同时，能在发酵过程中循环利用，有利于节约资源。

作为本发明的一个优选方案，改善肠道健康的益生菌后生元的制备方法，包括以下步骤：

1）培养基制备

培养基A：称取葡萄糖18~23g、蛋白胨8~12g、牛肉膏5~10 g、酵母粉2~6g、Tween800.5~3 mL、磷酸氢二钾1~4g、硫酸镁 0.1~0.5 g、硫酸锰 0.02~0.08 g、柠檬酸铵 1.0~3.0g、乙酸钠 3.0~7.0 g，加入蒸馏水搅拌溶解，定容，调节pH至6~7，120~122℃灭菌18~23min，冷却至35~39℃，即得培养基A；

培养基B：在培养基A中加入质量浓度为1~3%的琼脂粉，搅拌溶解，120~122 ℃灭菌18~22min，即得培养基B；

培养基C：称取酵母膏8~12g、蛋白胨8~12g、葡萄糖40~60g、乙酸钠0.2~0.7g、MgSO₄·7H₂O 0.1~0.3g、MnSO₄·4H₂O 0.01~0.03g、FeSO₄·7H₂O 0.01~0.03g、NaCl 0.01~0.03g、ZnSO₄·7H₂O 0.1~0.3g，加入蒸馏水搅拌溶解，定容，调节pH至6~7，120~122℃灭菌18~23min，冷却至35~39℃，即得培养基C；

培养基D：称取黄豆粉35-110 g、全脂奶粉15-75 g、黄小米粉5-20 g、蛋白胨5-20g、橙汁10-30 g、葡萄糖5-80 g、乳糖20-80 g、乙酸钠0.3~0.8g、MgSO₄·7H₂O 0.1~ 0.4g、MnSO₄·4H₂O 0.01~0.05g、FeSO₄·7H₂O 0.01~0.05g、NaCl 0.01~0.05g、ZnSO₄·7H₂O 0.1~0.5g，加入蒸馏水搅拌溶解，定容，调节pH至6~7，120~122℃灭菌18~23min，冷却至35~39℃，即得培养基D；

2）菌种活化：将冻藏保存的长双歧杆菌长亚种BN08在培养基B上用接种环划线接种，在温度为35~38℃的厌氧工作站生长30~40h，挑取单菌落转移至5 ~10mL培养基A中，35~38 ℃厌氧生长20~30 h，再吸取0.1~0.5mL菌液转移至5~10 mL培养基A中，35~38 ℃厌氧生长20~30h，在7500~8000r/min、3~5℃的条件下离心8~12min，取沉淀，即为基料E；

3）种子培养：挑取3~5环基料E接种于装有250~500 mL培养基C的500 ~1000 mL三角瓶中，用封口膜封口，35~39 ℃ 恒温、静置、厌氧培养20~30h，得基料F；

4）膜滤循环培养：将500~1000mL培养基D加入发酵罐中，接种0.5~3%的基料F，在35~38℃、转速30~65 r/min的条件下厌氧培养20~30h，得菌液G；将菌液G通过0.05~0.08μm的中空纤维膜H滤出滤液I；将500~1000 mL培养基D反向冲刷中空纤维膜H入发酵罐中，在35~38℃、转速30~65 r/min的条件下厌氧培养20~30h，得菌液J；将菌液J通过0.05~0.08μm的中空纤维膜H滤出滤液K；将500~1000 mL培养基D反向冲刷中空纤维膜H入发酵罐中，在35~38℃、转速30~65r/min的条件下厌氧培养20~30h，得菌液L；

5）离心：将菌液L置于离心机中，在7000~9000r/min的条件下离心8~12min，过滤，取沉淀，即为基料M；将基料M用蒸馏水离心洗涤2~4次，得菌体N；

6）溶胞：将菌体N在-30~-40℃的温度下冷冻20~30h后，在3~8℃的条件下解冻5~7h，再置于破壁机中，在18000~22000r/min的条件下破壁3~8s，重复3~5次，得基料O；

7）冻干：将基料O置于冻干机的搁板上，在-38~-42℃的条件下预冻9~12h，接着在-28~-32℃的条件下干燥12~18h，最后，将搁板温度升温至12~18℃，干燥6~8h，得基料P；

8）粉碎：将基料P置于粉碎机中，在30000~36000r/min的条件下粉碎3~5min，过200~400目筛，得基料Q；

9）调配：将20~60份基料Q和35~60份大豆油搅拌均匀，过200~400目筛，重复3~5次，在120~122℃的条件下灭菌18~22min，静置2~3h，再抽真空，真空度为-0.08~-0.09MPa，得基料R；

10）化胶：将蒸馏水先加热至55~65℃，再称取35~45份置于化胶罐中，向化胶罐中继续加入35~45份明胶，静置0.8~1.5h，再加入18~25份甘油，混合加热搅拌，转速为200~350r/min，温度保持50~70℃，静置1~2.5h，抽真空，真空度为-0.08~-0.1MPa，过滤，得胶液S；

11）胶带制备：将胶液S加入软胶囊机两边的胶盒中，调节胶带厚度为0.6~1mm；

12）填充压制：将基料R倒入到软胶囊机的料斗中，调节胶盒温度50~60℃，喷体温度35~45℃，转速2~3r/min，压制成丸T；

13）干燥：将丸T置于干燥机中，在30~45℃的条件下，鼓风干燥4~6h，得丸U；

14）浸渍：将丸U置于甲醛溶液中搅拌浸泡0.8~1.2h，甲醛溶液的浓度为2~4%，转速为40~60r/min，沥干水分，得丸V；

15）洗擦：使用无水乙醇将丸V囊壳表面完全洗净并将其晾干，得丸W；

16）干燥：将丸W放在托盘中，在20~30℃的条件下进行干燥15~20h，得肠溶软胶囊，即长双歧杆菌长亚种BN08后生元。

本发明所提供的益生菌后生元的制备方法，采用特定的溶胞技术，通过冻融与固体剪切联合进行，即将微生物细胞在-35℃的温度下冷冻24h后，再在5℃的条件下解冻6h，在冷冻的微生物细胞反复冷冻及解冻过程中，细胞体内及细胞外的残留水分会凝结成微小冰晶，使微生物细胞质构变硬变脆，在高速切刀等机械作用下，能产生液体剪切力和固态冰晶研磨作用力，导致细胞破碎，有利于细胞内容物成分释放，如：肽聚糖、磷壁酸、多糖、脂质、细胞膜蛋白、维生素、氨基酸、核苷酸、酶等营养成分，与肠道内乳酸菌亲和力强，能更好地被肠道乳酸菌吸收和利用，促进乳酸菌增殖，抑制致病菌生长，改善肠道健康。

本发明的肠溶软胶囊制备技术，所制得的软胶囊能定向在肠道溶解，释放出含有后生元的内容物，有效避免了后生元在消化道运输过程中的损耗，可以直接将营养物质传递给肠道有益菌吸收和利用，发挥益生功效。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

（1）本发明所提供的改善肠道健康的长双歧杆菌长亚种BN08，能够降低肠道黏膜渗透性，增强肠道屏障功能完整性，抑制致病性大肠杆菌和沙门氏菌等致病菌粘附。

（2）本发明所提供的益生菌后生元，是由长双歧杆菌长亚种BN08的浓缩菌体溶胞产物的菌剂，由高密度培养技术、膜滤循环培养技术、冻融与固体剪切联合溶胞技术、肠溶技术创新技术加工制作而成，具有剂量小、浓度高、靶向作用肠道的特点，进入人体后，能顺利到达肠道溶解释放，将后生元直接传递给肠道，供细胞快速吸收，促进肠道有益菌增殖，降低肠道黏膜的渗透性，从而增强肠道屏障功能完整性。此外，长双歧杆菌长亚种BN08后生元还能抑制致病菌粘附与肠道黏膜细胞，破坏致病菌入侵人体的第一道防线，从根本上改善肠道健康。

生物材料保藏信息：长双歧杆菌长亚种BN08，保藏编号为CGMCC No.29105，分类命名为：长双歧杆菌长亚种Bifidobacterium longum subsp.longum，已于2023年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），保藏单位的缩写为CGMCC。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过商业渠道购买获得。

本发明实施例通过大量实验，筛选出能够增强肠道屏障功能完整性、抑制致病菌粘附的益生菌，再通过创新技术研制成后生元，后生元进入人体后能够顺利到达肠道被快速吸收，极高效率地保护肠道微生态正向平衡，改善肠道健康。

体系一：降低肠道黏膜渗透性的菌种筛选

肠道黏膜渗透性是指黏膜表面被某种物质穿透的能力，是评价肠道屏障功能的指标。重楼皂苷I（PPI）为重楼总皂苷中的主要生物活性成分，具有广谱抗肿瘤作用，能导致肠黏膜细胞损伤，细胞膜渗透性提高。Caco-2细胞是人结肠腺癌细胞，具有微绒毛结构、刷状边缘以及细胞间紧密连接等类似于人类小肠黏膜细胞的结构，可以模拟体外培养的人肠上皮的结构和功能。当肠道屏障功能不完整时，一突出的表现就是细胞膜的渗透性降低，在与锥虫蓝染液作用时就容易着色。

实验方法如下：

1、实验菌种：鼠李糖乳酪杆菌、发酵粘液乳杆菌、唾液联合乳杆菌、长双歧杆菌长亚种、乳酸片球菌。

2、实验细胞：Caco-2细胞

3、样品制备

（1）培养基制备

1）培养基A：称取葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉膏8 g、酵母粉4g、Tween80 1 mL、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g、柠檬酸铵2.0 g、乙酸钠5.0g，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至1000mL，调节pH至6.4，121℃灭菌20min，冷却至37℃，即得培养基A。

2）培养基B：在培养基A中加入质量浓度为2%的琼脂粉，搅拌溶解，121 ℃灭菌20min，即得培养基B。

3）PBS缓冲液：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄、0.24g KH₂PO₄溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，即得。

（2）菌种活化：将冻藏保存的实验菌种在培养基B上用接种环划线接种，在温度为37℃的厌氧工作站生长36h，挑取单菌落转移至5 mL培养基A中，37 ℃厌氧生长24 h，再吸取0.1mL菌液转移至5 mL培养基A中，37 ℃厌氧生长24h，在8000r/min、4℃的条件下离心10min，取沉淀，即得菌泥。

（3）稀释：将菌泥用PBS缓冲液稀释成乳酸菌浓度为1×10⁸CFU/mL的菌液。

（4）溶胞：将菌液在-35℃的温度下冷冻24h后，在5℃的条件下解冻6h，再置于破壁机中，在20000r/min的条件下破壁5s，重复3次，得溶胞产物。

（5）灭菌：将溶胞产物在121℃的条件下灭菌20min，即得样品溶液。将鼠李糖乳酪杆菌、发酵粘液乳杆菌、唾液联合乳杆菌、长双歧杆菌长亚种、乳酸片球菌制成的样品溶液，分别编号为A液、B液、C液、D液、E液。

4、细胞培养

（1）DMEM 完全培养液制备：DMEM 培养基加入 10%胎牛血清和 1% P/S双抗。

（2）细胞复苏：将含有1 mLCaco-2细胞悬液的冻存管于37℃水浴锅迅速摇晃解冻，加入到含6 mL DMEM完全培养液的离心管中，混合均匀，1000 r/min离心4 min，弃去上清液，用DMEM完全培养液重悬细胞。将细胞悬液加入含6 mL DMEM完全培养液的细胞培养瓶中，于37℃、含有 5% CO₂的培养箱内过夜。

（3）细胞传代：待细胞长至瓶底面积约85%时，用PBS缓冲液将培养瓶冲洗3次后，加入 2 mL 0.25% Trypsin-EDTA胰蛋白酶，用倒置显微镜观察到Caco-2 细胞逐渐变圆、细胞之间逐渐失去联系时，加入DMEM完全培养液终止消化，将细胞悬液收集至离心管，1000 r/min离心4 min，弃上清液，获得细胞团。将细胞团重悬于DMEM完全培养液中，获得细胞悬液，将细胞悬液平均转移至两个细胞培养瓶中，左右前后摇动瓶体使细胞在瓶底分布均匀，放入37℃、含有 5% CO₂的培养箱继续培养。

5、实验测试

（1）将培养好的细胞分为空白组、模型组、实验组（A组～E组）。

（2）将培养好的细胞接种于6孔板中（调整细胞浓度为3×10⁴个/cm²），每孔2 mL。

空白组用含有10%PBS缓冲液的完全培养液培养24h。

模型组用加入含有10%PBS缓冲液、6μmol/L PPI的完全培养液培养24h。

A组用加入含有10%A液、6μmol/L PPI的完全培养液培养24h。

B组加入含有10%B液、6μmol/L PPI的完全培养液培养24h。

C组加入含有10%C液、6μmol/L PPI的完全培养液培养24h。

D组加入含有10%D液、6μmol/L PPI的完全培养液培养24h。

E组加入含有10%E液、6μmol/L PPI的完全培养液培养24h。

培养结束时，1000 r/min离心4 min，收集上清液，用PBS缓冲液清洗2次后，收集细胞，配制成细胞悬液，与上清液混合。取混合液10μL与0. 4%锥虫蓝染液10μL混匀，记数阳染和未染细胞数量，计算细胞的阳染率，结果如1所示。

6、结果与分析

表1 不同菌种的溶胞产物对Caco-2细胞锥虫蓝阳染率的影响

由表2可得，与空白组、模型组相比，A组～E组的阳染率均有不同程度的降低，其中D组的阳染率最低，说明D组的溶胞产物能降低Caco-2细胞的渗透性，即长双歧杆菌长亚种在降低肠道黏膜渗透性方面的能力较好，能保护肠道屏障功能的完整性。

体系二、抑制致病菌粘附的菌株筛选

粘附是致病菌定植于宿主细胞并发挥生理作用的首要前提条件，同时也是致病的第一步。致病性大肠杆菌和沙门氏菌均是常见的动物肠道致病菌。

实验方法如下：

1、实验菌株：长双歧杆菌长亚种CICC 6188（保藏号：CICC 6188）、长双歧杆菌长亚种BN08、长双歧杆菌长亚种CICC 6187（保藏号：CICC 6187）

其中，长双歧杆菌长亚种CICC 6188（保藏号：CICC 6188）和长双歧杆菌长亚种CICC 6187（保藏号：CICC 6187）购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

2、实验细胞：Caco-2细胞、大肠杆菌、沙门氏菌

3、样品制备

（1）培养基制备

1）培养基A：称取葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉膏8 g、酵母粉4g、Tween80 1 mL、磷酸氢二钾2g、硫酸镁 0.2 g、硫酸锰 0.05 g、柠檬酸铵 2.0 g、乙酸钠 5.0 g，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至1000mL，调节pH至6.4，121℃灭菌20min，冷却至37℃，即得培养基A。

（2）菌种活化：将冻藏保存的实验菌种在培养基B上用接种环划线接种，在温度为37℃的厌氧工作站生长36h，挑取单菌落转移至5 mL培养基A中，37 ℃厌氧生长24 h，再吸取0.1mL菌液转移至5 mL培养基A中，37 ℃厌氧生长24h，在8000r/min、4℃的条件下离心10min，取沉淀，即得菌泥；

（5）灭菌：将溶胞产物在121℃的条件下灭菌20min，即得样品溶液。将长双歧杆菌长亚种CICC 6188、长双歧杆菌长亚种BN08、长双歧杆菌长亚种CICC 6187制成的样品溶液，分别编号为A液、B液、C液。

4、Caco-2细胞培养

（1）培养基制备

1）DMEM 完全培养液：DMEM 培养基加入10%胎牛血清和1% P/S双抗；

2）DMEM 不完全培养液：DMEM 培养基中加入10%胎牛血清；

（2）细胞复苏：将含有1 mLCaco-2细胞悬液的冻存管于37℃水浴锅迅速摇晃解冻，加入到含6 mL DMEM完全培养液的离心管中，混合均匀，1000 r/min离心4 min，弃去上清液，用DMEM完全培养液重悬细胞。将细胞悬液加入含6 mL DMEM完全培养液的细胞培养瓶中，于37℃、含有 5% CO2的培养箱内过夜。

（3）细胞传代：待细胞长至瓶底面积约85%时，用PBS缓冲液将培养瓶冲洗3次后，加入2 mL 0.25% Trypsin-EDTA胰蛋白酶，用倒置显微镜观察到Caco-2 细胞逐渐变圆、细胞之间逐渐失去联系时，加入DMEM完全培养液终止消化，将细胞悬液收集至离心管，1000 r/min离心4 min，弃上清液，获得细胞团。将细胞团重悬于DMEM完全培养液中，获得细胞悬液，将细胞悬液平均转移至两个细胞培养瓶中，左右前后摇动瓶体使细胞在瓶底分布均匀，放入37℃、含有 5% CO₂ 的培养箱继续培养。

5、大肠杆菌、沙门氏菌培养

1）LB 培养基制备：胰蛋白胨 10 g/L、酵母浸粉 5 g/L、氯化钠 10 g/L，pH 7.2，121℃灭菌20min；

2）将大肠杆菌接种至装有100 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，37℃、250 r/min摇床振荡培养12 h，获得大肠杆菌种子液。以体积分数 2%的接种量，将大肠杆菌种子液接种至装有100 mL LB 培养基的 250 mL 三角瓶中，37℃、250 r/min 摇床中培养15 h，即得大肠杆菌菌液。

3）沙门氏菌培养：将沙门氏菌接种至装有 100 mL LB 培养基的 250 mL 三角瓶中，37℃、250 r/min 摇床振荡培养 15 h，获得沙门氏菌种子液。以体积分数2%的接种量，将沙门氏菌种子液接种至装有100 mL LB 培养基的 250 mL 三角瓶中，37℃、250 r/min摇床中培养 20 h，即得沙门氏菌菌液。

6、实验测试

（1）将培养好的Caco-2细胞的细胞团重悬于DMEM完全培养液中，接种至24孔板（1mL/孔），置于37℃、含5% CO₂培养箱中培养。待细胞长满至孔底80%及以上时，吸除24孔板中的 DMEM 完全培养液，更换无抗生素的DMEM不完全培养液继续培养待用。

（2）分别取10 mL培养好的大肠杆菌、沙门氏菌菌液于离心管中，5000 r/min离心5min，弃去上清液，得大肠杆菌、沙门氏菌菌体，用PBS缓冲液清洗菌体3次，加入DMEM不完全培养液，调整大肠杆菌、沙门氏菌液OD₆₀₀=0.2，得大肠杆菌悬液和沙门氏菌悬液。

（3）将A液、B液、C液分别与大肠杆菌悬液以1:4（v/v）混合，得培养液A，分别记为A1组、B1组、C1组。将A液、B液、C液分别与沙门氏菌悬液以1:4（v/v）混合，得培养液B，分别记为A2组、B2组、C2组；

（4）将24孔板中的DMEM不完全培养液吸除，更换为培养液A，以 PBS 缓冲液作对照，其中“以 PBS 缓冲液作对照”的组作为空白组，记为D1组，将 24 孔板置于37℃、含5%CO₂ 培养箱中2 h。将24孔板中的DMEM不完全培养液吸除，更换为培养液B，以 PBS 缓冲液作对照，其中“以 PBS 缓冲液作对照”的组作为空白组，记为D2组，将 24 孔板置于37℃、含5% CO₂ 培养箱中2 h。

（5）用 DNA 提取试剂盒分别提取粘附于 Caco-2 细胞的大肠杆菌、沙门氏菌的DNA，用去离子水适当稀释提取的 DNA，用RT-PCR测Ct 值，据标准曲线计算粘附于Caco-2细胞的大肠杆菌、沙门氏菌的菌落数，计算实验菌株对大肠杆菌、沙门氏菌的抑制粘附率，结果如表2所示。

7、结果与分析

表2 不同菌株的溶胞产物对致病菌粘附的影响

由表2可得，与空白组（D1、D2）相比，实验组的抑制粘附率均有显著提高，说明各组样品溶液都能抑制致病菌在Caco-2细胞上粘附，在A1、B1、C1组中，B1组的抑制粘附率最低，即长双歧杆菌长亚种BN08的溶胞产物对抑制大肠杆菌粘附Caco-2细胞效果最好。

在A2、B2、C2组中，B2组的抑制粘附率最低，即长双歧杆菌长亚种BN08的溶胞产物对抑制沙门氏菌粘附Caco-2细胞效果最好。因此，选择长双歧杆菌长亚种BN08作为抑制致病菌粘附的最佳菌株。

体系三：高密度发酵培养基组方筛选

按照表3的配方，配制不同的发酵培养基。

表3 发酵培养基组方

对比例1与实施例1的区别在于，加入番茄汁并调整葡萄糖的用量，番茄汁用量为15份，葡萄糖用量为20份。其余与实施例1相同。

对比例2与实施例2的区别在于，省略全脂奶粉和橙汁，加入番茄汁，全脂奶粉的用量为0份，橙汁用量为0份，番茄汁用量为30份。其余与实施例2相同。

对比例3与实施例4的区别在于，加入番茄汁，省略乳糖，番茄汁的用量为20份，乳糖用量为0份。其余与实施例4相同。

对比例4与实施例5的区别在于，省略黄小米粉和葡萄糖，加入番茄汁，黄小米粉的用量为0份，葡萄糖的用量为0份，番茄汁的用量为10份。其余与实施例5相同。

实施例1-5和对比例1-4的益生菌发酵培养液按照以下方法制备而成：

1、样品制备

（1）培养基制备

3）培养基C：称取酵母膏10g、蛋白胨10g、葡萄糖50g、乙酸钠0.5g、MgSO₄·7H₂O0.2g、MnSO₄·4H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、NaCl 0.01g、ZnSO₄·7H₂O 0.2g，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至1000mL，调节pH至6.4，121℃灭菌20min，冷却至37℃，即得培养基C。

4）培养基D：按表3组方称取各组分，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至1000mL，调节pH至6.4，121℃灭菌20min，冷却至37℃，即得培养基D。

（2）菌种活化：将冻藏保存的长双歧杆菌长亚种BN08在培养基B上用接种环划线接种，在温度为37℃的厌氧工作站生长36h，挑取单菌落转移至5 mL培养基A中，37 ℃厌氧生长24 h，再吸取0.1mL菌液转移至5 mL培养基A中，37 ℃厌氧生长24h，在8000r/min、4℃的条件下离心10min，取沉淀，即为基料E。

（3）种子培养：挑取3环基料E接种于装有300 mL培养基C的500 mL三角瓶中，用封口膜封口，37 ℃ 恒温、静置、厌氧培养24h，得基料F。

（4）膜滤循环培养：将600mL培养基D加入1L发酵罐中，接种1%的基料F，在37℃、转速50r/min的条件下厌氧培养24h，得菌液G；将菌液G通过0.06μm的中空纤维膜H滤出滤液I；将600mL培养基D反向冲刷中空纤维膜H入1L发酵罐中，在37℃、转速50r/min的条件下厌氧培养24h，得菌液J；将菌液J通过0.06μm的中空纤维膜H滤出滤液K；将600mL培养基D反向冲刷中空纤维膜H入1L发酵罐中，在37℃、转速50r/min的条件下厌氧培养24h，得菌液L。

2、检测方法

根据《GB 4789.35食品安全国家标准》对菌液L中的乳酸菌进行计数，结果如表4所示。

3、结果与分析

表4 不同组方的菌液中乳酸菌活菌数（×10¹¹CFU/mL）

由表4可得，不同的组方所得的菌液中，乳酸菌的活菌数不同，其中实施例1-5的乳酸菌活菌数要高于对比例1-4。实施例3的乳酸菌活菌数最高，说明菌株长势最好，用此组方培养获得的菌液，乳酸菌浓度高。因此，选择实施例3的组分作为高密度发酵培养基的最佳组方。

体系四、肠溶软胶囊的甲醛浓度组方筛选

表5 肠溶软胶囊的甲醛浓度（%）

长双歧杆菌长亚种BN08后生元的制备方法如下：

1、样品制备

（1）培养基制备

4）培养基D：称取黄豆粉60g、全职奶粉50g、黄小米粉10g、蛋白胨15g、橙汁30g、葡萄糖40g、乳糖40g、乙酸钠0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、MnSO₄·4H₂O 0.01g、FeSO₄·7H₂O0.01g、NaCl 0.01g、ZnSO₄·7H₂O 0.2g，加入蒸馏水搅拌溶解，定容至1000mL，调节pH至6.4，121℃灭菌20min，冷却至37℃，即得培养基D。

（5）离心：将菌液L置于离心机中，在8000r/min的条件下离心10min，过滤，取沉淀，即为基料M；将基料M用蒸馏水离心洗涤2次，得菌体N。

（6）溶胞：将菌体N在-35℃的温度下冷冻24h后，在5℃的条件下解冻6h，再置于破壁机中，在20000r/min的条件下破壁5s，重复3次，得基料O。

（7）冻干：将基料O置于冻干机的搁板上，在-40℃的条件下预冻10h，接着在-30℃的条件下干燥15h，最后，将搁板温度升温至15℃，干燥7h，得基料P。

（8）粉碎：将基料P置于粉碎机中，在34000r/min的条件下粉碎3min，过300目筛，得基料Q。

（9）调配：将40份基料Q和60份大豆油搅拌均匀，过300目筛，重复3次，在121℃的条件下灭菌20min，静置2h，再抽真空，真空度为-0.08MPa，得基料R。

（10）化胶：将蒸馏水先加热至60℃，再称取40份置于化胶罐中，向化胶罐中继续加入40份明胶，静置1h，再加入20份甘油，混合加热搅拌，转速为300r/min，温度保持60℃，静置2h，抽真空，真空度为-0.08MPa，过滤，得胶液S。

（11）胶带制备：将胶液S加入软胶囊机两边的胶盒中，调节胶带厚度为0.8mm。

（12）填充压制：将基料R倒入到软胶囊机的料斗中，调节胶盒温度55℃，喷体温度40℃，转速2.5r/min，压制成丸T。

（13）干燥：将丸T置于干燥机中，在35℃的条件下，鼓风干燥5h，得丸U。

（14）浸渍：将丸U置于甲醛溶液中搅拌浸泡1h，甲醛溶液的浓度如表5所示，转速为50r/min，沥干水分，得丸V。

（15）洗擦：使用无水乙醇将丸V囊壳表面完全洗净并将其晾干，得丸W；

（16）干燥：将丸W放在托盘中，在25℃的条件下进行干燥18h，得肠溶软胶囊，即长双歧杆菌长亚种BN08后生元。

2、检测方法

根据《中国药典》 0921崩解时限检查法对肠溶软胶囊的平均崩解时间进行检测，结果如表6所示。

3、结果与分析

表6 不同实施例的肠溶软胶囊崩解时间（min）

由表6可得，不同的甲醛浓度制备的肠溶软胶囊的崩解时间不同，实施例6的崩解时间较短，说明这种软胶囊在未到达肠道时就已经在消化道发生崩解。实施例8、实施例9、实施例10的崩解时间较长，说明这种软胶囊在肠道需要一定时间才能溶解，由于时间较长，在肠道的某些部位无法触及。实施例7的软胶囊崩解时间符合药典要求，即在酸液120min内不崩解，在人工肠液60min内完全崩解，由于在肠液崩解时间适中，因此有利于全肠道滋养。因此，选择实施例7的组方作为肠溶软胶囊的甲醛浓度的最佳组方。

体系五、人群测试

1、测试样品：实施例7的长双歧杆菌长亚种BN08后生元、市售某益生菌（益适倍）。

2、受试人群：30人，年龄为25～50岁，受试人群均为肠道问题人群，每月便秘或腹泻发生次数为4次。

3、测试方法

（1）将人群随机分成3组，每组10人，记为A组、B组、C组。A组不食用测试样品，B组食用市售某益生菌（益适倍），C组食用长双歧杆菌长亚种BN08后生元。

（2）测试样品均饭后半小时食用，每日3次，每次1份。市售某益生菌（益适倍）1袋视为1份，长双歧杆菌长亚种BN08后生元6粒视为1份。

（3）测试周期为30天，第31天时，统计受试者使用周期内的腹痛次数，结果如表7所示。

4、结果与分析

表7 30天内受试者的腹痛次数（次）

由表7可得，不同组别的受试者便秘或腹泻次数不同，其中A组人群没有测试样品干预，便秘或腹泻次数不变，说明肠道亚健康程度不变。B组、C组的便秘或腹泻次数均有减少，B组的次数最少，说明B组的测试样品效果最好，即长双歧杆菌长亚种BN08后生元能很好地改善肠道健康。

本发明实施例所提供的长双歧杆菌长亚种BN08后生元是浓缩菌体溶胞产物的菌剂，由高密度培养技术、膜滤循环培养技术、冻融与固体剪切联合溶胞技术、肠溶技术创新技术加工制作而成，具有剂量小、浓度高、靶向作用肠道的特点，进入人体后，能顺利到达肠道溶解释放，将后生元直接传递给肠道，供细胞快速吸收，促进肠道有益菌增殖，降低肠道黏膜的渗透性，从而增强肠道屏障功能完整性。此外，长双歧杆菌长亚种BN08后生元还能抑制致病菌粘附与肠道黏膜细胞，破坏致病菌入侵人体的第一道防线，从根本上改善肠道健康。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims

1.一种改善肠道健康的长双歧杆菌长亚种，其特征在于，所述长双歧杆菌长亚种为长双歧杆菌长亚种（Bifidobacterium longum subsp.longum）BN08，所述长双歧杆菌长亚种（Bifidobacterium longum subsp.longum）BN08于2023年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29105。

2.如权利要求1所述的改善肠道健康的长双歧杆菌长亚种，其特征在于，所述长双歧杆菌长亚种BN08通过以下方式中的至少一种发挥改善肠道健康的作用：

（Ⅰ）降低肠道黏膜渗透性，保护肠道屏障功能的完整性；

（Ⅱ）抑制致病菌粘附于肠道。

3.如权利要求2所述的改善肠道健康的长双歧杆菌长亚种，其特征在于，所述致病菌包括大肠杆菌和沙门氏菌。

4.一种改善肠道健康的产品，其特征在于，所述产品的活性成分包括长双歧杆菌长亚种BN08的活菌体和/或灭活型菌体。

5.如权利要求4所述的改善肠道健康的产品，其特征在于，所述产品包括益生菌冻干粉、益生菌发酵物和益生菌溶胞物。

6.一种改善肠道健康的益生菌后生元，其特征在于，所述后生元由长双歧杆菌长亚种BN08的发酵培养物制备而成，所述长双歧杆菌长亚种BN08在发酵培养基中发酵获得所述发酵培养物，所述发酵培养基包括按照重量份计的以下组分：黄豆粉35-110份，全脂奶粉15-75份，黄小米粉5-20份，蛋白胨5-20份，橙汁10-30份，葡萄糖5-80份，乳糖20-80份。

7.如权利要求6所述的改善肠道健康的益生菌后生元，其特征在于，所述后生元为肠溶软胶囊，所述软胶囊的制备原料包括明胶和甘油；所述肠溶软胶囊经过甲醛浸渍。

8.如权利要求7所述的改善肠道健康的益生菌后生元，其特征在于，所述甲醛的浓度为2~4%。

9.如权利要求6-8任一项所述的改善肠道健康的益生菌后生元的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：所述长双歧杆菌长亚种BN08在所述发酵培养基中发酵，发酵菌液通过中空纤维膜滤出滤液，用所述发酵培养基反向冲刷中空纤维膜进行再次发酵，循环至少2次；离心、过滤、取沉淀得到菌体；菌体进行溶胞、冻干后，制备肠溶软胶囊，所述肠溶软胶囊经过甲醛浸渍后，干燥，即得。

10.如权利要求9所述的改善肠道健康的益生菌后生元的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）培养基制备：

培养基A：称取葡萄糖18~23g、蛋白胨8~12g、牛肉膏5~10 g、酵母粉2~6g、Tween80 0.5~3 mL、磷酸氢二钾1~4g、硫酸镁 0.1~0.5 g、硫酸锰 0.02~0.08 g、柠檬酸铵 1.0~3.0 g、乙酸钠 3.0~7.0 g，加入蒸馏水搅拌溶解，定容，调节pH至6~7，120~122℃灭菌18~23min，冷却至35~39℃，即得培养基A；

培养基D：称取黄豆粉35-110 g、全脂奶粉15-75 g、黄小米粉5-20 g、蛋白胨5-20 g、橙汁10-30 g、葡萄糖5-80 g、乳糖20-80 g、乙酸钠0.3~0.8g、MgSO₄·7H₂O 0.1~ 0.4g、MnSO₄·4H₂O 0.01~0.05g、FeSO₄·7H₂O 0.01~0.05g、NaCl 0.01~0.05g、ZnSO₄·7H₂O 0.1~0.5g，加入蒸馏水搅拌溶解，定容，调节pH至6~7，120~122℃灭菌18~23min，冷却至35~39℃，即得培养基D；