CN117731006A - 一种石榴酸-植物多酚复合物及制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种石榴酸‑植物多酚复合物及其制备方法与应用。所述制备方法具体为：将植物多酚溶液与石榴酸溶液进行混合，在温度为10～30℃的酸性缓冲盐溶液条件下，反应0.5～1h，获得石榴酸‑植物多酚复合物溶液；其中，石榴酸与植物多酚的质量比为4：1～1：4。采用本发明方法制备的石榴酸‑植物多酚复合物，具有较好的抗氧化能力，石榴酸的稳定性和生物可及性显著提高。植物多酚可以保护石榴酸免受自由基的氧化降解，并促进人体对石榴酸的吸收。为石榴酸在医药和特膳食品领域进一步发展和应用，提供理论及技术上的支持与引导。
Description
技术领域
本发明属于石榴酸的复合物，具体涉及一种石榴酸-植物多酚复合物及制备方法与应用。
背景技术
石榴酸(Punicic acid)是一种特定的三烯脂肪酸，是补充人体缺乏w-3系列不饱和脂肪酸的理想成分。石榴籽油含有80％的石榴酸，目前是这种脂肪酸的主要天然来源。石榴酸已被证明具有抵抗癌症、糖尿病、肥胖和炎症等多种生物活性。石榴酸是一种十八碳三烯酸，存在三个共轭双键，是共轭亚麻酸的一种。由于石榴酸的共轭三烯结构，其性质极为活泼，容易被氧化，因此难以被人体充分的吸收与利用。
天然的植物多酚是结构多样的生物小分子，是石榴皮中一类主要的生物活性物质，具有多种生物活性，如抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、神经保护和降血脂活性等。多酚可以参与脂质过氧化反应以阻止脂质过氧化过程。通过萃取石榴籽油，采用冷冻结晶法得到高纯度石榴酸，在溶液中与植物多酚通过非共价相互作用形成石榴酸-植物多酚复合物，以此提高石榴酸的稳定性并促进肠道对石榴酸的吸收。
目前，利用植物多酚来提高石榴酸的稳定性，增强石榴酸的生物可及性的技术在国内外还尚无报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种石榴酸-植物多酚复合物及其制备方法，具体涉及一种提高石榴酸稳定性及增强其吸收率的方法及其制备方法制得的石榴酸-植物多酚复合物。本发明提供的制备方法不仅可以提高石榴酸的稳定性，还可以增强小肠对其的吸收利用。其中，提高石榴酸的稳定性可保持其清除自由基的能力；还属于增加小肠的吸收，属于功能活性脂肪酸的保护技术。
本发明所提供的一种提高石榴酸稳定性及生物可及性的方法，即一种石榴酸-植物多酚复合物的制备方法具体为：将石榴酸溶液与植物多酚溶液进行混合，在温度为10～30℃的弱酸性条件下，反应0.5～1.0h，获得石榴酸-植物多酚复合物溶液；
其中，石榴酸与植物多酚的质量比为4：1～1：4。
该质量比具体指反应过程中，所述石榴酸溶液和植物多酚溶液中的石榴酸与植物多酚的质量比。
其中，所述石榴酸溶液与植物多酚溶液的溶剂可为水或酸性缓冲盐溶液。
优选的，所获得石榴酸-植物多酚复合物溶液还可以进一步冻干制成石榴酸-植物多酚复合物粉末进行储存。
本发明提供一种提高石榴酸、增强其生物可及性的方法以石榴皮中含量最高的活性物质多酚为载体，可以显著提高其稳定性和生物可及性。通过植物多酚对石榴酸的物理吸附及非共价相互作用，形成的复合物可以有效保护石榴酸在储存和加工过程中免受自由基诱发的氧化，并极大地增强了肠道对石榴酸的吸收效率，可以将其用于特膳食品和医药等领域中。
其中，所述石榴酸采用如下方法制得：采用有机溶剂从石榴籽中萃取石榴籽油，碱法提取混合脂肪酸。
优选的，将0.5g混合脂肪酸，通过有机溶剂冷冻结晶法富集石榴酸。
其中，石榴酸具体采用如下方法制得：采用石榴籽，粉碎、过筛，得到石榴籽粉；将石榴籽粉与正己烷混合，得到石榴籽油，采用碱法提取混合脂肪酸，然后纯化获得石榴酸。
优选的，具体采用如下方式：
1、取无霉变的石榴籽，烘干后置于-18℃储藏后用粉碎机粉碎；
2、将粉碎后的石榴籽过40目筛，得到石榴籽粉，将石榴籽粉与正己烷混合，超声后取上清液，重复三次，旋转蒸发后得到石榴籽油；
3、以1：10的比例加入2.0mol/L KOH-甲醇溶液，用正己烷萃取，得到混合脂肪酸；
4、采用冷冻结晶法获得高纯度石榴酸。
优选的，冷冻结晶法的冷冻温度为-20℃，冷冻时间24h，料液比1：8。
优选的，所述石榴酸溶液的浓度为0.1～10.0mg/mL。
本发明进一步提出的，所述植物多酚分别为芦丁、山奈酚、鞣花酸和安石榴苷；优选为安石榴苷、芦丁和山奈酚；最优选为安石榴苷。
本发明进一步提出的，所述植物多酚溶液的浓度为0.5～4.0mg/mL；优选为1.0～3.0mg/mL；最优选为2.0mg/mL。
本发明进一步提出的，所述石榴酸溶液的浓度为0.1～10.0mg/mL；优选为0.5～8.0mg/mL；最优选为0.5mg/mL。
本发明进一步提出的，所述反应的温度为室温；如10～30℃，尤其优选为25℃。
本发明进一步提出的，所述反应的pH值为5.5～6.5；优选为5.0～6.0。本发明优选在弱酸条件下进行反应。
本发明提供的制备方法中，除了优化反应浓度和反应条件外，发现当加入的石榴酸与植物多酚的质量比为1：4时，所获得的石榴酸-植物多酚复合物的效果尤其显著。在清除自由基实验中，该质量比制得的石榴酸-植物多酚糖复合物可极大程度地提高石榴酸的抗氧化能力。在体外吸收性实验中，也可以很大程度地提高肠道对石榴酸的吸收率。
优选的，石榴酸与植物多酚的质量比为4：1～1:4；尤其是1：4。
本发明提供一种优化方案，所述制备方法包括如下步骤：
1)制备浓度为1.0～3.0mg/mL的植物多酚溶液；
2)制备浓度为0.5～8.0mg/mL的石榴酸溶液；
3)将植物多酚溶液缓慢滴入石榴酸溶液中，在室温弱酸性的条件下，缓慢搅拌反应0.5～1.0h，即得石榴酸-植物多酚复合物溶液；
其中，石榴酸与植物多酚的质量比为4:1～1:4。
采用上述制备方法制得的石榴酸-植物多酚复合物溶液，与游离石榴酸相比，一定量植物多酚的存在可以将石榴酸的表观渗透系数提高200％。
在实际生产中，可将石榴酸-植物多酚复合物溶液进行冻干处理，获得石榴酸-植物多酚复合物粉末。
采用本发明方法制备的石榴酸-植物多酚复合物具有较好的抗氧化能力，石榴酸的稳定性和生物可及性显著提高。植物多酚可以保护石榴酸免受自由基的氧化降解，并促进人体对石榴酸的吸收。为富含石榴酸的功能性食品的开发及应用，提供理论及技术上的支持与引导。另外，本技术对于利用石榴中的功能性成分开发相关功能性食品和保健品，增加石榴产业的附加值具有较高的应用前景及社会效益。
附图说明
图1为游离的石榴酸、植物多酚以及实施例、对比例制备的石榴酸-植物多酚复合物在清除不同自由基能力的结果对比图；
图2为石榴酸-植物多酚复合物Caco-2细胞转运实验结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
如下实施例中使用的石榴酸采用如下方式制得：
1)取无霉变的石榴籽，烘干后置于-18℃储藏后用粉碎机粉碎；
2)粉碎后的石榴籽粉过40目筛，取10g与正己烷混合，采用超声辅助有机溶剂萃取得到石榴籽油；
3)采用碱法提取混合脂肪酸，采用有机溶剂冷冻结晶法富集石榴酸；
所述碱法提取混合脂肪酸具体为以1：10的比例加入2.0mol/L KOH-甲醇溶液，用正己烷萃取，得到混合脂肪酸；
冷冻结晶法的冷冻温度为-20℃，冷冻时间24h，料液比1：8。
实施例1
本实施例提供一种石榴酸-植物多酚复合物的制备方法，具体如下：
1)制备浓度为2.0mg/mL的植物多酚溶液；称取0.01g植物多酚将其溶于5.0mL pH＝5磷酸盐缓冲溶液中；
2)取石榴酸，用去离子水-乙醇体系(4：1)溶解后，制备浓度为0.5mg/mL的石榴酸溶液；
3)将植物多酚溶液缓慢滴加到石榴酸溶液中；缓慢搅拌反应，反应时间为1h，反应温度为25℃，反应pH值为5，获得石榴酸-植物多酚复合物的溶液；
其中，石榴酸与植物多酚的质量比为1：4。
实施例2
本实施例提供一种石榴酸-植物多酚复合物的制备方法，与实施例1的区别仅在于，石榴酸与植物多酚的质量比为1：1。
实施例3
本实施例提供一种石榴酸-植物多酚复合物的制备方法，与实施例1的区别仅在于，石榴酸与植物多酚的质量比为4：1。
实施例4
本实施例提供一种石榴酸-植物多酚复合物的制备方法，与实施例1的区别仅在于，反应pH为6。
对比例1
制备浓度为2.0mg/mL的植物多酚溶液，即称取0.01g植物多酚将其溶于5.0mL酸性缓冲盐溶液中。
对比例2
制备浓度为0.5mg/mL的石榴酸溶液。
性能考察
1、等温量热测定石榴酸与植物多酚安石榴苷活性物质相互作用
设置等温滴定量热实验温度为25℃，注射器搅拌速率为180rpm，进行实验之前，将配制好的溶液、空白二甲基亚砜溶液进行过膜、真空脱气处理。取200μL的石榴酸溶液加入样品池中，分次取50μL中配置好的安石榴苷溶液在注射器中作为滴定液反应时间，间隔为300s，每次滴定液的体积为2.0μL，连续自动滴定20针。空白对照实验为将等浓度的植物多酚溶液滴定到只含有二甲基亚砜溶液的样品池中，每次试验重复三遍。用软件将曲线拟合到多位点模型上，该模型有两组位点(位点1，位点2)，每个位点显示不同的常量。
表1石榴酸与安石榴苷反应的动力参数
由实验结果可以看出，在石榴酸与安石榴苷的滴定反应中，ΔG＜0，可知安石榴苷与石榴酸结合热量变化显著，可自发结合反应。在第一个结合点，安石榴苷在与石榴酸作用导致反应体系的熵小于零，焓小于零，反应的驱动力为焓，氢键和范德华力可能起主要作用。在第二个结合位点，熵大于零，焓大于零，说明石榴酸与植物多酚的相互作用以疏水作用为主。
2、检测本发明的石榴酸-植物多酚复合物清除自由基的能力
1.1ABTS+·法
通过在分光光度计上扫描734nm的紫外可见吸光值，研究了石榴酸-植物多酚对ABTS+·清除能力。首先，取实施例1-4和对比例1-4各3μL，向其中分别加入237μL 7mmol/LABTS水溶液混匀，于室温下避光反应30min，测定反应液在734nm处的吸光值。以去离子水为空白对照，平行测定三次，取其平均值。
ABTS+·清除率(％)＝(1-A样/A空)◇100
A样：样液的吸光度值；A空：试剂空白的吸光度值。
1.2DPPH·法
通过在分光光度计上扫描517nm的紫外可见吸光值，研究了石榴酸-植物多酚对DPPH+·清除能力。首先，取实施例1-4和对比例1-4各200μL，向其中分别加入200μL，0.2mM的DPPH·无水乙醇工作液混匀，于室温下避光反应30min，测定反应液在517nm处的吸光值。以无水乙醇为空白对照，平行测定三次，取其平均值。
DPPH·清除率(％)＝(1-A样/A空)◇100
A样：样液的吸光度值；A空：试剂空白的吸光度值。
1.3FRAP法
取实施例1-4石榴酸-植物多酚复合物和对比例1-4植物多酚复合物各30μL，操作方法按总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒(BC1310 kit，Solarbio)说明书进行。
总抗氧化能力(U/mg样液)＝(ODU-ODC)/0.01÷30×N÷Cprot式中：ODU为测定管吸光度值；ODC为对照管吸光度值；N表示反应体系稀释倍数(也就是说反应液总体积与取样体积之比)；Cprot为待测样液浓度(mg/mL)。
实验结果如图1所示，游离的石榴酸具有一定的抗氧化能力，游离的植物多酚具有较强的抗氧化能力。而制得的同等浓度下石榴酸-植物多酚的复合物，对ABTS+·的清除率要高于游离的石榴酸；对DPPH·的清除能力要远远大于游离的石榴酸；其总抗氧化能力趋势与对DPPH·的清除能力一致；此外，ITC结果表明，植物多酚与石榴酸通过氢键和疏水键结合，当石榴酸：安石榴苷质量比为1：4时，由此表现出抗氧化的协同效应最显著；当pH＝6时，安石榴苷不稳定，可能会发生降解造成抗氧化能力的损失。综上表明植物多酚尤其是安石榴苷可以极大程度上保护石榴酸免受自由基诱导的氧化降解，增强其稳定性。
3、石榴酸-植物多酚复合物的体外吸收性实验
2.1Caco-2细胞培养
Caco-2细胞培养基：DMEM(Hyclone,SH30022)+10％ Fetal Bovine Serum(Hyclone,SV30087)+NEAA(Sigma)；0.05％胰蛋白酶(Amresco,0458)；非必需氨基酸(Sigma)；PBS；HBSS。
从液氮中取出冻存的Caco-2细胞，立即放入37℃水浴中振荡，使其在1min内融化。将细胞悬液用移液器移入15mL离心管中，加入5mL细胞培养基，混匀，在1000rpm离心5min，弃去上清，再加入5mL细胞培养基，混匀，同样条件离心，弃去上清，加入5mL培养基，混匀，将此细胞悬浮液移入25cm培养瓶中，放入37℃，5％ CO2培养箱中培养。
当细胞达到约80％汇合时，进行传代。弃去培养瓶中的培养基，用PBS缓冲液漂洗两次。加入胰酶，轻轻转动培养瓶，使胰酶覆盖上所有细胞，放入37℃培养箱中培养5min左右，在显微镜下观察消化情况，当细胞变圆隆起，向培养瓶中加入少量培养基，终止胰酶消化，用弯头吸管将消化下的细胞吹散，计数细胞密度并向新的培养瓶中接种细胞。
将消化后的细胞悬液向Transwell板的各孔上室加0.5mL，下室各加入1.5mLHank's液，然后将Transwell板放入37℃，5％ CO2培养箱中培养。第2天换液，先吸去Transwell板各孔下层的培养基，再小心吸去上层培养基，在上层加0.5mL，下层加1.5mL培养基,然后将Transwell板放入37℃，5％ CO2培养箱中培养。第3、5、7天时，重复第二天的换液操作，第8天开始，每天更换上层培养基，隔天更换下层培养基。
2.2供试品
实施例1～4提供的石榴酸-植物多酚复合物和对比例1～4提供的石榴酸相关复合物；以及去离子水作为空白对照。
2.3药物的Caco-2细胞单层模型转运实验
当Caco-2细胞在Transwell板上培养到一周后，隔天测定其单层电阻值，如果大于500Ω·cm-2，表明其已具有足够的紧密性和完整性，可用来进行吸收实验。
电阻值＝(各个孔的电阻值-对照孔的电阻值)×Transwell膜面积
吸取上层和下层的培养基，用PBS缓冲液将各孔上下层各清洗三遍，上层加入0.5mL待吸收的样品溶液(供试品)，下层加入1.5mL Hank's液，将Transwell板置于培养箱中，2h后取出，弃掉上层液体，并用0.5mL Stop Solution清洗三次，均弃掉，收集下层液体；各孔下层用1.0mL Stop Solution清洗一次，清洗液体与下层液体收集在一起；最后用0.5mL 1M NaOH清洗细胞层三次，单独收集，作为上层，各孔所收集的上、下层液体混合后于-20℃冷冻保存，采用液相质谱法对石榴酸进行检测。
2.4表观渗透系数的计算：药物在Caco-2细胞单层模型中的表观渗透系数(Papp)的计算:
Papp＝(dQ/dt)/(A×Co)
Papp单位为cm/s，Q是积累运转量，代表化合物在接收端出现的总量，单位为μg；dQ/dt是速率，单位为μg/min；Co是化合物在给予端的初始浓度，单位为μg/L；A是聚碳酯膜的表面积，单位为cm2。
2.5实验结果
Papp大于1×10-4cm/s表示药物在肠道吸收良好，小于1×10-7cm/s表示药物在肠道不被吸收。从结果来看，植物多酚安石榴苷被Caco-2细胞吸收。相比于对比例1中游离的石榴酸，实施例中同等质量下的石榴酸-植物多酚能够更高效地被肠道吸收。安石榴苷对石榴酸具有促进吸收的作用，浓度越高，效果越好。综上说明，安石榴苷的加入，极大地增强了石榴酸的生物可及性。
上述实验的结果表明，本发明提供的制备方法得到的石榴酸-植物多酚复合物，不仅能够显著提高石榴酸的稳定性，且具有较高的生物可及性；同时，本发明的原料易得，有助力于石榴副产物的功能性食品及保健品的开发，提高其附加值。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种石榴酸-植物多酚复合物的制备方法，其特征在于，将石榴酸溶液与植物多酚溶液进行混合，在温度为10～30℃的酸性条件下，反应0.5～1.0h，获得石榴酸-植物多酚复合物溶液；
其中，石榴酸与植物多酚的质量比为4：1～1：4。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，石榴酸采用如下方法制得：采用超声辅助有机溶剂萃取石榴籽油，冷冻结晶法从石榴籽油提取高纯度石榴酸；
优选的，具体采用如下条件：
以正己烷为冷冻溶剂，冷冻温度为-20℃，冷冻时间24h，料液比1：8。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述石榴酸溶液的浓度为0.1～10.0mg/mL；优选为0.5～8.0mg/mL。
4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为10～30℃。
5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，所述反应的pH值为5～6。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备浓度为0.5～8.0mg/mL的石榴酸溶液；
2)制备浓度为1.0～3.0mg/mL的植物多酚溶液；
3)将石榴酸溶液缓慢滴入植物多酚溶液中，在室温弱酸性条件下，缓慢搅拌反应0.5～1.0h，即得石榴酸-植物多酚复合物溶液；
其中，石榴酸和植物多酚的质量比为4：1～1：4。
7.权利要求1～6任一项所述制备方法制得的石榴酸-植物多酚复合物溶液；
优选的，所述石榴酸-植物多酚复合物溶液经冻干后制成石榴酸-植物多酚复合物粉末。
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