CN117721233A - 一种香蕉枯萎病和细菌性枯萎病的双重rpa引物组合及其应用和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种香蕉枯萎病和细菌性枯萎病的双重RPA引物组合及其应用和检测方法，涉及生物检测技术领域。该双重RPA引物组合包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3‑4所示的检测所述香蕉枯萎病菌热带4号小种的引物对FocTR4‑f/FocTR4‑r和核苷酸序列如SEQ ID NO.5‑6所示的检测所述香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种的引物对Rs2‑f/Rs2‑r。利用该双重RPA引物组合对香蕉枯萎病菌热带4号小种和香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种进行双重RPA检测，特异性强，灵敏度高，可重复性强，反应速度快，所需设备和条件简单，特别适用于这两种病害的快速诊断和口岸检验检疫。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种香蕉枯萎病和细菌性枯萎病的双重RPA引物组合及其应用和检测方法。
背景技术
香蕉枯萎病是由真菌尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cubense)引起的土传维管束病害，也称为巴拿马枯萎病，是全世界香蕉产业共同面临的毁灭性病害。病原真菌尖孢镰刀菌古巴专化型根据寄主植物范围分为1，2，3，4号小种，其中1号小种为害龙牙蕉、粉蕉、“大密哈”Gros Michel等品种。2号小种只侵染杂交三倍体棱香蕉(ABB)，对香蕉栽培品种的危害较小。3号小种侵染野生的羯尾蕉属，对香蕉栽培品种不造成危害。4号小种可侵染绝大部分香蕉品种，如“蜜哈”、矮蕉、野蕉(BB)、棱指蕉、粉蕉、蕉等。根据致病性特征和营养亲和群，4号小种被区分为热带4号小种和亚热带4号小种，其中营养亲和群(VCG)01213/16菌株被称为热带4号小种，后来被学者重新命名为F.odoratissimum。该菌株与亚热带4号小种及其它小种相比具有很强的侵染性在世界各地传播，危害十分广泛。不论病原菌是4号小种还是热带4号小种，目前生产上仍缺乏适宜的抗病品种和有效的防控措施。因此，借助快速准确的枯萎病菌检测技术及时明确病原菌以控制该病的传播和蔓延，显得尤为重要。2022年尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种被列入《重点管理外来入侵物种名录》，是国际植物检疫对象，属于农业植物检疫性有害生物。
香蕉细菌性枯萎病也称为香蕉Moko病，是由茄科雷尔氏菌2号小种也称为青枯菌2号小种(Ralstonia solanacearum race 2)引起的病害，是香蕉生产中危害最严重的病害之一。该病原细菌侵害芭蕉属(Musa spp.)的香蕉、大蕉、蕉麻和羯尾蕉(Heliconia spp.)，但不侵害茄科植物。其在香蕉等寄主病株、病残体、根茎等组织中越冬，能在土中存活一年以上。通过香蕉苗调运、带菌吸芽(带有病原菌的可在香蕉球茎腋芽萌发而成的后代)或经由青果(昆虫)、青果上的土壤、香蕉包装上携带病原菌等方式通过贸易环节，接着搭乘轮船、飞机和汽车等交通工具传播到其他国家。目前该病原菌广泛分布于40多个国家。目前香蕉细菌性枯萎病在国内的发生尚未见报道，其是被《中华人民共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录》列为禁止入境的二类危险性有害生物中三种细菌病害之一。随着国民经济生活水平提高，香蕉需求量越来越大。为了满足国内需求缺口，寻求经济利益，香蕉贸易、种质交流等活动越来越频繁，因此香蕉细菌性枯萎病入侵我国并传播扩散的可能性极大。因此，实行植物检疫十分重要，以防止传入无病区。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，简称RPA)，该扩增反应包含由能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶等关键酶，这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37℃左右。RPA的原理是：重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列，一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在三十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。普通RPA分析的关键在于扩增引物的设计。RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。因此RPA引物与传统的PCR引物设计要求不同。例如，RPA等温扩增不需要考虑退火温度。PCR引物多半是不适用RPA的。RPA反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。这无疑能大大加快核酸扩增的速度。此外，由于不需要复杂温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。
针对香蕉真菌性枯萎病菌已有荧光PCR检测方法和LAMP检测方法的报道，对香蕉细菌性枯萎病的检测，也有实时荧光PCR检测方法、超分支滚环扩增技术报道，但是用RPA反应同时检测这两种香蕉检疫性病害的检测技术和体系尚未见报道。本发明旨在研发一种用RPA反应同时或单独检测这两种检疫性病害的方法，以应用于此两种病害的快速诊断和口岸检验检疫。
发明内容
本发明的目的是提供一种香蕉枯萎病和细菌性枯萎病的双重RPA引物组合及其应用和检测方法，以解决上述现有技术存在的问题，利用该双重RPA引物组合对香蕉枯萎病菌热带4号小种和香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种进行双重或者单重RPA检测，特异性强，灵敏度高，反应快速，可重复性强，特别适用于这两种病害的快速诊断和口岸检验检疫。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种用于香蕉枯萎病菌热带4号小种和香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种双重RPA检测的引物组合，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示的检测所述香蕉枯萎病菌热带4号小种的引物对FocTR4-f/FocTR4-r和核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示的检测所述香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种的引物对Rs2-f/Rs2-r。
本发明还提供上述的引物组合在制备香蕉枯萎病菌热带4号小种和香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种的双重RPA检测产品中的应用。
进一步地，所述产品为试剂或试剂盒。
本发明还提供一种香蕉枯萎病菌热带4号小种和香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种的双重RPA检测产品，包括上述的引物组合。
进一步地，所述产品为试剂或试剂盒。
本发明还提供一种上述的引物组合在双重RPA同时检测香蕉枯萎病菌热带4号小种和香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种或者单独其中任意一种中的应用。
本发明还提供上述的双重RPA检测产品在双重RPA检测香蕉枯萎病菌热带4号小种和香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种或者单独其中任意一种中的应用。
本发明还提供一种香蕉枯萎病菌热带4号小种和/或香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种的检测方法，包括以下步骤；
提取得到待检样本的基因组DNA；
以所述基因组DNA为模板，利用上述的引物组合进行双重RPA检测，当扩增得到196bp的扩增产物时，提示所述待检样本中含有所述香蕉枯萎病菌热带4号小种；当扩增得到407bp的扩增产物时，提示所述待检样本中含有所述香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种。
进一步地，所述双重RPA检测的反应体系为：BufferA溶液29.4μL、超纯水10.1μL、10μM的引物FocTR4-f、FocTR4-r、Rs2-f和Rs2-r各1μL、DNA模板2μL和Buffer B溶液2.5μL。
进一步地，所述双重RPA检测的反应温度为37-42℃，反应时间为30分钟。
本发明公开了以下技术效果：
本发明构建了香蕉枯萎病菌热带4号小种和香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种的双重重组酶聚合酶扩增(RPA)检测体系，该检测体系以香蕉枯萎病菌热带4号小种的特异引物FocTR4-f/FocTR4-r以及香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种的特异引物Rs2-f/Rs2-r为基础，该检测体系对于香蕉枯萎病菌热带4号小种和香蕉细菌性枯萎病病原菌2号小种具有良好的检测特异性和灵敏度，既可同时检测香蕉枯萎病菌热带4号小种和香蕉青枯菌2号小种，又可以单独检测香蕉枯萎病菌热带4号小种或者香蕉青枯菌2号小种。利用该检测体系进行香蕉枯萎病菌热带4号小种和香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种检测，可重复性强，反应快速，不易污染，效果良好，特别适用于这两种病害的快速诊断和口岸检验检疫。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为香蕉枯萎病菌热带4号小种特异基因片段的序列比对结果；其中，FocTR4-B2为尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号小种B2菌株；FocTR4-NRRL54006为尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号小种II5菌株；FocR3为尖孢镰刀菌古巴专化型3号小种菌株；FocR1为尖孢镰刀菌古巴专化型1号小种N2菌株；FocR2为尖孢镰刀菌古巴专化型2号小种菌株；FocSTR4为尖孢镰刀菌古巴专化型亚热带4号小种菌株；Fol4287为尖孢镰刀菌番茄专化型菌株；Fo47为尖孢镰刀菌生防菌株；Fo-koae44为尖孢镰刀菌相思树专化型F.oxysporum f.sp.koae 44菌株；Fo-str170为F.oxysporum isolate 170菌株；FV7600为轮枝镰刀菌F.verticillioides7600菌株；FTJAE6437为F.tjaetaba NRRL 66243菌株；FMAN09577为F.mangiferae菌株MRC7560；FSUBG12161为F.subglutinans strain NRRL 66333；FPRO10057为F.proliferatum ET1菌株；Ffu-Augusto2为F.fujikuroi Augusto2菌株；
图2为双重RPA检测体系的检测结果；其中，1是以香蕉枯萎病菌热带4号基因组DNA和带香蕉细菌性青枯菌2号小种菌株特异基因片段的质粒DNA为模板；2是以香蕉枯萎病菌热带4号和带青枯菌2号小种菌株基因组DNA为模板；3是以带香蕉细菌性青枯菌2号小种菌株特异基因片段的质粒DNA为模板；4是清水对照；
图3为双重RPA体系检测的特异性测试结果；其中，A为用特异引物对FocTR4-f/FocTR4-r和Rs2-f/Rs-r进行RPA反应的扩增结果，B为用ITS通用引物ITS1/ITS4进行PCR反应的扩增结果；在A和B中，泳道1-11分别为香蕉枯萎病菌热带4号小种菌株B2、II5、801、802、GD-24、dg-4、Fy-1、LJFZ、ZJBZ、LGBZ、LDBZ；泳道12-23分别为香蕉枯萎病菌亚热带4号小种FJR11、香蕉枯萎病菌1号小种N2、DJ3-1、GSX3-1、GX-05、三七根腐病菌sq-1、其它镰刀菌株10437、10438、10439、10441、10442、10443；泳道24为清水对照；泳道25-32分别为其它真菌菌株10444、10445、10446、9935、7600、1a-1、MA19、3a-1；
图4为双重RPA体系检测香蕉细菌性枯萎病菌的特异性测试结果；其中，A为用特异引物对FocTR4-f/FocTR4-r和Rs2-f/Rs-r进行RPA反应的扩增结果，B为用16S rDNA通用引物27F/1492R进行PCR反应的扩增结果；在A和B中，泳道1为香蕉细菌性枯萎病菌；泳道2-4分别为香蕉软腐病菌Dikeya zeae菌株b12-1、36-5、36-1；泳道5为大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α菌株；泳道6为枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)QB61菌株；泳道7为农杆菌Agrobacterium tumefaciens GV3101；
图5为双重RPA体系的灵敏性检测结果；其中，泳道1-9分别为香蕉枯萎病菌热带4号小种基因组DNA模板量100ng+带香蕉细菌性青枯菌特异基因片段的质粒模板量20ng、香蕉枯萎病菌热带4号小种基因组DNA模板量50ng+带香蕉细菌性青枯菌特异基因片段的质粒模板量10ng、香蕉枯萎病菌热带4号小种基因组DNA模板量10ng+带香蕉细菌性青枯菌特异基因片段的质粒模板量5ng、香蕉枯萎病菌热带4号小种基因组DNA模板量5ng+带香蕉细菌性青枯菌特异基因片段的质粒模板量1ng、香蕉枯萎病菌热带4号小种基因组DNA模板量1ng+带香蕉细菌性青枯菌特异基因片段的质粒模板量100pg、香蕉枯萎病菌热带4号小种基因组DNA模板量500pg+带香蕉细菌性青枯菌特异基因片段的质粒模板量10pg、香蕉枯萎病菌热带4号小种基因组DNA模板量100pg+带香蕉细菌性青枯菌特异基因片段的质粒模板量1pg、香蕉枯萎病菌热带4号小种基因组DNA模板量20pg+带香蕉细菌性青枯菌特异基因片段的质粒模板量100fg、香蕉枯萎病菌热带4号小种基因组DNA模板量10pg+带香蕉细菌性青枯菌特异基因片段的质粒模板量10fg；泳道10为清水对照；
图6为双重RPA体系从染病香蕉组织中检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的结果；其中，A为用特异引物对FocTR4-f/FocTR4-r和Rs2-f/Rs-r进行RPA反应的扩增结果；B为用香蕉actin基因引物Musaactin-f/Musaactin-r进行PCR反应的扩增结果；在A和B中，泳道1为清水对照；泳道2-5分别为以接种香蕉枯萎病菌1号小种、亚热带4号小种、热带4号小种菌株B2和II5的香蕉根系球茎组织DNA为模板；
图7为双重RPA体系从模拟染病香蕉组织中检测香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种的结果；其中，A为用特异引物对FocTR4-f/FocTR4-r和Rs2-f/Rs-r进行RPA反应的扩增结果；B为用香蕉actin基因引物Musaactin-f/Musaactin-r进行PCR反应的扩增结果；在A和B中，泳道1为清水对照；泳道2-4分别为以接种香蕉软腐病菌Dikeya zeae菌株b12-1、36-5和模拟接种香蕉细菌性枯萎病菌的香蕉根系球茎组织DNA为模板。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1.香蕉枯萎病菌热带4号小种特异基因片段的筛选和特异引物设计
实验方法：对香蕉枯萎病菌热带4号小种B2菌株和1号小种基因组序列(AMGP00000000和AMGQ00000000)进行基因组比较分析，获得一些热带4号小种的特异基因片段，这些基因片段通过NCBI的BLASTn分析，筛掉特异性不强的基因片段。将最后候选序列与NCBI上的尖孢镰刀菌古巴专化型1号小种、2号和3号小种、亚热带4号小种、其它一些尖孢镰刀菌专化型及镰刀菌的同源基因片段进行序列比对，找出适合设计特异性扩增引物的基因片段，并设计RPA特异性检测引物。
实验结果：经过比对分析，最终获得特异基因片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，图1)。从SEQ ID NO.1所示序列中找到适合设计热带4号小种特异性检测引物的基因片段，并设计可进行RPA检测的特异性引物FocTR4-f和FocTR4-r(序列见表1)。
2.香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种特异基因片段的筛选及特异性引物设计
实验方法：根据青枯菌2号小种的特异基因片段序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，设计检测香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种的特异性引物。
实验结果：根据RPA引物设计原则，基于SEQ ID NO.2所示序列，设计香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种RPA检测的特异引物Rs2-f/Rs2-r(序列见表1)。
3.构建香蕉枯萎病菌热带4号小种和香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种的双重重组酶聚合酶扩增(RPA)检测体系
实验方法：采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的FastPure Plant DNAIsolation Mini Kit(DC104-01)，提取香蕉枯萎病菌热带4号小种的基因组DNA。根据香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种特异基因(SEQ ID NO.2)，在生工生物工程(上海)股份有限公司合成该基因，最后合成的基因连接在pUC18质粒中，转化于大肠杆菌DH5α，采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取质粒DNA。根据香蕉枯萎病菌热带4号小种菌株的特有基因序列(SEQ ID NO.1)，设计香蕉巴拿马病热带4号小种菌株的特异性引物对FocTR4-f和FocTR4-r(表1)；基于香蕉细菌性枯萎病菌特有对基因序列(SEQ ID NO.2)设计特异引物对Rs2-f和Rs2-r(表1)。采用武汉君诺德生物技术有限公司的Basic-DNA恒温快速扩增试剂盒(基础型)，根据试剂盒的使用说明，建立50μL体积的扩增体系，包括29.4μL的BufferA溶液、10.1μL的超纯水、浓度为10μM的引物FocTR4-f、FocTR4-r、Rs2-f和Rs2-r各1μL，2μL的DNA模板，最后加入2.5μL的Buffer B溶液，充分混匀后，置于37℃的恒温水浴槽中进行扩增反应，30分钟后取出，并用等体积的苯酚氯仿溶液(体积比1:1)进行抽提，用10000rpm离心5分钟后，取5μL进行在2％的琼脂糖凝胶中进行电泳，最后进行凝胶成像和拍照。
实验结果：以香蕉枯萎病菌热带4号小种菌株基因组DNA(约50ng)和青枯菌2号小种特有基因的质粒DNA(约1ng)为模板(图2，泳道1)，进行扩增反应，结果可同时扩增到热带4号小种的196bp特异扩增条带和2号小种的407bp特异扩增条带。以香蕉枯萎病菌热带4号小种基因组DNA为模板，可扩增到196bp的目标特异条带(图2泳道2)；以香蕉青枯菌2号小种特有基因为模板，可扩增到407bp的目标特异条带；而清水对照，无目标条带(图2，泳道3)。这些结果表明所构建的双重RPA扩增体系既可同时检测香蕉枯萎病菌热带4号小种和香蕉青枯菌2号小种，又可以单独检测香蕉枯萎病菌热带4号小种或者香蕉青枯菌2号小种。
4.双重RPA检测体系对香蕉枯萎病菌热带4号小种的特异性
实验方法：采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的FastPure Plant DNAIsolation Mini Kit(DC104-01)，提取表2中的30多株病原菌基因组DNA。以提取的DNA模板，用引物对FocTR4-f/FocTR4-r和Rs2-f/Rs2-r，以及上述的RPA检测体系和扩增条件进行扩增反应，所得产物经上述的方法抽提和离心后，进行琼脂糖凝胶电泳和成像。以提取的DNA模板，用ITS通用扩增引物对ITS1/ITS4进行PCR扩增，扩增条件：95℃预变性5分钟，98℃变性10秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35个循环，最后延伸5分钟。取5μL进行琼脂糖凝胶电泳和成像。
实验结果：用引物对FocTR4-f/FocTR4-r和Rs2-f/Rs2-r，以其中11株热带4号小种菌株基因组DNA为模板均可扩增到196bp的特异目标条带(图3中A的泳道1-11)；以香蕉枯萎病1号小种、亚热带4号小种及其它真菌基因组为模板，结果电泳显示无特异性的扩增条带(图3中A的泳道12-23，25-32)；以清水为对照，也无特异性扩增条带(图3中A的泳道24)。用引物对ITS1/ITS4进行PCR扩增，所有菌株可扩增到550bp左右的条带(图3中B的泳道1-23，25-32)，而清水对照无扩增条带(图3中B的泳道24)。结果表明，本发明所建立的双重RPA检测体系对香蕉枯萎病菌热带4号小种菌株具有很强的特异性。
5.双重RPA检测体系对香蕉细菌性枯萎病菌2号小种的特异性
实验方法：采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的FastPure BacteriaDNA Isolation Mini Kit(DC103-01)，提取表2中的细菌基因组DNA。以提取的DNA模板，用引物对FocTR4-f/FocTR4-r和Rs2-f/Rs2-r，以及上述的双重RPA检测体系和扩增条件进行扩增反应，所得产物经上述的方法抽提和离心后，进行琼脂糖凝胶电泳和成像。以提取的DNA模板，用16S rDNA扩增引物对27F/1492R进行PCR扩增，扩增条件：95℃预变性5分钟，98℃变性10秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，35个循环，最后延伸5分钟。取5μL进行琼脂糖凝胶电泳和成像。
实验结果：用特异引物对FocTR4-f/FocTR4-r和Rs2-f/Rs2-r，以其中带有青枯菌2号小种菌株特异性基因片段质粒的细菌DNA为模板进行RPA，均可扩增到407bp的特异目标条带(图4中A的泳道1)；以香蕉软腐病菌、农杆菌基因组DNA为模板，结果电泳显示无特异性的扩增条带(图4中A的泳道2-7)；以清水为对照，也无特异性扩增条带(图4中A的泳道8)。用16S rDNA引物，以上述提取的细菌DNA为模板进行PCR扩增，结果所有细菌DNA为模板均可扩增到特异1450bp左右的条带(图4中B的泳道1-7)，而清水对照组未扩增到目标条带(图4中B的泳道8)。结果表明，本发明所建立的双重RPA检测体系对香蕉细菌性枯萎病菌2号小种菌株具有很强的特异性。
6.双重RPA检测体系的灵敏性
实验方法：将上述提取的香蕉枯萎病菌4号小种和青枯菌2号小种的DNA进行不同浓度的稀释和配制，以不同浓度的DNA为模板，用引物对FocTR4-f/FocTR4-r和Rs2-f/Rs2-r，以及上述的双重RPA检测体系和扩增条件进行扩增反应，所得产物经上述的方法抽提和离心后，进行琼脂糖凝胶电泳和成像。
实验结果：以100ng-100pg热带4号小种菌株基因组DNA为模板均可扩增到196bp的特异目标条带(图5中泳道1-7)，而以低于100pg热带4号小种菌株基因组DNA为模板和清水对照，均无196bp的特异扩增条带(图5中泳道8-10)；以20ng-100fg的带有细菌2号小种菌株特异性基因片段质粒DNA为模板均可扩增到407bp的特异目标条带(图5中泳道1-8)，而以10fg的带有细菌2号小种菌株特异性基因片段质粒DNA及清水对照为模板，均无407bp左右的特异扩增条带(图5中泳道9-10)。结果表明，本发明所建立的双重RPA检测体系对香蕉枯萎病菌热带4号小种和细菌性枯萎病菌2号小种菌株具有较高的灵敏性。
7.双重RPA检测体系在香蕉枯萎病样品中的检测效果
实验方法：分别用50mL浓度为1×107孢子/mL的香蕉枯萎病热带4号小种菌株B2和II5、1号小种菌株N2、亚热带4号小种菌株FJR11的分生孢子悬浮液接种于巴西蕉(Musaspp.AAA cv.Brazil)杯苗(4叶期株高20cm左右)根部，接种无菌水为对照，每个处理各3株。接种30天后，取香蕉根系和球茎组织，用南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的FastPure Plant DNA Isolation Mini Kit(DC104-01)提取基因组DNA。以提取的各处理香蕉组织DNA(约150ng)为模板，用引物对FocTR4-f/FocTR4-r和Rs2-f/Rs2-r以及上述的RPA检测体系和扩增条件进行扩增反应，所得产物经上述的方法抽提和离心后，进行琼脂糖凝胶电泳和成像。以上述提取的香蕉组织DNA为模板，用引物对Musaactin-F/Musaactin-R进行扩增PCR扩增，PCR反应条件为95℃预变性5分钟，98℃变性10秒，63℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35个循环，最后延伸5分钟。取5μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和成像。
实验结果：用引物对FocTR4-f/FocTR4-r和Rs2-f/Rs2-r以接种热带4号小种B2和II5菌株的香蕉组织基因组DNA为模板，可扩增到196bp特异条带(图6中A的泳道4-5)；而以接种1号小种和亚热带4号小种菌株的香蕉组织基因组DNA为模板，均未扩增到196bp特异条带(图6中A的泳道2-3)；以清水对照也未扩增到196bp特异条带(图6中A的泳道1)。用引物对Musaactin-F/Musaactin-R，以提取的香蕉组织基因组DNA为模板进行PCR扩增，均能扩增到约250bp的条带(图6中B的泳道2-5)，而清水对照无扩增结果(图6中B的泳道1)。上述结果表明，本发明所建立的双重RPA检测体系可以应用于香蕉枯萎病热带4号小种的快速特异检测，检测结果准确可靠。
8.RPA检测体系在模拟香蕉细菌枯萎病菌样品中的检测效果
实验方法：分别用50mL浓度为1×108细胞/mL的香蕉软腐病菌菌株的细胞悬浮液接种于巴西蕉(Musa spp.AAA cv.Brazil)杯苗(4叶期株高20cm左右)根部，接种无菌水为对照，每个处理各3株。接种30天后，取香蕉根系和球茎组织，用南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的FastPure Plant DNA Isolation Mini Kit(DC104-01)提取基因组DNA。用混有带细菌性枯萎病青枯2号小种特异基因片段的质粒DNA的香蕉组织基因组DNA(质粒DNA与香蕉组织基因组DNA质量比1:10)作为模拟细菌性枯萎病感染样品DNA。以提取的各处理香蕉组织DNA(约150ng)和模拟细菌性枯萎病感染样品DNA的为模板，用引物对FocTR4-f/FocTR4-r和Rs2-f/Rs2-r以及上述的双重RPA检测体系和扩增条件进行扩增反应，所得产物经上述的方法抽提和离心后，进行琼脂糖凝胶电泳和成像。用引物对Musaactin-F/Musaactin-R进行扩增PCR扩增，PCR反应条件为95℃预变性5分钟，98℃变性10秒，63℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35个循环，最后延伸5分钟。取5μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳和成像。
实验结果：用引物对FocTR4-f/FocTR4-r和Rs2-f/Rs2-r以模拟细菌性枯萎病感染样品DNA为模板，可扩增到407bp特异条带(图7中A的泳道4)；而以接种香蕉软腐病菌菌株的香蕉组织基因组DNA为模板，均未扩增到407bp特异条带(图7中A的泳道2-3)；以清水对照也未扩增到196bp香蕉枯萎病热带4号小种特异条带(图7中A的泳道1)。用引物对Musaactin-F/Musaactin-R，以提取的香蕉组织基因组DNA为模板进行PCR扩增，均能扩增到约250bp的条带(图7中B的泳道2-4)，而清水对照无扩增结果(图7中B的泳道1)。上述结果表明，所建立的检测体系可以应用于香蕉细菌性枯萎病2号小种的快速特异检测，检测结果准确可靠。
结论：本发明设计的引物能顺利扩增目标基因，本发明构建的双重RPA检测体系对于香蕉枯萎病菌热带4号小种和香蕉细菌性枯萎病病原菌2号小种有良好的灵敏度、特异性，该方法可重复性强，不易污染，效果良好。
表1本发明所用引物
表2本发明所用菌株
SEQ ID NO.1：
tctccagagcgtagatcctccttgcacagtcgttacagacggatcatcaaacagcagacaagtgttaccccggaaccgctagctgcgagggaaccaaggagctcaagatggaggatttggtagtcaaacggcagttgcatatgttaggcatattaaaacagtgtaaaagctcaaattcctgatctaattgctcaacggattatcatcagcatcaatttgtctctcaccaggacaaaacttcaaccattcaacatgaagttctctatcgtgtataccctcttcctcgcccaaggaatcattgccatgcccaggttccacaccaaagcaaaggctgccggagatgagattatatatgtttaaaacagtaaactctagaattacaaaaatgttactagtcttagagttaaactatatcactaatcacagtcagcagtcttcgcatcaggatctccgagggatcctttcgtcccggaattctgcccaaaatgtatgcaccagtaccttaaaggtctcagttcagctaagcacgatgtacgtccagctgcgactttccgacaacaccaaaagttaccaccaggaccatcgggaggatgtacacaagtgagaccagatcgtcgatcgctcctactcatgtcttacaacagggatcaagccgctccgctcccgtgccgtatttggtagaccatcacctctatcctccttgcatgattgatcgacgcaaggaggagcattcctaggacagacctgtgagacatacggaccatcggtaagtgaatcaaggaatagtcagacaagttgctgatcatgagggggacatgtagcacagcgcatgttgatgaactcgataagtaggatgatggttgagatttgggtggaagaaaaatctataaaggtcgagggtctgtccgcctgttcgctcatcccaccatcctcaacagcttcactttcacactacaatacactacactacactacatcactacactttcagatttccagaatgaagttctctatggcttccactctactccttgccaacagcatcgctgctataccttggtcttccctcaacgccaagcagtccagcggcgaggagatcacgtacgtcccatcttagtcaatcttgctcagttccacaactcgatactaacacgacctgtgtagcctccgcatccaggtctcccagccctcttccaagaaaaccttctcccccaaccacaagggcgtcgtcaacgtccacaactacgaagtctgcctcaaggtctgctggcccgaggagccaaaatgccccgaaggctgggtaagtgacaagaaagcctattctcgattgatcattgctaattatttgaccagaactccaagaaatttgtatgctacctggtagtgacgaagacgaactttttactaacaggctttagggagacgaagactatccttgctggacctgctgcaagaagactggcgatgatgatgatctctgaatatcaggttagccaaggacttagagaatcggactacaaatatgacatgaagacaaagaggatatggagtcagtatagcataaatggacactcgttacaatctatcataatctgagactcgtgctgcatgaatatgatttgtgcatggtaaactaatcacacagtcgcttctacccgctccccactcatttccgtcgagcaaggtcagtagactgccgagaaccactgacaagtattacgtagtgtaaattcgggttaaacagccctattacaagaacctggggttagctggcatgtacgtagtgaagttcggcaagtcttggctctacattcaagctttctggaaatctccggcggtatgcagcttggtcgacttggtatagaggcgaagactaccgctctcggattcaacattggccccacgtcgtctccatctcattatcagcacagacaatgggtcgtcggtctcggccaaatctgatttctggagttcagctagctcccccgaagacccctacccttcaactccactcgatcgcacgataatgcccagattcatccaagtccggagcggaatcggcgccttgatcgactcttaattgtcacttatttttagccacatcaaccgctagataagtc gtagataactattaatcttgataaacttcatgtgttcatgatctatacctgacgaagacatcggcttaattgttgctctactgcttggccttgattctgactcaaagagcacgaccagttgagagcccatacgcgatattcgcaaactgttcgattataatatcttgtcggtctggaagcctctccaacaccatatcagcatactcattattttccgcctgagcctgtcatcgatcgattgtggctattcacgttaccatagtgtcagtaacatcactgtgtcactccaaatacgtttcaaactctcgtcttggtgtggctgtgggaaacctacttcgtcaccaggcttgggacccccctg；下划线处为引物设计位点。
SEQ ID NO.2：
atgacgctcgacccggcatccacagcagaagaccaagccctgcaggccgatatcgccgtgctgcgcggccgtttcactgatacccgcgagctttaccgggaggtctgtgcgctgctgttctttcgctacggcgtcacgcccacggccaacaagctctacagcctggtgcgcaagggcagcatgagcacgccgaccgatgtgctgaaccgcttctggcaagacttgcgggacaagacacgggtcaagatcaatcatcccgagctgcctgatgccatgaagcaggtcgccgccgaggccgtgctgacgatttggcaagccgcctcgtcggccgcgaccggtgaacttgccgcgctacgggctgaagcgcgccaccaggcgcacgctgccgagacggcacgtgaccaggcggccgccgaatccgaggctgcccggcaggcgacggcagccacccaagcgcaacttgatgccgtccgcgcccagctcgccgaactgcaggaggtgctgtccgctgaacgccaagcccatgccgcgaccgatgctcgcctgcaggaggcgcgccggcaattggaggaagcagcacggcaattggcggaagcgcgggtcgagtttggtgctcaactcgaccgtgagcgagagcgtgcggacgccgccgacgcgcgcgcggccagtcacgagaagcgagcgctgcgcgaaatcgaccaggagcgcagtgctcggcagaaaagcgacaagctggcggaagaacttcgcgtgcagcttgtggccacgcggaccgatatgcagcaggcggcggttcaccacgccaactcgatcggcgccttgcgcgcagaactgggcggggcgcagcagcagggagacgccgccgtggctcagcagcgcgcggcggccgatcaactggcgcagactcagttgcagctgcaggaagcgctgcgacgcgccgagcgcgccgagaccgaggcggaaacgacgcgcaggctggt ggatgaattgaagaaaacgccagccggacgcgctggccagcgcccgaaaccggcctga；下划线处为引物设计位点。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于香蕉枯萎病菌热带4号小种和香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种双重RPA检测的引物组合，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示的检测所述香蕉枯萎病菌热带4号小种的引物对FocTR4-f/FocTR4-r和核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示的检测所述香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种的引物对Rs2-f/Rs2-r。
2.一种如权利要求1所述的引物组合在制备香蕉枯萎病菌热带4号小种和香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种的双重RPA检测产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。
4.一种香蕉枯萎病菌热带4号小种和香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种的双重RPA检测产品，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合。
5.根据权利要求4所述的双重RPA检测产品，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。
6.一种如权利要求1所述的引物组合在双重RPA同时检测香蕉枯萎病菌热带4号小种和香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种或者单独其中任意一种中的应用。
7.一种如权利要求4或5所述的双重RPA检测产品在双重RPA同时检测香蕉枯萎病菌热带4号小种和香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种或者单独其中任意一种中的应用。
8.一种香蕉枯萎病菌热带4号小种和/或香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种的检测方法，其特征在于，包括以下步骤；
提取得到待检样本的基因组DNA；
以所述基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组合进行双重RPA检测，当扩增得到196bp的扩增产物时，提示所述待检样本中含有所述香蕉枯萎病菌热带4号小种；当扩增得到407bp的扩增产物时，提示所述待检样本中含有所述香蕉细菌性枯萎病菌青枯菌2号小种。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述双重RPA检测的反应体系为：BufferA溶液29.4μL、超纯水10.1μL、10μM的引物FocTR4-f、FocTR4-r、Rs2-f和Rs2-r各1μL、DNA模板2μL和Buffer B溶液2.5μL。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述双重RPA检测的反应温度为37-42℃，反应时间为30分钟。
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