CN117736288A - GmRGA在调控大豆衰老中的应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了GmRGA在调控大豆衰老中的应用。本发明公开的GmRGA为GmRGAb和/或GmRGAa蛋白质，GmRGAb蛋白质为氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质，GmRGAa蛋白质为氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质。实验证明，通过CRISPR‑Cas9系统对大豆内源GmRGAa或/和GmRGAb的基因进行敲除，基因敲除大豆植株的叶片衰老与野生型相比显著加快，GmRGAb基因的过表达具有抑制大豆叶片衰老的趋势。本发明对大豆优势品种的选育及种质资源的开发具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，GmRGA在调控大豆衰老中的应用。
背景技术
叶片衰老，作为叶片生长发育的最后一个阶段，涉及包括染色质和转录调控、转录后调控、翻译和翻译后调控等多层次的精细调控。叶龄、植物激素和环境胁迫等外界环境因素和内源因素共同调控着叶片衰老的发生和进程。植物通过叶片衰老过程完成营养物质的再分配，将营养物质由衰老的叶片转移至幼嫩的叶片和种子中。对农作物而言，叶片衰老性状会显著影响农作物的光合效率和抗逆性，进而影响农作物的产量。因此改良农作物的叶片衰老性状有助于提高大豆的产量。
DELLA蛋白是赤霉素信号通路中的负调控因子，抑制植物的生长和发育。DELLA蛋白在植物的整个生命周期中都起着重要作用，例如调控种子萌发、茎秆伸长、花器官的发育和果实的成熟。模式植物拟南芥中含有5个DELLA蛋白GAI、RGA、RGL1、RGL2和RGL3。通过生物信息学分析发现，大豆中含有两个拟南芥中RGA的同源基因GmRGAa(Glyma.05G140400)和GmRGAb(Glyma.08G095800)。其中，GmRGAa的基因组序列长度为1572bp，GmRGAb的基因组序列长度为1554bp，并且GmRGAa和GmRGAb基因编码的蛋白都含有DELLA蛋白中保守的DELLA氨基酸基序。大豆中GmRGAs蛋白调控叶片衰老的功能尚未报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物叶片的衰老。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了GmRGA蛋白质或调控所述GmRGA蛋白质含量或活性的物质的下述任一应用：
D1)调控植物衰老；
D2)制备调控植物衰老产品；
所述蛋白质来源于大豆(Glycine max(L.)Merr.)，其为GmRGAb蛋白质和/或GmRGAa蛋白质，所述GmRGAb蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
A2)将序列表中SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述GmRGAa蛋白质为如下B1)、B2)或B3)：
B1)氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；
B2)将序列表中SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
B3)在B1)或B2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
上述A2)中的蛋白质，为与SEQ ID No.4或SEQ ID No.3所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。
上述A2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A2)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.2或SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，SEQ ID No.2所示的DNA分子编码SEQ ID No.4所示的GmRGAb蛋白质，SEQ ID No.1所示的DNA分子编码SEQ IDNo.3所示的GmRGAa蛋白质。
A3)中所述标签可为Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tag II、c-myc等。
上述应用中，所述调控植物衰老可为抑制植物衰老，所述调控所述GmRGA蛋白质含量或活性的物质可为抑制所述GmRGA蛋白质含量或活性的物质。
所述调控植物衰老可为促进植物衰老，所述调控所述GmRGA蛋白质含量或活性的物质可为提高所述GmRGA蛋白质含量或活性的物质。
上述应用中，所述调控所述GmRGA蛋白质含量或活性的物质可为调控所述GmRGAb蛋白质含量或活性的物质和/或调控所述GmRGAa蛋白质含量或活性的物质。
上述应用中，所述调控所述GmRGAb蛋白质含量或活性的物质可为下述E1)至E9)中的任一种：
E1)编码所述GmRGAb蛋白质的核酸分子；
E2)含有E1)所述核酸分子的表达盒；
E3)含有E1)所述核酸分子的重组载体、或含有E2)所述表达盒的重组载体；
E4)含有E1)所述核酸分子的重组微生物、或含有E2)所述表达盒的重组微生物、或含有E3)所述重组载体的重组微生物；
E5)含有E1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有E2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
E6)含有E1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有E2)所述表达盒的转基因植物组织；
E7)含有E1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有E2)所述表达盒的转基因植物器官；
E8)降低所述GmRGAb蛋白质含量的核酸分子；
E9)含有E8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官；
所述调控所述GmRGAa蛋白质含量或活性的物质为下述F1)至F9)中的任一种：
F1)编码所述GmRGAa蛋白质的核酸分子；
F2)含有F1)所述核酸分子的表达盒；
F3)含有F1)所述核酸分子的重组载体、或含有F2)所述表达盒的重组载体；
F4)含有F1)所述核酸分子的重组微生物、或含有F2)所述表达盒的重组微生物、或含有F3)所述重组载体的重组微生物；
F5)含有F1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有F2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
F6)含有F1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有F2)所述表达盒的转基因植物组织；
F7)含有F1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有F2)所述表达盒的转基因植物器官；
F8)降低所述GmRGAa蛋白质含量的核酸分子；
F9)含有F8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。
上述应用中，E1)所述核酸分子可为如下e11)或e12)或e13)或e14)：
e11)编码序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA分子；
e12)序列表中SEQ ID No.2所示的DNA分子；
e13)序列表中SEQ ID No.8所示的DNA分子；
e14)与e11)或e12)或e13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述GmRGAb蛋白质的DNA分子；
e15)在严格条件下与e11)或e12)或e13)或e14)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述GmRGAb蛋白质的DNA分子；
F1)所述核酸分子可为如下f11)或f12)或f13)或f14)：
f11)编码序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA分子；
f12)序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；
f13)序列表中SEQ ID No.7所示的DNA分子；
f14)与f11)或f12)或f13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述GmRGAa蛋白质的DNA分子；
f15)在严格条件下与f11)或f12)或f13)或f14)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述GmRGAa蛋白质的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GmRGA蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的GmRGA蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GmRGA蛋白质且具有GmRGA蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％ SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％ SDS和1×SSC,0.1％ SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％ SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％ SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述应用中，B2)所述的含有编码GmRGA蛋白质的核酸分子的表达盒(GmRGA基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GmRGA蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动GmRGA基因转录的启动子，还可包括终止GmRGA基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述GmRGA基因表达盒的重组载体。
上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为JRH0641-Flag载体。
B3)所述重组载体具体可为JRH0641-Flag-GmRGAb。所述JRH0641-Flag-GmRGAb为在JRH0641-Flag载体中插入替换为SEQ ID NO.2的第1-1551位所示的DNA片段得到的重组载体。JRH0641-Flag-GmRGAb含有SEQ ID NO.2所示的GmRGAb基因，能表达GmRGAb蛋白质(SEQ ID NO.4)的N端融合3Flag的融合蛋白质。
B9)所述重组载体可为利用crisper/cas9系统制备的可以降低GmRGA含量的重组载体。所述重组载体可表达靶向B1)所述核酸分子的sgRNA。所述sgRNA的靶序列为GmRGAb基因或GmRGAa基因。B9)所述重组载体可为Gmrgaa-1(Gmrgaa-gRNA1/2)重组载体或Gmrgab-2(Gmrgab-gRNA3/4)重组载体，Gmrgaa-1(Gmrgaa-gRNA1/2)重组载体是在pCas9-AtU6-sgRNA载体的限制性内切酶StuI和XbaI的识别序列之间插入序列表中SEQ ID No.5的第7-840位所示的DNA片段得到的重组质粒；Gmrgab-2(Gmrgab-gRNA3/4)重组载体是在pCas9-AtU6-sgRNA载体的限制性内切酶StuI和XbaI的识别序列之间插入序列表中SEQ IDNo.6的第7-840位所示的DNA片段得到的重组质粒。
上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如发根农杆菌K599或农杆菌EHA105。
上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
上述应用中，所述植物衰老可为植物叶片衰老。
所述植物可为M1)-M5)中的任一种：
M1)双子叶植物或单子叶植物；
M2)豆目植物；
M3)豆科植物；
M4)大豆属植物；
M5)大豆。
7.下述任一方法：
X1)提高植物衰老抗性的方法，包括：使受体植物中表达所述GmRGA蛋白质，或提高受体植物中所述GmRGA蛋白质的含量或活性，得到与所述受体植物相比衰老抗性提高的目的植物，实现植物衰老抗性的提高；
X2)培育抗衰老植物的方法，包括：使受体植物中表达所述GmRGA蛋白质，或提高受体植物中所述GmRGA蛋白质的含量或活性，得到与所述受体植物相比衰老抗性提高的目的植物；
X3)降低植物衰老抗性的方法，包括：降低受体植物中所述GmRGA蛋白质的含量或活性，或敲除受体植物中所述GmRGA蛋白质的编码基因，得到与所述受体植物相比衰老抗性降低的目的植物，实现植物衰老抗性的降低；
X4)培育易衰老植物的方法，包括：降低受体植物中所述GmRGA蛋白质的含量或活性，或敲除受体植物中所述GmRGA蛋白质的编码基因，得到与所述受体植物相比衰老抗性降低的目的植物。
其中，X1)与X2)所述方法可通过将所述GmRGA蛋白质的编码基因导入所述受体植物中实现；
X3)与X4)所述方法可通过利用CRISPR-Cas9系统敲除所述受体植物中所述GmRGA蛋白质的编码基因实现。
具体的，X1)与X2)所述方法可通过将B3)所述重组载体导入所述受体植物中实现。
X3)与X4)所述方法通过向所述受体植物中导入所述Gmrgaa-1(Gmrgaa-gRNA1/2)重组载体和/或所述Gmrgab-2(Gmrgab-gRNA3/4)重组载体实现。
X3)与X4)所述目的植物也可通过将GmRGAb基因发生编辑的植物与GmRGAa基因发生编辑的植物杂交得到。
在本发明的一个实施例中，X3)与X4)所述目的植物缺失序列表中序列1的第305-309位的核苷酸“AGGAG”与缺失序列表中序列2的第456-499位的44个核苷酸“GAACGGGATCCGCCTCGTGCACAGCCTCATGGCGTGCGCGGAGG”实现。
上述方法中，所述植物衰老可为植物叶片衰老。
所述植物可为M1)-M5)中的任一种：
M1)双子叶植物或单子叶植物；
M2)豆目植物；
M3)豆科植物；
M4)大豆属植物；
M5)大豆。
所述目的植物理解为不仅包含GmRGA蛋白或其编码基因被改变的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
所述GmRGA蛋白质或所述调控所述GmRGA蛋白质含量或活性的物质，也属于本发明的保护范围。
本发明从大豆品种天隆一号克隆两个调控叶片衰老的基因GmRGAa或/和GmRGAb的cDNA片段，通过序列分析设计GmRGAa和GmRGAb单基因敲除靶位点引物序列，通过CRISPR-Cas9载体对大豆内源GmRGAa或/和GmRGAb的基因进行敲除，基因敲除大豆植株的叶片衰老与对照相比显著加快。GmRGAb基因的过表达具有抑制大豆叶片衰老的趋势。本发明对大豆优势品种的选育及种质资源的开发具有重要意义。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
附图说明
图1为GmRGAs基因抑制大豆叶片衰老。A.GmRGAa和GmRGAb的基因结构示意图及其突变体的编辑方式。方框内的是PAM序列，实心箭头表示Cas9蛋白在大豆基因组上的切割位点。B.野生型和Gmrgas突变体Gmrga-1和Gmrgab-1中GmRGAa和GmRGAb蛋白氨基酸序列对比，*表示转录提前终止，方框内的是PAM序列。C.野生型和GmRGAs突变体的叶片衰老表型。将材料种植于温室长日照条件(16h光照/8h黑暗)，在植株生长的第25天进行表型记录。标尺为5cm。D.野生型和GmRGAs突变体植株在不同生长时期叶片中叶绿素含量变化。**表示在0.01水平差异显著。E.野生型和GmRGAs突变体植株在播种后15天的子叶衰老指数。NS表示未发生衰老，ES表示处于衰老的前期阶段，LS表示处于衰老的后期阶段。F.野生型和GmRGAs突变体植株在播种后25天的叶片衰老指数。NS表示未发生衰老，ES表示处于衰老的前期阶段，LS表示处于衰老的后期阶段。G.野生型和GmRGAs突变体植株叶片中衰老标记基因GmSAG12的表达水平。在叶片发育的第25天对叶片中衰老基因的表达量进行测定。P值由双尾T测验计算获得。
图2为野生型、Gmrgas-dm突变体和GmRGAb过表达材料的田间表型。A.GmRGAb过表达载体的结构示意图。B.荧光定量PCR检测野生型和GmRGAb过表达株系中GmRGAb的基因表达量。*表示在0.05水平差异显著，**表示在0.01水平差异显著。C.利用蛋白免疫沉淀检测过表达株系中Flag-GmRGAb融合蛋白的表达。D.野生型、Gmrgas-dm突变体和GmRGAb过表达材料的叶片衰老表型。大豆按照小区行距50cm株距20cm种植于自然条件下在生长发育的第97天拍照记录田间条件下的叶片衰老表型。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置至少三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
本发明实施例中大豆Willimas 82品种已记载于文献“Schmutz,J.,Cannon,S.B.,Schlueter,J.,Ma,J.,Mitros,T.,Nelson,W.,…Jackson,S.A.(2010).Genome sequenceof the palaeopolyploid soybean.Nature,463(7278),178–183.”中，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
本发明实施例中CRISPR-Cas9载体pCas9-AtU6-sgRNA载体已记载于文献“Li,C.etal.A domestication-associated gene GmPRR3b regulates the circadian clock andflowering time in soybean.Mol Plant 13,745–759(2020)”中，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
本发明实施例中JRH0641-Flag载体已记载于文献“Qin C et al.GmEID1modulates light signaling through the Evening Complex to control floweringtime and yield in soybean.Proc Natl Acad Sci U S A.120；15:e2212468120,2023.”中，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
本发明实施例中大豆品种天隆一号已记载于文献“Li,C.et al.Adomestication-associated gene GmPRR3b regulates the circadian clock andflowering time in soybean.Mol Plant 13,745–759(2020)”中，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
本发明实施例中JRH0951载体已记载于文献“Li,C.et al.A domestication-associated gene GmPRR3b regulates the circadian clock and flowering time insoybean.Mol Plant 13,745–759(2020)”中，公众可以中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
本发明中使用的引物序列如下表1。
表1、本发明中的引物序列信息
| 序列名称 | 序列5’-3’ | 用途 |
| U6-StuI-F | 5’-TAGATCGGAAGCTTAGGCCTAAAATAAATGGTAAAATGTC-3’ | 构建U6启动子 |
| U6-EcoRI-F | 5’-TCTCGAATTCGAGACCAAAATAAATGGTAAAATGTCAA-3’ | 构建U6启动子 |
| U6-R | 5’-CAATCCATGTGGTGGCACAT-3’ | 构建U6启动子 |
| gRNA-EcoRI-R | 5’-TCTCGAATTCGAGACCAAAAAAAGCACCGACTCGGTGC-3’ | 构建gRNA序列 |
| gRNA-Xbal-R | 5’-GCTCGGCAACGCGTTCTAGAAAAAAAAGCACCGACTCGGT-3’ | 构建gRNA序列 |
| 0645-T-F | 5’-ACATTTAATACGCGATAGAAAAC-3’ | 载体鉴定 |
| 0645-T-R | 5’-TGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAA-3’ | 载体鉴定 |
| JRH0912-Basta-CF | 5’-TCCGCAGCCATTAACGACTT-3’ | 植物鉴定 |
| JRH0912-Basta-CR | 5’-ACAGATAAAGCCACGCACATT-3’ | 植物鉴定 |
| JRH0912-CAS9-CF | 5’-CAGCTCGTCCAAACCTAC-3’ | 植物鉴定 |
| JRH0912-CAS9-CR | 5’-CTGTGCCATCCATCTTCT-3’ | 植物鉴定 |
| JRH0912-GmU6-CF | 5’-GCGGTGTCATCTATGTTACTA-3’ | 植物鉴定 |
| JRH0912-GmU6-CR | 5’-TTCAAGTTGATAACGGACTA-3’ | 植物鉴定 |
| a-gRNA1/2-F | 5’-GCAGTGGTGGGTTACAAGGT-3’ | 检测GmRGAa-gRNA1/2位点 |
| a-gRNA1/2-R | 5’-CACTACCACCTCCATAGATTGCT-3’ | 检测GmRGAa-gRNA1/2位点 |
| b-gRNA3/4-F | 5’-GTGGCGCAGAAGCTTGAGCG-3’ | 检测GmRGAb-gRNA3/4位点 |
| b-gRNA3/4-R | 5’-GTGCGAACTTGAGGTATGGACAG-3’ | 检测GmRGAb-gRNA3/4位点 |
实施例1、GmRGAs可以调控大豆叶片的衰老
本实施例发现了大豆的GmRGAs基因(GmRGAa与GmRGAb)可以调控大豆叶片的衰老，在大豆品种Willimas 82中，GmRGAa基因的CDS序列如SEQ ID No.1所示，编码SEQ ID No.3所示的GmRGAa蛋白质；GmRGAb基因的CDS序列如SEQ ID No.2所示，编码SEQ ID No.4所示的GmRGAb蛋白质。
一、GmRGAs单基因敲除载体的构建
通过CRISPRdirect网站(http://crispr.dbcls.jp)分别设计GmRGAa和GmRGAb基因敲除靶位点引物序列，靶位点引物序列分别为：
GmRGAa-gRNA1：
5’-AATGTGCCACCACATGGATTGCTTCTCGGGCTCCTCGGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA-3’；
GmRGAa-gRNA2：
5’-AATGTGCCACCACATGGATTGACGATCTCAAGGCTATTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA-3’；
GmRGAb-gRNA3：
5’-AATGTGCCACCACATGGATTGTCGTTGACTCGCAGGAGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA-3’；
GmRGAb-gRNA4：
5’-AATGTGCCACCACATGGATTGATGGCGTGCGCGGAGGCCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA-3’。
1、U6和gRNA的DNA片段的获得
以JRH0951为模板，利用Primer-F与Primer-R进行PCR扩增，得到U6片段与gRNA的DNA片段。U6片段有两种，分别为U6-StuI与U6-EcoRI，扩增U6-StuI片段时，Primer-F为U6-StuI-F，Primer-R为U6-R；扩增U6-EcoRI片段时，Primer-F为U6-EcoRI-F，Primer-R为U6-R；gRNA的DNA片段有四种，分别为GmRGAa-gRNA1的DNA片段、GmRGAa-gRNA2的DNA片段、GmRGAb-gRNA3的DNA片段、GmRGAb-gRNA4的DNA片段，扩增GmRGAa-gRNA1的DNA片段时，Primer-F为GmRGAa-gRNA1，Primer-R为gRNA-EcoRI-R；扩增GmRGAa-gRNA2的DNA片段时，Primer-F为GmRGAa-gRNA2，Primer-R为gRNA-Xbal-R；扩增GmRGAb-gRNA3的DNA片段时，Primer-F为GmRGAb-gRNA3，Primer-R为gRNA-EcoRI-R；扩增GmRGAb-gRNA4的DNA片段时，Primer-F为GmRGAb-gRNA4，Primer-R为gRNA-Xbal-R。
以U6-StuI片段与GmRGAa-gRNA1的DNA片段为模板，利用U6-StuI-F与gRNA-EcoRI-R进行PCR扩增，得到U6-GmRGAa-gRNA1；以U6-EcoRI片段与GmRGAa-gRNA2的DNA片段为模板，利用U6-EcoRI-F与gRNA-Xbal-R进行PCR扩增，得到U6-GmRGAa-gRNA2；以U6-StuI片段与GmRGAb-gRNA3的DNA片段为模板，利用U6-StuI-F与gRNA-EcoRI-R进行PCR扩增，得到U6-GmRGAb-gRNA3；以U6-EcoRI片段与GmRGAb-gRNA4的DNA片段为模板，利用U6-EcoRI-F与gRNA-Xbal-R进行PCR扩增，得到U6-GmRGAb-gRNA4。
2、GmRGAs基因CRISPR-Cas9重组敲除载体的获得
用限制性内切酶StuI和XbaI双酶切载体CRISPR-Cas9载体pCas9-AtU6-sgRNA，将酶切产物回收得到线性的pCas9-AtU6-sgRNA；利用限制性内切酶StuI和EcoRI双酶切片段U6-GmRGAa-gRNA1，回收大片段；利用限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切片段U6-GmRGAb-gRNA2，回收大片段；连接三种酶切产物，得到GmRGAs基因CRISPR-Cas9重组敲除载体，命名为Gmrgaa-1(GmRGAa-gRNA1/2)；
用限制性内切酶StuI和XbaI双酶切载体CRISPR-Cas9载体pCas9-AtU6-sgRNA，将酶切产物回收得到线性的pCas9-AtU6-sgRNA；利用限制性内切酶StuI和EcoRI双酶切片段U6-GmRGAa-gRNA3，回收大片段；利用限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切片段U6-GmRGAb-gRNA4，回收大片段；连接三种酶切产物，得到GmRGAs基因CRISPR-Cas9重组敲除载体，命名为Gmrgab-1(GmRGAb-gRNA3/4)。
其中，Gmrgaa-1(Gmrgaa-gRNA1/2)重组载体是在pCas9-AtU6-sgRNA载体的限制性内切酶StuI和XbaI的识别序列之间插入序列表中SEQ ID No.5的第7-840位所示的DNA片段得到的重组质粒。
Gmrgab-2(Gmrgab-gRNA3/4)重组载体是在pCas9-AtU6-sgRNA载体的限制性内切酶StuI和XbaI的识别序列之间插入序列表中SEQ ID No.6的第7-840位所示的DNA片段得到的重组质粒。
二、GmRGAb过表达载体的构建
根据大豆Willimas 82参考基因组(phytozome)下载GmRGAb CDS序列，并设计引物，引物设计如下：
GmRGAb-F:GATGACGACAAAGGATCC ATGAAGAGGGAACGCGAG；
GmRGAb-R:CGGTGGCGGTCCGGATCC GCGAGTTGCAGCGAGTTG。
取大豆Williams 82种子，种植在含有营养土中，在长日照下生长7天。取大豆叶片，提取RNA，应用反转录试剂盒合成cDNA，用GmRGAb-F与GmRGAb-R，以反转录产物为模板，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
用限制性内切酶BamHⅠ酶切JRH0641-Flag载体，将所得载体骨架与所得PCR扩增产物利用In-fusion酶进行无缝连接，将得到的序列正确的重组载体记为JRH0641-Flag-GmRGAb。
Flag-GmRGAb重组载体是在JRH0641-Flag载体限制性内切酶BamHⅠ的识别序列之间插入序列为序列表中SEQ ID NO.2的第1-1551位的DNA片段(去掉终止密码子)得到的重组质粒(图2中A)。JRH0641-Flag-GmRGAb含有SEQ ID NO.2所示的GmRGAb基因，能表达GmRGAb蛋白质(SEQ ID NO.4)的N端融合3Flag的融合蛋白质。
三、转基因大豆植株的获得
1、大豆发状根验证重组载体靶位点的工作效率
1.1重组菌的构建
将步骤一构建好的两种CRISPR-Cas9重组载体质粒Gmrgaa-1和Gmrgab-1分别转化K599发根农杆菌(北京庄盟国际生物基因科技有限公司，ZC1506D)感受态中，得到含有Gmrgaa-1和Gmrgab-1重组质粒的K599重组农杆菌，通过大豆发状根验证重组载体的工作效率。
1.2大豆发状根转化
1)挑选干净，无病斑的种子(大豆天隆一号)放在90mm的方皿里，将其放在密闭容器中，使用氯气(100mL花王Bleach+4mL浓盐酸)对种子进行灭菌，16-18h后拿出，超净工作台提前灭菌，在超净工作台将种子中残留的氯气吹净；
2)将灭菌后的大豆种子摆在催芽培养基上，光照培养5天左右；
3)提前2天小摇含有Gmrgaa-1和Gmrgab-1重组载体的K599重组农杆菌，转化前一天分别接种到含有25mL含有相应抗生素的50mL灭过菌的管子中，28℃220rpm过夜培养；
4)取催好芽的豆子，用手术刀片将大豆一分为二，分成两片豆瓣，自下胚轴3-4mm处切除多余下胚轴部分，用刀片在下胚轴子叶节处轻轻划3-5下，0.5mm深，切好后，将豆瓣置于有水的锥形瓶中；
5)待菌液浓度至OD600值至0.6-0.8左右，4000rpm，10min，在超净工作台中去掉上清，尽量去除干净，加入适量共培转化液(B5 Basal Medium(G398)，0.321g；蔗糖Sucrose，30g；乙磺酸MES，3.9g；用超纯水定容到1L。加入1M NaOH调pH至5.4，121℃高温高压灭菌21min。当培养基冷却至60℃左右，加入以下激素和抗生素：硫代硫酸钠Na2S2O3,1mL；L-半胱氨酸L-Cys,4mL；二硫苏糖醇DTT，1mL；乙酰丁香酮AS，1mL；细胞分裂素6-BA，1.67mL；赤霉素GA3，0.25mL；维生素B5 vitamin，1mL)，将菌液重悬，得到侵染液；
6)将切好的大豆子叶放入侵染液中，侵染20-30min左右，期间轻轻摇动几次；
7)将灭过菌的滤纸放在90mm皿以及共培培养基(B5 Basal Medium(G398)，0.321g；蔗糖Sucrose，30g；乙磺酸MES，3.9g；琼脂Agar，7.5g，超纯水定容到1L。加入1MNaOH调pH至5.4，121℃高温高压灭菌21min。当培养基冷却至60℃左右，加入以下激素和抗生素：硫代硫酸钠Na2S2O3,1mL；L-半胱氨酸L-Cys,4mL；二硫苏糖醇DTT，1mL；乙酰丁香酮AS，1mL；细胞分裂素6-BA，1.67mL；赤霉素GA3，0.25mL；维生素B5 vitamin，1mL)上，将侵染过的大豆子叶放在滤纸上吸干侵染液，摆在固体共培培养基上，黑暗培养三天；
8)将已共培三天的豆瓣胚芽和多余下胚轴切除，保留下胚轴3-4mm，置于有诱导液体(B5培养基B5BasalMedium(G398)，3.21g；蔗糖Sucrose，30g；乙磺酸MES，0.59g；超纯水定容到1L。用1MNaOH调pH至5.7，121℃高温高压灭菌21min。当培养基冷却至60℃左右，加入以下激素和抗生素：细胞分裂素6-BA，1.12mL；草胺膦，0.5mL；头孢霉素Cefotaxime，1mL；特美汀Timentin，1mL；万古霉素Vancomycin，1mL；维生素B5vitamin，1mL)的锥形瓶中，洗4-5遍，置于含有滤纸的空培养皿上，吸干水分；
9)将子叶向下插入诱导培养基(B5培养基B5BasalMedium(G398)，3.21g；蔗糖Sucrose，30g；乙磺酸MES，0.59g；琼脂Agar，7.5g；超纯水定容到1L。用1MNaOH调pH至5.7，121℃高温高压灭菌21min。当培养基冷却至60℃左右，加入以下激素和抗生素：细胞分裂素6-BA，1.12mL；草胺膦，0.5mL；头孢霉素Cefotaxime，1mL；特美汀Timentin，1mL；万古霉素Vancomycin，1mL；维生素B5vitamin，1mL)中，子叶切口位于培养基以上培养2周左右，可见发状根出现，取单条发状根剪下，至少三个重复，提取DNA，应用相对应的引物(见引物列表，a-gRNA1/2-F与a-gRNA1/2-R，b-gRNA3/4-F与b-gRNA3/4-R)检测不同gRNA靶位点的编辑效率。GmRGAa基因在大豆Willimas 82的基因组序列为SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，GmRGAb基因在大豆Willimas 82的基因组序列为SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
测序结果显示：所有gRNA靶位点处的碱基均为双峰，表明两种CRISPR-Cas9重组载体Gmrgaa-1和Gmrgab-1能够对靶位点进行有效编辑，可用于大豆遗传转化。
2、大豆子叶节转化
2.1制备重组农杆菌
将上述步骤1中已经验证的两种CRISPR-Cas9重组载体质粒和JRH0641-Flag-GmRGAb转入到EHA105农杆菌感受态中，分别得到重组菌EHA105/Gmrgaa-1、EHA105/Gmrgab-1和EHA105/JRH0641-Flag-GmRGAb，用于大豆遗传转化，-80℃保存。
2.2农杆菌侵染大豆子叶节
1)10mL试管小摇含有Gmrgaa-1、Gmrgab-1和JRH0641-Flag-GmRGAb重组载体的EHA105重组农杆菌过夜；
2)100mL花王漂白水(Bleach)+4mL浓盐酸在密封容器中对无病斑、长势好的大豆种子灭菌16-18h，将大豆置于已灭菌的超净台中30min左右，吹走残留氯气；
3)准备共培固体/液体培养基、水、滤纸和锥形瓶，121℃高温灭菌20min。灭菌水浸泡豆子(晚上10点钟左右，豆子不宜浸泡太久)。同时，用锥形瓶大摇重组EHA105农杆菌100mL以作侵染；
4)将大豆胚根在3-4mm切断，沿两片子叶中间将其分为两瓣，去掉种皮，在子叶节处轻划5-7次，将其放在锥形瓶中备用；
5)待农杆菌OD600＝0.5-0.7时，4000rpm，离心10min，收集菌液，去掉上清液，加入适量共培液体培养基，涡旋混匀，使得菌液OD600＝0.6；
6)弃去锥形瓶中的水，用加入共培液体培养基配制好的菌液，侵染30min左右，侵染期间轻轻几次锥形瓶，增大农杆菌与子叶节处伤口的接触次数；
7)侵染完成后将共培菌液倒掉，将大豆子叶置于无菌滤纸上，将残留菌液吸干，将大豆子叶摆放在一层无菌滤纸的共培固体培养基上，培养箱里暗培养3天；
8)暗培养结束后，将其放在光照培养箱里光照一上午，将伸长的胚芽在子叶节3-5mm处切断，用含有抗生素的无糖诱导培养基充分清洗4-5次，每隔十分钟清洗一次，在清洗期间不断轻轻摇晃，使其充分清洗干净；
9)将清洗后的大豆子叶置于灭菌的滤纸上，吸干水分，将子叶节朝下，倾斜插入诱导培养基中，组培10天；
10)将子叶节长出的大芽切除，在子叶节下部切新的伤口后重新插入到诱导培养基中，诱导培养基继代3次后，长出丛生芽；
11)将长出丛生芽的大豆子叶去除黑色组织以及大部分子叶，将丛生芽插入到伸长培养基(MSB(M519)，4.43g；蔗糖Sucrose，30g；乙磺酸MES，0.59g；琼脂Agar，7.5g，超纯水定容到1L。用1MNaOH调pH至5.7，121℃高温高压灭菌21min。当培养基冷却至60℃左右，加入以下激素和抗生素：赤霉素GA3，0.5mL；生长素IAA，0.1mL；玉米素Zeatin，0.2mL；天冬酰胺Asparagine，1mL；焦谷氨酸L-PyroglutamicAcid，1mL；草胺膦，0.5mL；头孢霉素Cefotaxime，1mL；特美汀Timentin，1mL；万古霉素Vancomycin，1mL；维生素B5vitamin，1mL)中，伸长培养基继代3-4次；
12)在伸长期间丛生芽会伸长，待其伸长到3-5cm时，将丛生芽插入到生根培养基(MS培养基MSB(M519)，2.22g；蔗糖Sucrose，20g；乙磺酸MES；0.59g；琼脂Agar，7.5g，超纯水定容到1L。用1M NaOH调pH至5.6，121℃高温高压灭菌21min。当培养基冷却至60℃左右，加入以下激素和抗生素：生长素IBA，1mL；天冬酰胺Asparagine，1mL；焦谷氨酸L-Pyroglutamic Acid，1mL；头孢霉素Cefotaxime，1mL；特美汀Timentin，1mL；万古霉素Vancomycin，1mL；维生素B5vitamin，1mL)中，光照培养2周后，可以见到根长出，待根部较茂盛，将其移入土中，练苗7-10天，得到T0代转基因阳性苗。
激素、抗生素配制如表2所示。
表2、本发明使用的激素、抗生素配制方法
四、转基因阳性株系的鉴定
为了确定转基因阳性植株，首先对步骤三获得的T0代转基因株系单株的叶片进行basta检测，若叶片变黄枯萎，则为假阳性转基因植株，对抗basta的植株提取DNA，进行PCR检测，检测引物为：a-gRNA1/2-F与a-gRNA1/2-R；b-gRNA3/4-F与b-gRNA3/4-R。对所得PCR产物进行测序，将T0代基因编辑的植株分别自交2代，得到T2代基因编辑的植株。之后按照上述PCR方法检测T2代基因编辑的植株的突变类型。测序结果显示(图1中A)，共获得两个纯合突变体：Gmrgaa-1和Gmrgab-1。Gmrgaa-1和Gmrgab-1杂交获得Gmrgas-dm。
Gmrgaa-1与野生型大豆天隆一号相比，对于GmRGAa基因，2条同源染色体中GmRGAa基因均发生了如下突变：GmRGAa基因中的“5’-CCCTCTCCCCTCCGAGGAGCCCGAGAAGGACTCCGCCTCG-3’”(对应于SEQ ID No.1的第291-330位，SEQ ID No.7的第383-422位)突变为“5’-CCCTCTCCCCTCCGCCCGAGAAGGACTCCGCCTCG-3’”。该突变导致序列表中序列1的第305-309位的核苷酸“AGGAG”缺失，该核苷酸的缺失引起了移码，导致翻译提前终止，造成GmRGAa蛋白功能缺失，从而将GmRGAa基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图1中A与B。
Gmrgab-1与野生型大豆天隆一号相比，对于GmRGAb基因，2条同源染色体中GmRGAb基因均发生了如下突变：GmRGAb基因中的“5’-GCAGGAGAACGGGATCCGCCTCGTGCACAGCCTCATGGCGTGCGCGGAGGCCGTGG-3’”(对应于SEQ ID No.2的第450-505位，SEQ ID No.8的第566-621位)突变为“5’-GCAGGACCGTGG-3’”。该突变使序列表中序列2的第456-499位的44个核苷酸“GAACGGGATCCGCCTCGTGCACAGCCTCATGGCGTGCGCGGAGG”的缺失，该核苷酸的缺失引起了移码，导致翻译提前终止，造成GmRGAb蛋白功能缺失，从而将GmRGAb基因敲除，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图1中A与B。
Gmrgas-dm是由Gmrgaa-1和Gmrgab-1植株杂交而来，将杂交后代继续自交3代，通过一代测序获得了GmRGAa和GmRGAb均发生突变的纯合突变体。该GmRGAa基因突变同Gmrgaa-1植株一致，GmRGAb基因突变同Gmrgab-1植株，该突变位点及其周边核苷酸的测序结果见图1中A。
以上Gmrgaa-1和Gmrgab-1突变体基因结构图如图1中A所示，
为了确定GmRGAb过表达阳性植株，对步骤三的T0代转基因株系单株的叶片进行basta检测，若叶片变黄枯萎，则为假阳性转基因植株，对获得的两株阳性转基因植株(GmRGAb-OE-1、GmRGAb-OE-2)利用蛋白免疫印迹与荧光定量PCR检测GmRGAb基因表达量，检测结果如图2中B和C所示。蛋白免疫印迹所用抗体为Flag抗体(anti-Flag(Abmart，货号M20008L)，利用丽春红溶液(Biosharp，BL519A)进行染色作为蛋白内参。荧光定量PCR所用引物为GmRGAb-qF:TTCTACGAAACCTGTCCATACC和GmRGAb-qR:TACCGAAATCAATCACGTGAAC；以GmActin为内参，内参的引物为GmActin-qF:CGGTGGTTCTATCTTGGCATC和GmActin-qF:GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA。结果发现：与野生型大豆天隆一号(WT)相比，GmRGAb的表达量在过表达株系GmRGAb-OE-1和GmRGAb-OE-2中均有显著地提高，并且可以检测到Flag-GmRGAb融合蛋白的表达。
五、GmRGAs基因敲除突变体植株和过表达植株表型鉴定
1、GmRGAs基因敲除突变体植株表型
将步骤四中得到的GmRGAs基因的纯合突变体(Gmrgaa-1、Gmrgab-1、Gmrgas-dm)单株种子和野生型大豆品种天隆一号(简称WT)种子于人工自然长日照(16h光照/8h黑暗)温室种植，对叶片衰老表型进行观察，统计用材料实验重复3次，每次每个株系测定3株以上。
通过表型观察，结果如图1中C-G所示，与野生型相比，Gmrgaa-1和Gmrgab-1单基因突变体的叶片衰老程度与野生型没有显著差异，而GmRGAs双基因突变体叶片呈现出明显的早衰表型。
从播种10天开始，每5天去叶片测定叶绿素含量，结果显示，在播种后的第25天，Gmrgas-dm突变体单叶中的叶绿素含量显著低于野生型和Gmrgaa-1和Gmrgab-1单基因突变体(图1中D)。叶绿素含量测定：取新鲜的叶片0.2g用锡箔纸包裹迅速放到液氮中冷冻保存，用预冷的研钵加入液氮将叶片充分研磨，然后加入20mL 80％丙酮充分混合均匀，在黑暗条件下-20℃静置1小时。将样品在低温离心机4℃，12,800g离心3分钟，吸取1mL上清至比色皿中分别测定663nm和645nm波长的吸光值。叶绿素测定的公式如下：
叶绿素含量＝(20.2A645+8.02A663)mg/g。
子叶与叶片衰老指数的测定：在播种后15天和25天分别测定子叶和叶片衰老指数。NS表示子叶和叶片未发生衰老；ES表示处于子叶和叶片衰老的早期阶段，表现为子叶和叶片发生黄化的面积少于总面积的25％；LS表示处于子叶和叶片的后期阶段，表现为子叶和叶片发生黄化的面积大于总面积的60％；子叶和大豆单叶的总数量为20，不同衰老类型的子叶或单叶数量占总数量的比例，即为子叶或叶片衰老指数。结果如图1中E与F所示，结果显示，Gmrgas-dm突变体的子叶衰老指数与叶片衰老指数均显著高于野生型、Gmrgaa-1和Gmrgab-1突变体。
检测各突变体中衰老标记基因GmSAG12的表达水平，结果显示，Gmrgas-dm突变体单叶中衰老标记基因GmSAG12显著高于野生型和Gmrgaa-1和Gmrgab-1单基因突变体(图1中G)。检测GmSAG12的引物为GmSAG12-qF:GGGAGTAAAGTGGGGTGATAAA和GmSAG12-qR:TAAGAAGCCAACATTGCTATGC；以GmActin为内参，内参的引物为GmActin-qF:CGGTGGTTCTATCTTGGCATC和GmActin-qF:GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA。
以上结果表明GmRGAa和GmRGAb共同调控大豆叶片衰老，并且在调控叶片衰老过程中存在功能冗余。
2、过表达植株表型
将步骤四中得到的GmRGAs基因的纯合突变体单株、阳性转基因植株和野生型大豆品种天隆一号(简称WT)种子于北京(40°13'28”N，116°33'37”E)夏播，观察其叶片衰老表型。
通过田间表型观察，结果如图2中D所示，与野生型相比，Gmrgas-dm突变体叶片具有明显的早衰趋势，而GmRGAb过表达材料GmRGAb-OE-1叶片呈现出明显晚衰的趋势。由此说明，GmRGAs蛋白的缺失会导致植株叶片早衰，调控GmRGAs的蛋白丰度能够有效地改良植株的叶片衰老性状。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.GmRGA蛋白质或调控所述GmRGA蛋白质含量或活性的物质的下述任一应用：
D1)调控植物衰老；
D2)制备调控植物衰老产品；
所述蛋白质为GmRGAb蛋白质和/或GmRGAa蛋白质，所述GmRGAb蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
A2)将序列表中SEQ ID No.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述GmRGAa蛋白质为如下B1)、B2)或B3)：
B1)氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；
B2)将序列表中SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
B3)在B1)或B2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控植物衰老为抑制植物衰老，所述调控所述GmRGA蛋白质含量或活性的物质为抑制所述GmRGA蛋白质含量或活性的物质；
所述调控植物衰老为促进植物衰老，所述调控所述GmRGA蛋白质含量或活性的物质为提高所述GmRGA蛋白质含量或活性的物质。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述调控所述GmRGA蛋白质含量或活性的物质为调控所述GmRGAb蛋白质含量或活性的物质和/或调控所述GmRGAa蛋白质含量或活性的物质。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述调控所述GmRGAb蛋白质含量或活性的物质为下述E1)至E9)中的任一种：
E1)编码所述GmRGAb蛋白质的核酸分子；
E2)含有E1)所述核酸分子的表达盒；
E3)含有E1)所述核酸分子的重组载体、或含有E2)所述表达盒的重组载体；
E4)含有E1)所述核酸分子的重组微生物、或含有E2)所述表达盒的重组微生物、或含有E3)所述重组载体的重组微生物；
E5)含有E1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有E2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
E6)含有E1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有E2)所述表达盒的转基因植物组织；
E7)含有E1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有E2)所述表达盒的转基因植物器官；
E8)降低所述GmRGAb蛋白质含量的核酸分子；
E9)含有E8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官；
所述调控所述GmRGAa蛋白质含量或活性的物质为下述F1)至F9)中的任一种：
F1)编码所述GmRGAa蛋白质的核酸分子；
F2)含有F1)所述核酸分子的表达盒；
F3)含有F1)所述核酸分子的重组载体、或含有F2)所述表达盒的重组载体；
F4)含有F1)所述核酸分子的重组微生物、或含有F2)所述表达盒的重组微生物、或含有F3)所述重组载体的重组微生物；
F5)含有F1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有F2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
F6)含有F1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有F2)所述表达盒的转基因植物组织；
F7)含有F1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有F2)所述表达盒的转基因植物器官；
F8)降低所述GmRGAa蛋白质含量的核酸分子；
F9)含有F8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：E1)所述核酸分子为如下e11)或e12)或e13)或e14)：
e11)编码序列是序列表中SEQ ID No.2的DNA分子；
e12)序列表中SEQ ID No.2所示的DNA分子；
e13)序列表中SEQ ID No.8所示的DNA分子；
e14)与e11)或e12)或e13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述GmRGAb蛋白质的DNA分子；
e15)在严格条件下与e11)或e12)或e13)或e14)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述GmRGAb蛋白质的DNA分子；
F1)所述核酸分子为如下f11)或f12)或f13)或f14)：
f11)编码序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA分子；
f12)序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；
f13)序列表中SEQ ID No.7所示的DNA分子；
f14)与f11)或f12)或f13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述GmRGAa蛋白质的DNA分子；
f15)在严格条件下与f11)或f12)或f13)或f14)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述GmRGAa蛋白质的DNA分子。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述植物衰老为植物叶片衰老；
和/或，所述植物为M1)-M5)中的任一种：
M1)双子叶植物或单子叶植物；
M2)豆目植物；
M3)豆科植物；
M4)大豆属植物；
M5)大豆。
7.下述任一方法：
X1)提高植物衰老抗性的方法，包括：使受体植物中表达权利要求1中所述GmRGA蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述GmRGA蛋白质的含量或活性，得到与所述受体植物相比衰老抗性提高的目的植物，实现植物衰老抗性的提高；
X2)培育抗衰老植物的方法，包括：使受体植物中表达权利要求1中所述GmRGA蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述GmRGA蛋白质的含量或活性，得到与所述受体植物相比衰老抗性提高的目的植物；
X3)降低植物衰老抗性的方法，包括：降低受体植物中权利要求1中所述GmRGA蛋白质的含量或活性，或敲除受体植物中权利要求1中所述GmRGA蛋白质的编码基因，得到与所述受体植物相比衰老抗性降低的目的植物，实现植物衰老抗性的降低；
X4)培育易衰老植物的方法，包括：降低受体植物中权利要求1中所述GmRGA蛋白质的含量或活性，或敲除受体植物中权利要求1中所述GmRGA蛋白质的编码基因，得到与所述受体植物相比衰老抗性降低的目的植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：X1)与X2)所述方法通过将所述GmRGA蛋白质的编码基因导入所述受体植物中实现；
X3)与X4)所述方法通过利用CRISPR-Cas9系统敲除所述受体植物中所述GmRGA蛋白质的编码基因实现。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述衰老为叶片衰老；
和/或，所述植物为M1)-M5)中的任一种：
M1)双子叶植物或单子叶植物；
M2)豆目植物；
M3)豆科植物；
M4)大豆属植物；
M5)大豆。
10.权利要求1-5中任一所述GmRGA蛋白质或所述调控所述GmRGA蛋白质含量或活性的物质。
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