CN117720552B - 一种抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症的龙眼果肉提取物及其制备方法与应用 - Google Patents
一种抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症的龙眼果肉提取物及其制备方法与应用Info
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- CN117720552B CN117720552B CN202311412035.1A CN202311412035A CN117720552B CN 117720552 B CN117720552 B CN 117720552B CN 202311412035 A CN202311412035 A CN 202311412035A CN 117720552 B CN117720552 B CN 117720552B
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Abstract
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症的龙眼果肉提取物及其制备方法与应用。本发明首次从龙眼果肉中提取分离得到两个龙眼果肉生物碱类化合物，对其进行了活性研究，实验数据表明，该龙眼果肉生物碱类化合物具有抑制乙酰胆碱酯酶活性的作用，能阻止乙酰胆碱酯酶降解乙酰胆碱，增加直接参与认知功能障碍的乙酰胆碱的含量水平，说明其能够用于制备乙酰胆碱酯酶抑制剂和阿尔兹海默症防治药物。本发明提供的龙眼果肉提取物主要含有上述两个化合物，在开发为乙酰胆碱酯酶抑制剂以及阿尔兹海默症防治药物方面具有很重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域。更具体地，涉及一种抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症的龙眼果肉提取物及其制备方法与应用。
背景技术
阿尔兹海默症(AD)是一种多发性神经退行性疾病，是老年人群患痴呆症的最主要原因。乙酰胆碱是一种神经递质，在神经元之间传递信息的过程中起着关键作用。根据WHO的数据，目前全世界约有5000万AD患者，预计2050年，病例数将超过1.5亿。随着我国老龄化进程的加剧，中国AD患者的数量不仅位居世界第一，其增速也是全球最快的。因此，研发出可以有效缓解AD病情的药物对于减轻因AD带来的社会负担至关重要。全球各国制药企业一直以来都在争夺AD药物巨大的市场，辉瑞、默克、强生等制药巨头已尝试研发多种药物治疗AD，但均在临床阶段宣告失败。
有报道表明，阿尔茨海默症患者往往存在乙酰胆碱水平较低的情况，这是因为阿尔茨海默病损害了产生和使用乙酰胆碱的细胞，导致神经元信息传递功能障碍，学习和记忆功能减弱。胆碱能假说认为，与AD相关的认知障碍的病理生理学归因于胆碱能神经元的破坏或丢失，引起乙酰胆碱水平降低，从而导致认知功能障碍等一系列病理特征。抑制AChE会导致ACh的累积，进而增加毒蕈碱等的刺激，最终缓解AD导致的的记忆缺陷。因此，乙酰胆碱含量不足被认为是阿尔茨海默病老年痴呆症发生的一个主要因素。一些药物可以通过阻断酶的作用来增加乙酰胆碱的水平，这些药物被称为乙酰胆碱酯酶抑制剂或胆碱酯酶抑制剂(AchE)。它们可以帮助缓解与思维过程相关的症状，如语言、判断和记忆。
中国专利申请CN103533948A公开了一种包含龙眼肉、丹参及天麻提取物作为有效成分的神经疾病的预防或治疗用组合物，所述神经疾病预防组合物对乙酰胆碱酯酶的活性起到抑制作用。然而龙眼肉、丹参及天麻提取物含有多种活性成分，无法确认是何种成分对乙酰胆碱酯酶的活性具有抑制作用。另外冉玉兵等学者(冉玉兵,刘磊,张瑞芬等.龙眼果肉提取物改善SAMP8小鼠学习记忆功能[J].现代食品科技,2017,33(06):1-8.DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2017.6.001.)公开了龙眼果肉醇提物的石油醚相和水相均能有效地改善老年痴呆模型小鼠SAMP8的学习记忆功能，但龙眼果肉醇提物的石油醚相和水相的化学成分尚不明确。上述专利和期刊文章公开的均为以中药提取物作为一个整体去研究其药效，无法确认其含有哪些具体活性成分以及其中含有的单体化合物的具体药效如何。中药提取物为中药经过提取浓缩后药材中多种成分的混合物，其中一些可能具有药效，另一些没有任何的药效甚至可能对人体产生不良影响，因此，非常有必要对中药提取物成分进行深入的研究，更好地了解中药的作用机制，提高中药的疗效和安全性，有利于推动中药现代化和国际化发展。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中往往将龙眼肉提取物作为一个整体去研究，缺乏对其中具体有效单体化合物的富集或提纯制备以及其药效作用深入研究的缺陷和不足，提供一种抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症的龙眼果肉提取物。
本发明另一目的是提供所述龙眼果肉提取物在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂或阿尔兹海默症防治药物中的应用。
本发明另一目的是提供一种乙酰胆碱酯酶抑制剂或阿尔兹海默症防治药物，以所述龙眼果肉提取物为活性成分。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明保护一种抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症的龙眼果肉提取物，该提取物主要含有化合物1和/或化合物2：
上述龙眼果肉提取物由如下方法一和/或方法二制备得到：
方法一：将龙眼肉经醇提、醇沉制成的干膏，进行硅胶柱层析：以体积比为(1-2)：1的乙酸乙酯-甲醇溶液(优选体积比为1：1的乙酸乙酯-甲醇溶液，和/或2：1的乙酸乙酯-甲醇溶液)为洗脱液进行洗脱，得流份A；将流份A进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯为洗脱液进行洗脱，得流份A-1；再将流份A-1经中压制备色谱进行分离纯化，以体积比为20:80的水-甲醇溶液为洗脱液进行洗脱，洗脱液进行干燥，得到主含化合物1的龙眼果肉提取物；
方法二：将龙眼肉经醇提、醇沉制成的干膏，进行硅胶柱层析：以乙酸乙酯为洗脱液，得流份B；将流份B经半制备液相色谱进行分离纯化，以体积比为8:92的水-甲醇溶液为洗脱液，进行洗脱，洗脱液进行干燥，得到主含化合物2的龙眼果肉提取物；
合并方法一和方法二所得为主含化合物1和化合物2的龙眼果肉提取物。
优选地，方法一中，洗脱液乙酸乙酯-甲醇溶液为1：1的乙酸乙酯-甲醇溶液，和/或2：1的乙酸乙酯-甲醇溶液。
进一步地，上述方法一和方法二中，所述龙眼肉经醇提、醇沉制成的干膏的制备方法包括如下步骤：
S1、取龙眼肉加入醇类溶剂，加热回流，冷却，摇匀，过滤，取滤液减压浓缩得粗浸膏；
S2、将步骤S1所得粗浸膏加入60～95vol％乙醇醇沉，过滤，取滤液进行减压浓缩后干燥，获得冻干干膏。
进一步地，方法一中所述硅胶柱为玻璃柱，填充的硅胶的目数为80～100目。
进一步地，方法二中所述硅胶柱为玻璃柱，填充的硅胶的目数为200～300目。
进一步地，所述中压制备色谱使用的色谱柱为碳十八色谱柱。
更进一步地，所述中压制备色谱使用的色谱柱的规格为36mm*460mm，粒径为40～63um。
进一步地，所述半制备液相色谱使用的色谱柱为碳十八反相色谱柱，优选为安捷伦10Prep-C18，规格为30mm*150mm。
更具体地，作为一种可实施方案，上述龙眼果肉提取物由包括以下步骤的方法提取得到：
S1、取龙眼肉加入醇类溶剂，加热回流，冷却，摇匀，过滤，取滤液减压浓缩得粗浸膏；
S2、将步骤S1所得粗浸膏加入60～95vol％乙醇醇沉，过滤，取滤液进行减压浓缩后干燥，获得冻干干膏；
S3、将步骤S2所得冻干干膏进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯-甲醇溶液为洗脱液进行梯度洗脱，经TLC(thin-layer chromatography，薄层层析)及HPLC(High PerformanceLiquid Chromatography，高效液相色谱)检测合并相同部分，收集乙酸乙酯-甲醇体积比为2:1和1:1的流份，合并后进行干燥，得流份A；收集乙酸乙酯-甲醇体积比为1:0的流份，进行干燥，得流份B；
S4、将步骤S3所得流份A进行硅胶柱层析，以体积比为1：0的乙酸乙酯-甲醇溶液为洗脱液，进行洗脱，干燥，得流份A-1；
S5、将步骤S4所得流份A-1经中压制备色谱进行分离纯化，以体积比为20:80的水-甲醇溶液为洗脱液，进行洗脱，收集流份，进行干燥；
S6、将步骤S3所得流份B经半制备液相色谱进行分离纯化，以体积比为8:92的水-甲醇溶液为洗脱液，进行洗脱，收集流份，进行干燥；
S7、S5所得产物、S6所得产物或合并S5和S6所得产物，即为具有抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症活性的龙眼肉提取物。
具体地，TLC的条件为：展开剂为乙酸乙酯和甲醇，点样量为3～5ul，显色剂为碘熏蒸和硫酸乙醇显色；TLC通过观察样品的斑点形状、颜色的均一性来评估化合物的纯度。
HPLC检测的条件为：色谱柱：安捷伦10Prep-C18 30mm*150mm，以甲醇-水为流动相，流速为4ml/min，检测波长为254nm；HPLC通过光谱图评估化合物纯度。
具体地，上述步骤S5所得产物即为化合物1，步骤S6所得产物即为化合物2。
发明人经过大量的实验，首次从龙眼肉中提取得到上述两个对乙酰胆碱酯酶具有抑制活性的龙眼果肉生物碱类化合物，能阻止乙酰胆碱酯酶降解乙酰胆碱，增加直接参与认知功能障碍的乙酰胆碱的含量水平，这说明上述两个龙眼果肉生物碱类化合物能够用于制备乙酰胆碱酯酶抑制剂，能被开发为阿尔兹海默症防治药物。
经过结构式对比检索发现，上述化合物1和化合物2的结构均被现有技术(化合物1：陈栋杰.中药枸杞子酰胺及苯丙素类成分分析及产地鉴别研究[D].南京中医药大学,2021.；化合物2：Jung H J,Jung H A,Kang S S,et al.Inhibitory activity of Araliacontinentalis roots on protein tyrosine phosphatase 1B and rat lens aldosereductase.[J].Archives of pharmacal research,2012,35(10).)公开，但未披露其活性。
因此，本发明要求保护上述两个化合物及富含该化合物的提取物及其在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂和阿尔兹海默症防治药物中的应用。
根据本发明成果，以龙眼肉为原料提取能够抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症的提取物，需尽量富集化合物1或/和化合物2。上述龙眼果肉提取物即为富集化合物1或/和化合物2的提取物。
在上述龙眼果肉提取物的提取方法中，优选地，步骤S1中，所述醇类溶剂为乙醇、甲醇、异丙醇、正丁醇中的任意一种或多种。
更优选地，当醇类溶剂为乙醇时，优选乙醇的使用浓度为60～95vol％。
优选地，步骤S1中，所述龙眼肉与醇类溶剂的质量体积比为1：8～10(kg/L)。
优选地，步骤S1中，所述加热回流的温度为50～80℃。
优选地，步骤S1中，所述加热回流的时间为0.5～1h。
优选地，步骤S1中，所述粗浸膏的相对密度为0.9～1.2。
优选地，步骤S1和S2中，所述减压浓缩的温度为50～65℃。
优选地，步骤S2中，所述干燥为冷冻干燥。
优选地，步骤S2中，所述加入60～95vol％乙醇醇沉2～5次。
具体地，步骤S3中，所述进行硅胶柱层析的具体操作为：将所得冻干干膏按照质量比为1：2～4与硅胶(80～100目)充分混合研磨，干法装柱，干法上样，进行硅胶柱层析。
具体地，步骤S4中，所述进行硅胶柱层析的具体操作为：将步骤3所得流份A按照质量比为1:1与硅胶(200～300目)充分混合研磨，干法装柱，干法上样，进行硅胶柱层析。
本发明还保护所述龙眼果肉提取物在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂或阿尔兹海默症防治药物中的应用。
本发明还保护一种乙酰胆碱酯酶抑制剂或阿尔兹海默症防治药物，以所述龙眼果肉提取物为活性成分。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次从龙眼果肉中提取分离得到两个具有抑制乙酰胆碱酯酶活性的龙眼果肉生物碱类化合物，对其进行了活性研究，实验数据表明，该龙眼果肉生物碱类化合物具有乙酰胆碱酯酶的活性的作用，能阻止乙酰胆碱酯酶降解乙酰胆碱，增加直接参与认知功能障碍的乙酰胆碱的含量水平，说明其能够用于制备乙酰胆碱酯酶抑制剂和阿尔兹海默症防治药物。
基于此本发明提供的龙眼果肉提取物成分更加简单、纯度高，主要含有化合物1和/或化合物2，在开发为乙酰胆碱酯酶抑制剂以及阿尔兹海默症防治药物方面具有很重要的应用价值。
附图说明
图1为化合物1的氢谱图。
图2为化合物1的碳谱图。
图3为化合物1的二级质谱图。
图4为化合物1的紫外光谱图。
图5为化合物2的氢谱图。
图6为化合物2的碳谱图。
图7为化合物2的二级质谱图。
图8为化合物2的紫外光谱图。
图9为化合物3的氢谱图。
图10为化合物3的碳谱图。
图11为化合物1～3对乙酰胆碱酯酶的活性抑制作用数据统计图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
下面的硅胶玻璃柱的填料可以是购买于青岛海洋化工有限公司的柱层层析硅胶
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明人团队经过大量的实验研究，龙眼肉中提取的活性成分对乙酰胆碱酯酶活性的影响对比显示，上述化合物1和化合物2对乙酰胆碱酯酶活性有明显的抑制作用，因此，本发明旨在开发以龙眼果肉为原料的富含上述化合物1和化合物2的提取物，以用于开发乙酰胆碱酯酶抑制剂和阿尔兹海默症防治药物。以下实施例展示所述提取物的提取工艺及提取产物对乙酰胆碱酯酶活性的影响。
实施例1龙眼肉活性成分提取工艺研究
1、龙眼肉活性成分提取工艺
S1、取龙眼肉饮片1kg，置具塞锥形瓶中，按照质量体积比为1:8(kg/L)加入80vol％的乙醇8L，于65℃加热回流1h，冷却，摇匀，过滤，取滤液于60℃减压浓缩得相对密度为1.1的粗浸膏；
S2、将步骤S1所得粗浸膏加入80vol％乙醇醇沉2次，过滤，取滤液于60℃下进行减压浓缩后，进行冷冻干燥，获得冻干干膏；
S3、将步骤S3所得冻干干膏按照质量比为1:2与硅胶(80～100目)充分混合研磨，干法装柱，干法上样，进行硅胶玻璃柱层析，以乙酸乙酯-甲醇溶液为洗脱液按照乙酸乙酯-甲醇体积比为1:0，50:1，10:1，5:1，2:1，1:1，1:2，依次进行梯度洗脱，收集乙酸乙酯-甲醇体积比为2:1和1:1的流份，合并干燥，得流份A，收集乙酸乙酯-甲醇体积比为1：0的流份，进行干燥，得流份B；其他流份不含有目标化合物或者含有的含量较少，因此将其他流份剔除不要；
S4、将步骤S3所得流份A按照质量比为1：1与硅胶(200～300目)充分混合研磨，干法装柱，干法上样，进行硅胶玻璃柱层析，以乙酸乙酯-甲醇溶液为洗脱液按照乙酸乙酯-甲醇体积比为1:0，5:1，2:1，1:1，1:2，1:5，依次进行梯度洗脱，经TLC及HPLC(色谱柱：安捷伦10Prep-C18 30mm*150mm，以甲醇-水为流动相，流速为4ml/min，检测波长为254nm)检测合并相同部分，收集乙酸乙酯-甲醇体积比为1：0的流份，进行干燥，得流份A-1；收集乙酸乙酯-甲醇体积比为5:1和2:1的流份，合并干燥，得流份A-2；
S5、将步骤S4所得流份A-1经中压制备色谱(碳十八柱，规格为36mm*460mm，粒径为40～63um，流速为20ml/min，检测波长为210nm)进行分离纯化，以水-甲醇溶液为洗脱液按照水-甲醇体积比为100:0、80:20、60:40、40:60、20:80、0:100，依次进行梯度洗脱，收集水-甲醇体积比为20：80的流份，进行干燥，即为化合物1(结构式及鉴定数据见下文)；
S6、将步骤S3所得流份B经半制备液相色谱(色谱柱：安捷伦10Prep-C1830mm*150mm，流速为4ml/min，检测波长为254nm)进行分离纯化，以体积比为8:92的水-甲醇溶液为洗脱液，进行洗脱，收集流份，进行干燥，即为化合物2(结构式及鉴定数据见下文)。
另外，将步骤S4所得流份A-2经半制备液相色谱(色谱柱：安捷伦10Prep-C1830mm*150mm，流速为4ml/min，检测波长为254nm)进行分离纯化，以体积比为90:10的水-甲醇溶液为洗脱液，进行洗脱，收集流份，进行干燥，即为化合物3(结构式及鉴定数据见下文)。
2、化合物1～3的结构及鉴定
所得化合物1～3的结构如下所示：
化合物1～3的结构鉴定数据如下所示：
化合物1：白色粉末，UV(MeOH)λmax 254nm，HR-ESI-MS m/z 180.0655[M+H]+(理论值179.06)，分子式C9H9NO3。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ9.52(s,1H),6.96(d,J＝4.0Hz,2H),6.19(d,J＝3.9Hz,2H),5.83(q,J＝7.3Hz,1H),5.46(d,J＝14.9Hz,1H),5.37(d,J＝14.9Hz,1H),1.71(d,J＝2.3Hz,3H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ179.44(C-11),168.38(C-1),131.04(C-7),130.53(C-10),124.74(C-8),106.75(C-9),63.51(C-2),53.99(C-13),19.31(C-3)。以上数据与文献(陈栋杰.中药枸杞子酰胺及苯丙素类成分分析及产地鉴别研究[D].南京中医药大学,2021.)中的化合物9对照基本一致，鉴定该化合物为2-(5-Hydroxymethyl-2-formylpyrrol-1-yl)propionic Acid Lactone。
化合物2：白色粉末，UV(MeOH)λmax:254nm，HR-ESI--MS m/z：224.0927[M-H]-，分子式C11H15NO4。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ9.49(s,1H),7.00(d,J＝4.0Hz,1H),6.28(d,J＝3.9Hz,1H),4.44(s,2H),4.25(d,J＝165.5Hz,2H),3.27(s,3H),2.21(t,J＝7.3Hz,2H),1.85(d,J＝344.5Hz,2H)；13C NMR(151MHz,DMSO)δ179.48(CHO),173.88(COOH),139.02(C-5),132.00(C-2),123.69(C-3),111.33(C-4),64.62(C-6),57.42(OCH3),44.26(C-1′),30.66(C-3′),26.34(C-2′)。以上数据与文献(Jung H J,Jung H A,Kang S S,etal.Inhibitory activity of Aralia continentalis roots on protein tyrosinephosphatase 1B and rat lens aldose reductase.[J].Archives of pharmacalresearch,2012,35(10).)中的化合物12对照基本一致，鉴定该化合物为4-[formy-5-(methoxymethyl)-1H-pyrrol-1-yl]butanoic acid。
化合物3：棕黄色油状物。ESI-MSm/z124[M－H]－；1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δ:9.40(1H，s，H-6)，6.92(1H，d，J＝3.5Hz，H-3)，6.18(1H，d，J＝3.5Hz，H-4)，4.46(2H，s，H-7)。13C-NMR(DMSO-d6，125MHz)δ:178.6(C-6)，1142.5
(C-2)，1132.1(C-5)，1120.9(C-3)，1108.8(C-4)，556.1(C-7)。以上数据与文献(卫生,李孟,郑晓珂等.生地黄化学成分研究[J].中国药学杂志,2014,49(17):1496-1502.)中的化合物1对照基本一致，鉴定该化合物为5-hydroxymethyl-pyrrole-2-carbaldehyde。
化合物1的氢谱图、碳谱图、二级质谱图和紫外光谱图分别如图1～4所示。结合这些谱图数据可以进一步鉴定提取的化合物1为2-(5-Hydroxymethyl-2-formylpyrrol-1-yl)propionic Acid Lactone。
化合物2的氢谱图、碳谱图、二级质谱图和紫外光谱图分别如图5～8所示。结合这些谱图数据可以进一步鉴定提取的化合物2为4-[formy-5-(methoxymethyl)-1H-pyrrol-1-yl]butanoic acid。
化合物3的氢谱图和碳谱图如图9～10所示。结合这些谱图数据可以进一步鉴定提取的化合物3为5-hydroxymethyl-pyrrole-2-carbaldehyde。
实施例2实施例1提取所得化合物1～3(主含化合物的提取物)的抑制乙酰胆碱酯酶活性测定
该方法采用改良的Ellman比色法进行测定，其基本原理是以碘化乙酰硫代胆碱(ATCI)为底物，加入AChE(乙酰胆碱酯酶)后，ATCI会在AChE作用下水解，生成硫代胆碱，其与DTNB反应生成2-硝基苯甲酸-5-巯基硫代胆碱和2-硝基-5-巯基苯甲酸(TNB)，且可在405nm处检测到黄色离子(TNB)的吸光度值。在测定样品对AChE的抑制活性中，如果样品对AChE有抑制作用，则会使得ATCI参加反应的量减少，导致产生的产物(硫代胆碱)减少。而产物与DTNB反应的量也会相应减少，最终导致TNB的生成减少，则吸光度值在405nm处降低；反之，吸光度值在405nm处增加。
利用上述方法测定原理，对实施例1所得化合物1～3进行抑酶活性测定。
具体操作步骤如下表所述：将此实验分为空白组、样品组、模型组，每组各做3次平行试验按照表1加样，保持各管的总体积不变。
表1
样品组的AChE酶抑制率分别通过公式(2.1)进行计算：
样品组：
抑制率＝(A模型-A样品组)/(A模型组-A空白组)×100％(2.1)
化合物1～3的抑酶实验结果如图11所示，结果表明化合物1和化合物2对乙酰胆碱酯酶的活性具有抑制作用，能阻止乙酰胆碱酯酶降解乙酰胆碱，增加直接参与认知功能障碍的乙酰胆碱的含量水平，说明化合物1和化合物2能够用于制备乙酰胆碱酯酶抑制剂，能进一步被开发为预防和/或治疗阿尔兹海默症的药物。而化合物3则显示对乙酰胆碱酯酶的活性没有抑制作用，说明并非从龙眼肉中提取分离的所有生物碱类化合物均对乙酰胆碱酯酶的活性具有抑制作用。
因此，以龙眼肉为原料提取能够抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症的提取物，需尽量富集化合物1或/和化合物2。
即基于上述研究，本发明还提供一种具有抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症活性的龙眼肉提取物，具体展示在下述实施例3～7。
实施例3具有抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症活性的龙眼肉提取物
提取方法如下：
S1、取龙眼肉饮片1kg，置具塞锥形瓶中，按照质量体积比为1:8(kg/L)加入80vol％的乙醇8L，于65℃加热回流1h，冷却，摇匀，过滤，取滤液于60℃减压浓缩得相对密度为1.1的粗浸膏；
S2、将步骤S1所得粗浸膏加入80vol％乙醇醇沉2次，过滤，取滤液于60℃下进行减压浓缩后，进行冷冻干燥，获得冻干干膏；
S3、将步骤S3所得冻干干膏按照质量比为1:2与硅胶(80～100目)充分混合研磨，干法装柱，干法上样，进行硅胶玻璃柱层析，以乙酸乙酯-甲醇溶液为洗脱液按照乙酸乙酯-甲醇体积比为1:0，2:1，1:1，依次进行梯度洗脱，经TLC及HPLC(色谱柱：安捷伦10Prep-C1830mm*150mm，以甲醇-水为流动相，流速为4ml/min，检测波长为254nm)检测合并相同部分，收集乙酸乙酯-甲醇体积比为2:1和1:1的流份，合并干燥，得流份A；收集乙酸乙酯-甲醇体积比为1:0的流份，进行干燥，得流份B；
S4、将步骤S3所得流份A按照质量比为1:1与硅胶(200～300目)充分混合研磨，干法装柱，干法上样，进行硅胶柱玻璃柱层析，以体积比为1：0的乙酸乙酯-甲醇溶液为洗脱液，进行洗脱，干燥，得流份A-1；
S5、将步骤S4所得流份A-1经中压制备色谱(碳十八柱，规格为36mm*460mm，粒径为40～63um，流速为20ml/min，检测波长为210nm)进行分离纯化，以体积比为20:80的水-甲醇溶液为洗脱液，进行洗脱，收集流份，进行干燥；
S6、将步骤S3所得流份B经半制备液相色谱(色谱柱：安捷伦10Prep-C1830mm*150mm，流速为4ml/min，检测波长为254nm)进行分离纯化，以体积比为8:92的水-甲醇溶液为洗脱液，进行洗脱，收集流份，进行干燥；
S7、S5所得产物、S6所得产物或合并S5和S6所得产物，即为具有抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症活性的龙眼肉提取物。
经过上述提取方法，得到富集化合物1或/和化合物2的龙眼肉提取物，所得龙眼肉提取物能够抑制乙酰胆碱酯酶的活性。
实施例4具有抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症活性的龙眼肉提取物
提取方法如下：
S1、取龙眼肉饮片1kg，置具塞锥形瓶中，按照质量体积比为1:10(kg/L)加入90vol％的乙醇10L，于80℃加热回流0.8h，冷却，摇匀，过滤，取滤液浓缩得相对密度为1.2的粗浸膏；
S2、将步骤S1所得粗浸膏加入80vol％乙醇醇沉2次，过滤，取滤液于50℃下进行减压浓缩后，进行冷冻干燥，获得冻干干膏；
S3、将步骤S3所得冻干干膏按照质量比为1:2与硅胶(80～100目)充分混合研磨，干法装柱，干法上样，进行硅胶玻璃柱层析，以乙酸乙酯-甲醇溶液为洗脱液按照乙酸乙酯-甲醇体积比为1:0，2:1，1:1，依次进行梯度洗脱，经TLC及HPLC(色谱柱：安捷伦10Prep-C1830mm*150mm，以甲醇-水为流动相，流速为4ml/min，检测波长为254nm)检测合并相同部分，收集乙酸乙酯-甲醇体积比为2:1和1:1的流份，合并干燥，得流份A；收集乙酸乙酯-甲醇体积比为1：0的流份，进行干燥，得流份B；
S4、将步骤S3所得流份A按照质量比为1：1与硅胶(200～300目)充分混合研磨，干法装柱，干法上样，进行硅胶玻璃柱层析，以乙酸乙酯溶液为洗脱液进行洗脱，得流份A-1；
S5、将步骤S4所得流份A-1经中压制备色谱(碳十八柱，规格为36mm*460mm，粒径为40～63um，流速为20ml/min，检测波长为210nm)进行分离纯化，以体积比为20:80的水-甲醇溶液为洗脱液，进行洗脱，收集流份，进行干燥；
S6、将步骤S3所得流份B经半制备液相色谱(色谱柱：安捷伦10Prep-C1830mm*150mm，流速为4ml/min，检测波长为254nm)进行分离纯化，以体积比为8:92的水-甲醇溶液为洗脱液，进行洗脱，收集流份，进行干燥；
S7、S5所得产物、S6所得产物或合并S5和S6所得产物，即为具有抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症活性的龙眼肉提取物。
经过上述提取方法，得到富集化合物1或/和化合物2的龙眼肉提取物，所得龙眼肉提取物能够抑制乙酰胆碱酯酶的活性。
实施例5具有抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症活性的龙眼肉提取物
提取方法如下：
S1、取龙眼肉饮片1kg，置具塞锥形瓶中，按照质量体积比为1:9(kg/L)加入甲醇9L，于55℃加热回流1h，冷却，摇匀，过滤，取滤液浓缩得相对密度为0.95的粗浸膏；
S2、将步骤S1所得粗浸膏加入60vol％乙醇醇沉2次，过滤，取滤液于55℃下进行减压浓缩后，进行冷冻干燥，获得冻干干膏；
S3、将步骤S3所得冻干干膏按照质量比为1:2与硅胶(80～100目)充分混合研磨，干法装柱，干法上样，进行硅胶玻璃柱层析，以乙酸乙酯-甲醇溶液为洗脱液按照乙酸乙酯-甲醇体积比为1:0，2:1，1:1，依次进行梯度洗脱，经TLC及HPLC(色谱柱：安捷伦10Prep-C1830mm*150mm，以甲醇-水为流动相，流速为4ml/min，检测波长为254nm)检测合并相同部分，收集乙酸乙酯-甲醇体积比为2:1和1:1的流份，合并干燥，得流份A；收集乙酸乙酯-甲醇体积比为1：0的流份，进行干燥，得流份B；
S4、将步骤S3所得流份A按照质量比为1：1与硅胶(200～300目)充分混合研磨，干法装柱，干法上样，进行硅胶玻璃柱层析，以乙酸乙酯溶液为洗脱液进行洗脱，得流份A-1；
S5、将步骤S4所得流份A-1经中压制备色谱(碳十八柱，规格为36mm*460mm，粒径为40～63um，流速为20ml/min，检测波长为210nm)进行分离纯化，以体积比为20:80的水-甲醇溶液为洗脱液，进行洗脱，收集流份，进行干燥；
S6、将步骤S3所得流份B经半制备液相色谱(色谱柱：安捷伦10Prep-C1830mm*150mm，流速为4ml/min，检测波长为254nm)进行分离纯化，以体积比为8:92的水-甲醇溶液为洗脱液，进行洗脱，收集流份，进行干燥；
S7、S5所得产物、S6所得产物或合并S5和S6所得产物，即为具有抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症活性的龙眼肉提取物。
经过上述提取方法，得到富集化合物1或/和化合物2的龙眼肉提取物，所得龙眼肉提取物能够抑制乙酰胆碱酯酶的活性。
实施例6具有抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症活性的龙眼肉提取物
与实施例3的区别在于，步骤S1中，将80vol％的乙醇替换为异丙醇。
其他步骤与参数参考实施例3。
经过上述提取方法，得到富集化合物1或/和化合物2的龙眼肉提取物，所得龙眼肉提取物能够抑制乙酰胆碱酯酶的活性。
实施例7具有抑制乙酰胆碱酯酶、防治阿尔兹海默症活性的龙眼肉提取物
与实施例3的区别在于，步骤S1中，将80vol％的乙醇替换为正丁醇。
其他步骤与参数参考实施例3。
经过上述提取方法，得到富集化合物1或/和化合物2的龙眼肉提取物，所得龙眼肉提取物能够抑制乙酰胆碱酯酶的活性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种主含化合物1的龙眼果肉提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将龙眼肉经醇提、醇沉制成的干膏，进行硅胶柱层析：以体积比为（1-2）：1的乙酸乙酯-甲醇溶液为洗脱液进行洗脱，得流份A；将流份A进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯为洗脱液进行洗脱，得流份A-1；再将流份A-1经中压制备色谱进行分离纯化，以体积比为20:80的水-甲醇溶液为洗脱液进行洗脱，洗脱液进行干燥，得到主含化合物1的龙眼果肉提取物；
其中，所述化合物1的结构如下所示：
；
所述龙眼肉经醇提、醇沉制成的干膏的制备方法包括如下步骤：
S1、取龙眼肉加入醇类溶剂，加热回流，冷却，摇匀，过滤，取滤液减压浓缩得粗浸膏；
S2、将步骤S1所得粗浸膏加入60~95vol%乙醇醇沉，过滤，取滤液进行减压浓缩后干燥，获得冻干干膏；
所述中压制备色谱使用的色谱柱为碳十八色谱柱。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述洗脱液乙酸乙酯-甲醇溶液为1：1的乙酸乙酯-甲醇溶液和/或2：1的乙酸乙酯-甲醇溶液。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述醇类溶剂为乙醇、甲醇、异丙醇、正丁醇中的任意一种或多种。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述龙眼肉与醇类溶剂的质量体积比为1：8~10（kg/L）。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述加热回流的温度为50~80℃。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述粗浸膏的相对密度为0.9~1.2。
7.一种主含化合物2的龙眼果肉提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将龙眼肉经醇提、醇沉制成的干膏，进行硅胶柱层析：以乙酸乙酯为洗脱液，得流份B；将流份B经半制备液相色谱进行分离纯化，以体积比为8:92的水-甲醇溶液为洗脱液，进行洗脱，洗脱液进行干燥，得到主含化合物2的龙眼果肉提取物；
其中，所述化合物2的结构如下所示：
；
所述龙眼肉经醇提、醇沉制成的干膏的制备方法包括如下步骤：
S1、取龙眼肉加入醇类溶剂，加热回流，冷却，摇匀，过滤，取滤液减压浓缩得粗浸膏；
S2、将步骤S1所得粗浸膏加入60~95vol%乙醇醇沉，过滤，取滤液进行减压浓缩后干燥，获得冻干干膏；
所述半制备液相色谱使用的色谱柱为碳十八反相色谱柱。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述醇类溶剂为乙醇、甲醇、异丙醇、正丁醇中的任意一种或多种。
9.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述龙眼肉与醇类溶剂的质量体积比为1：8~10（kg/L）。
10.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述加热回流的温度为50~80 ℃。
11.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述粗浸膏的相对密度为0.9~1.2。
12.一种主含化合物1和化合物2的龙眼果肉提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：合并权利要求1~6任一项所述制备方法得到的主含化合物1的龙眼果肉提取物和权利要求7~11任一项所述制备方法得到的主含化合物2的龙眼果肉提取物，所得即为主含化合物1和化合物2的龙眼果肉提取物；
其中，所述化合物1和化合物2的结构如下所示：
。
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