CN117716228A - 基于偏振各向异性测量的用于检测和测量目标物质的方法以及用于该方法的颗粒 - Google Patents

基于偏振各向异性测量的用于检测和测量目标物质的方法以及用于该方法的颗粒 Download PDF

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Abstract

本发明解决了提供以高检测灵敏度测量目标物质的方法和试剂盒的问题。提供了测量样品液体中目标物质存在与否和目标物质浓度中的至少任一者的方法，该方法包括以下步骤：(a)制备与目标物质特异性结合并且含有稀土络合物的第一颗粒和具有比第一颗粒更大的平均粒径并且与目标物质特异性结合的第二颗粒；(b)将样品液体、第一颗粒和第二颗粒混合以提供混合液体；和(c)从步骤(b)中获得的混合液体的偏振各向异性来确定目标物质的存在与否和目标物质浓度中的至少任一者。

Description

基于偏振各向异性测量的用于检测和测量目标物质的方法以 及用于该方法的颗粒
技术领域
本发明涉及检测和测量待测样品中的目标物质的方法，并涉及用于该方法的颗粒。
背景技术
在医疗和临床检查领域，需要对来自例如血液或采集的器官部分的痕量生物成分的高灵敏度检测以探究疾病的起因。在用于生物成分的检测技术中，广泛使用免疫测定法。作为免疫测定法之一，已知采用抗原-抗体反应的胶乳凝集法。“胶乳凝集法”是如下的方法：其旨在检测液体样品例如生物样品中的抗原，并且其包括将其上承载有例如特异性结合抗原的抗体的胶乳与液体样品混合，并测量胶乳凝集的程度，由此检测或量化所述抗原。
在胶乳凝集法中，抗原被与胶乳结合的抗体捕获，并且多个胶乳颗粒经由捕获的抗原交联，结果是发生凝集。即，可通过评价胶乳的凝集程度来量化液体样品例如生物样品中的抗原的量。可通过评价透射穿过液体样品或被液体样品散射的光量的变化来量化凝集程度。
胶乳凝集法可以以简单且快速的方式定量评价抗原，但是涉及问题，因为当液体样品例如生物样品中的抗原量低时不能检测到抗原。
为了改进检测灵敏度，可想到用包括以较高灵敏度检测发光特性的方法代替用于散射透射光的系统。特别地，已提出了例如利用荧光消偏振法的试样检查方法(专利文献1至3)。
在专利文献1中，提出了改进用于荧光消偏振法的装置以便临床使用。荧光消偏振法不需要测量物质和未反应的发光物质之间的初步分离，即被称作束缚/自由(B/F)分离的冲洗步骤，这在通常的荧光测量方法中是需要的。因此，可如同在胶乳凝集法中那样进行简单的试样检查。
此外，认为可通过与在胶乳凝集法中相同的测试系统来进行测量，在测量过程中仅混合与测量物质特异性反应的发光物质。然而，在专利文献1中提出了使用单分子例如荧光素作为发光材料，其原则上仅可应用于药物、低分子量抗原等。
在专利文献2中，为了能够检测高分子量物质例如蛋白质(在专利文献1中这是困难的)，提出了使用通过将具有长发光寿命的染料吸附到胶乳颗粒上获得的材料。在专利文献2中，提出了基于荧光消偏振法的原理通过平衡由于粒径增加所致液体中物质的旋转布朗运动的减少和发光寿命的长度来进行高分子量物质的测量。然而，出于抑制非特异性吸附的目的，作为生物分子的牛血清白蛋白(BSA)承载在颗粒的表面上，并由此可以由于展宽的颗粒尺寸分布和BSA(其为蛋白质)而发生批与批的差异。因此，很难说实现了极高灵敏度的抗原检测。
在专利文献3中，提出了通过抗原-抗体反应使荧光标记和目标抗原竞争性地吸附到大颗粒上从而进行测量的方法。然而，在该方法中，一个抗体与一个荧光标记反应，因此难以以高灵敏度掌握偏振程度的变化。
[引用文献列表]
[专利文献]
专利文献1:日本专利公开号H03-52575
专利文献2:日本专利号2893772
专利文献3:日本专利申请公开号H03-103765
发明概述
[技术问题]
鉴于这样的背景技术做出了本发明，并且本发明的目标是基于偏振各向异性的变化提供一种高灵敏度测量方法和检查试剂盒。具体地，提供了通过提高偏振各向异性的变化更灵敏地掌握反应的技术。
[问题的解决方案]
本发明提供一种确定样品液体中的目标物质的存在与否和目标物质浓度中的至少任一者的方法，该方法包括以下步骤：
(a)制备与目标物质特异性结合并且含有稀土络合物的第一颗粒，和平均粒径大于第一颗粒并且与目标物质特异性结合的第二颗粒；
(b)将样品液体、第一颗粒和第二颗粒混合以提供混合液体；和
(c)从步骤(b)中获得的混合液体的偏振各向异性确定目标物质的存在与否和目标物质浓度中的至少任一者。
本发明还提供包括第一颗粒和第二颗粒的检查试剂盒及其制造方法。
[发明的有益效果]
根据本发明，可通过使用偏振光测量以高灵敏度检测液体中颗粒的凝集，并因此能够以高灵敏度测量目标物质。特别地，能够从颗粒在液体中凝集时检测到的偏振各向异性的变化更灵敏地掌握反应。
另外，提供了通过在颗粒的表面上形成亲水层在不使用BSA等的情况下各自对非特异吸附具有高抑制作用的颗粒。因此，本发明的颗粒更有利地用于基于偏振各向异性的测量，能够以甚至更高的灵敏度测量。
附图说明
图1是说明根据本发明实施方案的测量方法的视图。
实施方案描述
以下详细描述本发明的优选实施方案。然而，所述实施方案不意图限制本发明的范围。
作为一种实施方案，本发明提供确定样品液体中的目标物质存在与否和目标物质浓度中的至少任一者的方法，该方法包括以下步骤：
(a)制备与目标物质特异性结合并且含有稀土络合物的第一颗粒和平均粒径大于第一颗粒并且与目标物质特异性结合的第二颗粒；
(b)将样品液体、第一颗粒和第二颗粒混合以提供混合液体；和
(c)从步骤(b)中获得的混合液体的偏振各向异性确定目标物质的存在与否和目标物质的浓度中的至少任一者。
偏振各向异性是显示由使用偏振光照射的物体所发射的发光保持所照射的偏振光的方向上的分量的倾向的指数。按如下所述定义偏振各向异性。即，偏振各向异性是显示通过用偏振光照射从而激发发光物质所产生的发光的偏振光分量(该分量与作为入射光的偏振光平行)的发光强度和在其垂直的方向上的偏振光分量的发光强度之间的关系。更具体地，偏振各向异性是由振动方向平行于给定偏振光的振动方向的发光分量的发光强度计算的值，当通过偏振光激发发光物质时确定该发光强度。此外，偏振各向异性是表示如下比率的值：在被第一偏振光束激发时具有的振动方向平行于第一偏振光束的振动方向的发光分量的发光强度和在被第一偏振光束激发时具有的振动方向垂直于第一偏振光束的振动方向的发光分量的发光强度之间的差值与发光强度总和的比率。可以使用以下校正该偏振各向异性：在被第二偏振光束激发时具有的振动方向垂直于第二偏振光束的振动方向的发光分量的发光强度(所述第二偏振光束的振动方向垂直于第一偏振光束的振动方向)和在被第二偏振光束激发时具有的振动方向平行于第二偏振光束的振动方向的发光分量的发光强度(所述第二偏振光束的振动方向垂直于第一偏振光束的振动方向)之间的比率；和其他常数。
更具体地，偏振各向异性以下列方程1中的<r>表示：
[数1]
其中
<r>表示偏振各向异性，
IVV表示在被第一偏振光束激发时具有的振动方向平行于第一偏振光束的振动方向的发光分量的发光强度，
IVH表示在被第一偏振光束激发时具有的振动方向垂直于第一偏振光束的振动方向的发光分量的发光强度，
IHV表示在被第二偏振光束激发时具有的振动方向垂直于第二偏振光束的振动方向的发光分量的发光强度，所述第二偏振光束的振动方向垂直于第一偏振光束的振动方向，
IHH表示在被第二偏振光束激发时具有的振动方向平行于第二偏振光束的振动方向的发光分量的发光强度，所述第二偏振光束的振动方向垂直于第一偏振光束的振动方向，和
G表示校正值。
通过例如将偏光器布置在光的入射侧上，用第一偏振光束激发物体。当使用布置在检测侧上的偏光器在入射侧上的偏光器的平行方向上测量发光的强度时，可测量振动方向平行于第一偏振光束的振动方向的发光分量的发光强度(即IVV)。同时，当使用设置在检测侧上的偏光器在与入射侧上的偏光器垂直的方向上测量发光的强度时，可测量振动方向垂直于第一偏振光束的振动方向的发光分量的发光强度(即IVH)。
在获得第一偏振光束时,通过将偏光器布置在光的入射侧上在与其垂直的方向上(即用第二偏振光束)激发物体。当使用布置在检测侧上的偏光器在入射侧上的偏光器的平行方向上测量发光强度时，可测量振动方向平行于第二偏振光束的振动方向的发光分量的发光强度(即IHV)。同时，当使用设置在检测侧上偏光器在与入射侧上的偏光器垂直的方向上测量发光强度时，可测量振动方向与第二偏振光束的振动方向垂直的发光分量的发光强度(即IHH)。
另外，偏振各向异性可由以下方程2中的<r′>表示。
[数2]
每个符号与方程(1)中的相同。
关于偏振各向异性的测量条件，例如优选的是，在温度为0℃至50℃且液体粘度为0.5mPa·s至50mPa·s的液体中进行测量。当发光试剂是各自含有稀土络合物的颗粒时，优选以设置为0.001mg/ml至0.1mg/ml的发光试剂浓度来进行测量，并且激发波长优选为500nm至700nm。
另外，作为一种实施方案，本发明提供了确定目标物质的存在与否和目标物质浓度中的至少任一者的检查试剂盒。
该检查试剂盒包括第一颗粒和第二颗粒，并且第一颗粒与目标物质特异性结合并且含有稀土络合物。第二颗粒具有比第一颗粒更大的平均粒径，并且与目标物质特异性结合。
措辞“与目标物质特异性结合”是指具有与目标物质特异性相互作用的性质，特别优选是指具有与目标物质特异性结合的能力。作为结合机制，可以有静电相互作用、范德瓦耳斯相互作用和通过氢键的相互作用等。第一颗粒和第二颗粒可以在结合目标物质的位点或机制方面彼此相同或不同。
任何物质可充当目标物质，只要该物质显示与一些物质的相互作用。
目标物质的实例可包括抗原、抗体、低分子量化合物、各种受体、酶、底物(substrate)、核酸、细胞因子、激素、神经递质、传递素(transmi t ter)和膜蛋白。抗原的实例包括过敏原、细菌、病毒、细胞、细胞膜成分、癌标记物、各种疾病标记物、抗体、血液衍生物质、食物衍生物质、天然产品衍生物质、和任何低分子量化合物。核酸的实例包括：源自于细菌、病毒、或细胞的DNA、RNA或cDNA，它们的一部分或片段，合成核酸，引物，以及探针(probe)。低分子量化合物的实例包括细胞因子、激素、神经递质、传递素、膜蛋白和它们的受体。
第一颗粒含有稀土络合物，并具有发光性质。即，第一颗粒具有当用激发波长照射时显示发光的性质。第一颗粒的稀土络合物是具有发光性质的稀土络合物。其优选实例可包括铕、铽、钕、铒、钇、镧、铈、钐、钆、镝、铥、镱、和钪的络合物。稀土络合物的发光具有长寿命。偏振各向异性取决于发光时间期间发光材料的旋转运动的改变，并因此优选使用具有长发光寿命的稀土络合物作为发光物质。
第一颗粒和第二颗粒经由目标物质形成凝集体。期望的是第一颗粒在与样品液体混合之前具有相对低的偏振各向异性，即待测量的偏振各向异性低，并且发生荧光的消偏振。
同时，当颗粒经由目标物质凝集在一起时，偏振各向异性变得相对高。即，期望的是荧光消偏振的一部分(或全部)被去除。
第一颗粒和第二颗粒经由目标物质在分散介质中形成凝集体。也可发生第一颗粒之间的凝集，以及第二颗粒之间的凝集。与分散介质中出现未凝集的第一颗粒的偏振各向异性相比，分散介质中出现凝集体的偏振各向异性优选提高。偏振各向异性优选提高0.004以上、更优选提高0.01以上、更加优选提高0.02以上。
在分散介质中第一颗粒显示优选0.2以下、更优选0.1以下、更加优选0.12以下的偏振各向异性。
另外，在分散介质中凝集体显示优选0.05以上、更优选0.09以上、更加优选0.13以上的偏振各向异性。
另外，测量所用的第一颗粒和第二颗粒在分散介质中优选占总共0.000001质量％至1质量％，并且它们的重量比优选处在1:9至9:1的范围内。
在确定偏振各向异性的测量中，可通过将偏光器例如偏振滤镜布置在光的入射侧上从而发射偏振的激发光(第一偏振光束)。当在与上述垂直的方向上布置偏振滤镜时，可发射具有与第一偏振光束的振动方向垂直的振动方向的第二偏振光束。当在检测侧上以与入射侧上的偏光器的平行方向布置偏光器时，可测量具有的振动方向平行于激发侧上的振动方向的发光分量的发光强度。当在检测侧上以与入射侧上的偏光器垂直的方向布置偏光器时，可测量具有的振动方向垂直于激发光的振动方向的发光分量的发光强度。可使用分光光度计等测量发光强度。
优选在分散介质中以0℃至100℃范围内的任一温度进行测量。更优选在4℃至50℃的范围内进行测量。另外，溶液优选是水性溶剂，并且例如是缓冲溶液、生理盐水或水。
本领域技术人员可以适当设置测量的条件，本文随后要描述的实施例等可提到设置条件，但是条件不限于此。
为了在颗粒的凝集前后产生足够的偏振各向异性变化，期望第一颗粒不过大。同时，当第一颗粒过小时，可能出现的问题在于：经由目标物质的凝集不会充分发生，或者不显示充分的发光性质，或制造的问题。第一颗粒的平均粒径优选为10nm以上且1μm以下。即，第一颗粒的平均粒径优选为1微米(μm)以下、更优选500nm以下、更加优选400nm以下、更加优选250nm以下。第一颗粒的平均粒径优选为10nm以上、更优选20nm以上、更加优选50nm以上。本文使用的术语“平均粒径”是指数均颗粒直径，并且可通过动态光散射法来测量平均粒径。
第一颗粒优选具有小的颗粒尺寸分布，并且优选具有0.1以下的pdi。另外，第一颗粒可含有聚苯乙烯和具有硅氧烷键的聚合物，并且含有在第一颗粒表面中的亲水聚合物。另外，第一颗粒可在颗粒表面上具有含亲水聚合物的层，所述亲水聚合物含有醚、甜菜碱和吡咯烷酮环中的任一种。当颗粒表面中含有亲水聚合物时，非特异性吸附被抑制。当不使用蛋白质等而是使用上述的亲水聚合物进行非特异性吸附的抑制时，颗粒尺寸分布被抑制，因此第一颗粒更有利地用于基于偏振各向异性的测量。
第二颗粒是指具有比第一颗粒更大的平均粒径并对目标物质具有亲和力的颗粒。第二颗粒优选具有100nm以上且5μm以下的平均粒径。即，关于第二颗粒的平均粒径的下限，为了使凝集体的偏振各向异性足够大，下限优选为100nm以上、更优选150nm。从例如颗粒的分散稳定性的观点，上限优选为5μm以下、更优选1μm以下。
另外，第二颗粒优选具有小的颗粒尺寸分布，并优选具有0.1以下的pdi。第二颗粒可含有聚苯乙烯和具有硅氧烷键的聚合物，并且含有在第二颗粒的表面上的亲水聚合物。另外，第二颗粒可具有在颗粒表面上的含亲水聚合物的层，所述亲水聚合物含有醚、甜菜碱和吡咯烷酮环中的任一种。当颗粒表面中含有亲水聚合物时，非特异性吸附被抑制。当不使用蛋白质等而是使用如上所述的亲水聚合物进行非特异性吸附的抑制时，颗粒尺寸分布被抑制，因此第二颗粒更有利地用于基于偏振各向异性的测量。
可采用这样的配置使得第一颗粒的激发波长和第二颗粒的激发波长彼此不同，或第一颗粒的发光波长和第二颗粒的发光波长彼此不同。作为替代，可采用这样的配置使得第一颗粒的激发波长和第二颗粒的激发波长彼此不同，并且第一颗粒的发光波长和第二颗粒的发光波长彼此不同。即，第二颗粒可在不同于第一颗粒的激发波长下产生发光，并且可在不同于第一颗粒的发光波长下产生发光。当第二颗粒具有不同于第一颗粒的发光特性时，可进行多维测量，其涉及例如在多种波长下的激发或者在多种波长下的发光的观察。
同时，期望的是，不在适合于激发第一颗粒的波长下激发第二颗粒。特别地，第二颗粒优选不被波长为300nm以上且450nm以下的激发光激发。
另外，第二颗粒优选不产生与第一颗粒重叠的发光。特别地，第二颗粒优选没有在从550nm以上至650nm以下的波长区域中的发光最大值。
第一颗粒和第二颗粒可各自具有配体以便对目标物质具有亲和力。对特定物质显示亲和力的任何配体可用作所述配体。配体和目标化合物、或目标化合物和配体的组合的实例可包括以下。即，实例可包括：抗原和抗体；低分子量化合物及其受体；酶和底物；和彼此互补的核酸。此外，实例可包括抗体和对其具有特异性的以下物质中的任何：过敏原、细菌、病毒、细胞、细胞膜成分、癌标记物、各种疾病标记物、抗体、血液衍生物质、食物衍生物质、天然产品衍生物质和任何低分子量化合物。此外，实例可包括受体和对其具有特异性的以下物质中的任何：低分子量化合物、细胞因子、激素、神经递质、传递素、和膜蛋白。此外，实例可包括源自于细菌、病毒、或细胞的DNA、RNA或cDNA，它们的一部分或片段，合成核酸，引物，或探针，和与其具有互补性的核酸。除了上述之外，使用已知的具有亲和力的组合作为目标物质和配体的组合。配体的特别典型的实例可包括抗原、抗体和核酸。
可以按如下方式将配体引入第一颗粒或第二颗粒。即，在形成了颗粒的基质或用于形成其表面的层之后，可经由所述基质或层具有的官能团结合配体。作为替代，可在制造颗粒的基质或用于形成其表面的层时纳入配体。有待用于胶乳凝集法等的配体可转变并用作配体。
作为另一实施方案，本发明还提供了检查试剂盒，其特征在于第一颗粒和第二颗粒分散在分散介质中。本发明还提供了制造所述检查试剂盒的方法，该方法包括将第一颗粒和第二颗粒分散在分散介质中的步骤。所述检查试剂盒可包封在壳体中。
作为一种实施方案，本发明还提供了制造第一颗粒的方法，该方法包括至少第一步骤和第二步骤。在第一步骤中，将稀土络合物、包括苯乙烯的自由基聚合性单体、自由基聚合引发剂和包含具有吡咯烷酮环的单元的聚合物与水性介质混合以便制备乳液。在第二步骤中，通过搅拌第一步骤中获得的乳液使所述自由基聚合性单体聚合。
与目标物质结合的颗粒有时被称作“亲和颗粒”，显示发光的颗粒有时被称作“发光颗粒”，以及具有相对大的平均粒径的颗粒有时被称作“大粒径颗粒”。具有发光性质并与目标物质结合的颗粒有时被称作“发光亲和颗粒”。另外，具有相对大平均粒径并且与目标物质结合的颗粒有时被称作“大粒径亲和颗粒”。第一颗粒和第二颗粒在本发明中分别对应于发光亲和颗粒和大粒径亲和颗粒。
通过减小颗粒的颗粒尺寸分布并将发光稀土络合物引入颗粒，可掌握液体中的颗粒分散状态的微小变化作为偏振发光特性的变化。即，当具有亲和力的颗粒以将目标物质夹在其间(发生夹心型反应)的方式凝集时，产生颗粒的旋转布朗运动的变化。这可被理解为偏振各向异性的变化。根据这种方法，即使在溶液中的量为约纳克/mL至约皮克/mL，也能够检测所述目标物质。
稀土络合物能够发射偏振光，该偏振光是具有长寿命的磷光。偏振各向异性与发光染料的跃迁矩(跃迁偶极矩)的各向异性有关。在具有跃迁矩的各向异性的发光染料的情形中，当沿其跃迁矩的偏振光被用作激发光时，其发光也是沿着跃迁矩的偏振光。在稀土络合物的情形中，当具有各向异性的配体被激发时，显示出基于从配体向中心金属离子的能量转移的荧光发光，因此当用偏振光激发配体时发射偏振光。
荧光消偏振的原理是测量在偏振发光的发生期间基于发光材料的旋转运动的跃迁矩的偏移。发光材料的旋转运动可由方程3表示：
Q＝3Vη/kT…(方程3)
其中Q表示材料的旋转弛豫时间，V表示材料的体积，η表示溶剂的粘度，“k”表示玻尔兹曼常数，以及T表示绝对温度。
材料的旋转弛豫时间是分子旋转角度θ(68.5°)需要的时间段，其中cosθ＝1/e。
从方程3发现：发光材料的旋转弛豫时间与材料的体积(即粒径的立方)成比例。同时，在荧光消偏振中，材料的发光寿命和偏振程度之间的关系可由方程4表示：
p0/p＝1+A(τ/Q)…(方程4)
其中p0表示当材料为平稳时(Q＝∞)的偏振程度，“p”表示偏振程度，A表示常数，τ表示材料的发光寿命，以及Q表示旋转弛豫时间。
根据方程3和4，为了使待测量的偏振程度的变化大，发光材料的发光寿命和它的旋转弛豫时间即发光材料的体积(粒径)之间的关系是重要的，并且随着发光材料的粒径增加，也需要延长发光寿命。
当实验测定由方程4表示的发光的偏振程度时，适当的是允许偏振光进入样品，并且在关于激发光的行进方向和振动方向为90°方向上检测发光。在这种情况下，适当的是通过分成相对于作为入射光的偏振光的平行方向和垂直方向上的偏振光分量来检测被检测的光，并且根据方程5来评价：
r(t)＝(I∥(t)-GI⊥(t))/(I∥(t)+2GI⊥(t))…(方程5)
其中r(t)表示时间“t”时的偏振各向异性，I∥(t)表示时间“t”时的与激发光平行的发光分量的发光强度，I⊥(t)表示时间“t”时的与激发光垂直的发光分量的发光强度，以及G表示校正值，用具有的振动方向与用于样品测量的激发光的振动方向差90°的激发光来测量I⊥/I∥的比率。
即，当颗粒(或凝集体)尺寸和发光寿命落入适当范围内时，可灵敏地读取通过例如抗原-抗体反应等的发光材料的尺寸变化作为偏振各向异性的值。偏振各向异性是指用G和2G校正的值，并且偏振程度是通过从方程5去除G和2G获得的值。在实际测量中，需要校正值G，由此确定偏振各向异性。
作为材料设计，适宜的是第一颗粒小，并且通过与目标物质的反应随着偏振各向异性变得更饱和，颗粒尺寸增加。然而，当使用仅一种类型的颗粒进行夹心型抗原-抗体反应时，反应后形成的颗粒的尺寸受到限制。当增加第一颗粒的尺寸以便增加偏振各向异性时，反应前的各向异性增加，并且偏振各向异性的变化终究不能增加。
鉴于上述，已关注于以下事实：当可在第一颗粒和具有比第一颗粒更大的平均粒径的第二颗粒之间进行夹心型反应时，反应前后的偏振各向异性差异增加。
(颗粒的详述)
参考附图详细描述根据该实施方案的颗粒的实例。
(第一颗粒1)
根据该实施方案的第一颗粒(发光亲和颗粒)1具有小的颗粒尺寸分布，并且颗粒表面被亲水涂覆。颗粒内部存在发光稀土络合物。
图1是用于说明根据该实施方案的第一颗粒和第二颗粒的实例的示意图。在图1中，示出颗粒是球形的实例。第一颗粒的直径(平均粒径)为优选为10nm以上、或20nm以上、更优选25nm以上，并且优选为1μm以下、更优选400nm以下。该实施方案中的第一颗粒的平均粒径特别优选为20nm以上且400nm以下。颗粒尺寸分布优选更均匀。例如，可适宜地使用具有如通过动态光散射法测量的多分散性指数(下文简写为“pdi”)为0.1以下的颗粒。
可以通过用激光照射溶液中分散的颗粒并且使用光子检测器观察产生的散射光来测定pdi。颗粒通过布朗运动不断地移动，由此基于散射光的干涉的强度分布也不断地波动。动态光散射法是用于观察作为散射光强度波动的布朗运动状态的颗粒测量方法。散射光相对于时间的波动表示为自相关函数，并确定平移扩散系数。由确定的扩散系数确定斯托克斯直径，并且可导出溶液中分散的颗粒各自的尺寸。另外，当自相关函数经历累积量分析时，可测定累积量直径和pdi。pdi指示颗粒尺寸分布的多分散性，并且它的数值越小表明颗粒尺寸分布越均匀。大体上，认为具有pdi为0.1以下的颗粒单分散在溶剂中。
根据该实施方案的第一颗粒1适宜具有0.1或更小的pdi。为了稳定地调节pdi为0.1或更小，期望在颗粒的表面上不提供非特异性吸附抑制剂。同时，为了本发明的目的，需要防止除目标物质以外的物质非特异性吸附到颗粒上，因此，需要用于保持颗粒表面亲水的涂层。
同时，通过为上述目的而通常进行的BSA承载难以将pdi稳定地保持为0.1以下。另外，BSA的承载可引起批次间的变化。鉴于此，需要这样的涂层，其通过使用亲水性聚合物使得颗粒尺寸的pdi变为0.1以下。
根据该实施方案的第一颗粒优选具有10nm以上且1μm以下的直径。该直径更适宜为20nm以上且500nm以下。此外，该直径更适宜为50nm以上且400nm以下，并且该直径更加适宜为50nm以上且250nm以下。当平均粒径大于1μm时，凝集之前的偏振各向异性提高从而减小与凝集反应之后的偏振各向异性的差异。另外，当平均粒径小于10nm时，每颗粒的体积减小从而减小可纳入的稀土络合物的量，结果是在一些情况下没有获得测量所需的发光强度。
(颗粒基质2)
颗粒基质2是指第一颗粒1的核心部分。颗粒基质2优选具有球形形状或与其接近的形状。颗粒基质2的材料没有特别规定，只要该材料可稳定含有稀土络合物。作为颗粒基质，具体地，可适宜地使用例如以下颗粒：通过聚合苯乙烯单体作为主要成分而获得的聚苯乙烯颗粒，或通过将具有硅氧烷键的聚合物纳入聚苯乙烯颗粒而获得的颗粒。可以通过下文描述的乳液聚合法制造聚苯乙烯颗粒作为具有极均匀颗粒尺寸分布的颗粒。另外，可经由具有硅氧烷键的聚合物中存在的硅醇来提供下文描述的亲水涂层或配体。
(亲水层3)
亲水层3形成于颗粒基质2的外侧上并且包括含有亲水基团的分子或聚合物。“含有亲水基团的分子”意指具有羟基基团、醚、吡咯烷酮、甜菜碱结构等的分子或聚合物。具体地，亲水层3可含有例如以下作为主要成分：聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、硫代甜菜碱或磷代甜菜碱的聚合物、或聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(其分子具有用羟基基团通过使缩水甘油基基团开环而改性的端部)。可通过使用硅烷偶联剂等在氧化硅颗粒1的表面上以各自具有亲水基团的单分子来提供亲水层3，或者如随下所述，可与颗粒基质2的合成同时形成亲水层。对亲水层3的厚度没有限制，并且仅需要能够表现出亲水性。然而，当亲水层过厚时，亲水层可变为水凝胶状并且通过溶剂中的离子的影响而水合，从而通过厚度变化导致其不稳定。亲水层的厚度适宜为1nm以上且50nm以下。
(稀土络合物4)
发光稀土络合物优选用作本发明的发光染料，因为具有以下特征：其发光的波长和强度几乎不受周围环境影响，因此发光具有长的寿命。稀土络合物4包括稀土元素和配体。稀土元素选自铕、铽、钕、铒、钇、镧、铈、钐、钆、镝、铥、镱、钪等。考虑到发光寿命和存在可见发光波长区域等，可特别适宜地使用铕或铽。例如，铕通常具有0.1ms至1.0ms的发光寿命。优选地，适当调节由方程3获得的旋转弛豫时间和发光寿命。在铕处于水分散体中的情况下，当第一颗粒的颗粒尺寸被设定成直径为约50nm至约300nm时，由方程5表示的偏振各向异性在凝集体形成前后显著改变。
稀土络合物4的构成配体中的至少一种需要是具有集光功能的配体。“集光功能”是指在特定波长下激发从而通过能量转移激发络合物的中心金属的作用。此外，具有集光功能的配体优选是具有跃迁矩各向异性的分子，并且例如，适宜使用菲咯啉。然而，具有集光功能的配体不限于此。另外，优选的是，稀土络合物4的构成配体包括诸如β-二酮的配体以防止水分子的配位。与稀土离子配位的配体(例如β-二酮)抑制因能量转移到溶剂分子等所引起的失活过程从而提供强的荧光发光。
稀土络合物4可为多核络合物，只要该络合物具有跃迁矩的各向异性。
在稀土络合物4的布朗旋转运动可被认为在介质中平稳(s tat ionary)的状态时，偏振各向异性理想地为0.1以上。布朗旋转运动可被认为平稳的状态是指颗粒的旋转弛豫时间充分长于稀土络合物4的发光寿命的状态。
(配体5)
在该实施方案中，“配体”是指与目标物质或它们的一部分特异性结合的化合物。配体对目标物质具有选择性或特异性亲和力。目标物质和配体的组合、或配体和目标物质的组合的实例包括但不限于：抗原和抗体、酶蛋白质及其底物、信号物质例如激素或神经递质，及其受体；以及核酸和另一核酸。核酸的典型实例包括脱氧核糖核酸。在图1中，在第二颗粒7和第一颗粒1中的每一者中包括配体5。
配体5可经由存在于颗粒基质2或亲水层3上并且能够结合配体的官能团结合，或者可在颗粒基质制造或亲水层形成时纳入配体。
另外，关于有待用于胶乳凝集法的已知配体，可使用类似产物作为配体5。在胶乳凝集法中引起凝集的配体也很可能有效地用于该实施方案中。
该实施方案中的配体的典型实例可包括抗体、抗原和核酸。
(目标物质6)
图1中的目标物质6是测量对象，并且是对于配体5显示亲和力并且特异性吸附至其上的物质。目标物质6可为任何物质，只要可获得与其对应的配体。目标物质的实例可包括以下。即，实例可包括：抗体、抗原、核酸、低分子量化合物、各种受体、酶和底物。此外，实例可包括任何物质，例如过敏原、细胞因子、激素、细菌、病毒、DNA、RNA、cDNA、细胞、细胞膜成分、癌标记物、各种疾病标记物、抗体、血液衍生物质、食物衍生物质和天然产品衍生物质。目标物质6与第一颗粒1和第二颗粒7中的每一种的配体5反应。因此，凝集体8经由目标物质6形成。在图1中，示意说明具有一个第二颗粒7、一个目标物质6和一个第一颗粒1的实例。实际上，第一颗粒1和第二颗粒2都具有大量配体并且与大量目标物质6结合，由此颗粒进一步与大量的第一颗粒1和/或第二颗粒结合从而形成凝集体8。
(第二颗粒7)
根据该实施方案的第二颗粒(大粒径亲和颗粒)7包括颗粒基质2、亲水层3和与第一颗粒1的配体类似的配体5，但不需要含有稀土络合物4。
第二颗粒7可具有性质类似于第一颗粒的性质，区别在于不含稀土络合物4并且颗粒尺寸不同。
随着第二颗粒7变得更大，通过凝集体形成产生偏振各向异性变化的效果变得更高。同时，当颗粒尺寸过大时，液体中的分散稳定性降低，因此颗粒可沉降。另外，当颗粒过大时，每个颗粒的光散射增强，由此偏振光可以消偏振。因此，第二颗粒7的平均粒径优选为100nm以上且5μm以下。
第二颗粒7优选没有如下程度的发光或吸附：该程度的发光或吸附会干扰在测量偏振各向异性用波长处的测量或者在显示偏振各向异性的稀土络合物4被激发的波长区域中的测量。
当使用在其中分散有根据该实施方案的第一颗粒1和第二颗粒7的液体时，可关于颗粒的凝集/分散行为以高灵敏度检测偏振发光的各向异性。因此，通过使用荧光消偏振法，可将通过使第一颗粒1和第二颗粒7分散在水性溶剂中获得的胶态液体用作高灵敏度检查试剂。可使用缓冲溶液作为水性溶剂。另外，可将表面活性剂、防腐剂、敏化剂等添加至水性溶剂中以便增强分散体的稳定性。
(发光颗粒的制造方法的实例)
接下来，描述根据该实施方案的发光颗粒的制造方法的实例。
如以下所述制造根据该实施方案的发光颗粒。将自由基聚合性单体、自由基聚合引发剂、稀土络合物和亲水聚合物与水性介质混合以制备乳液(第一步骤)。
此外，加热所述乳液以便使单体聚合(第二步骤)。
根据该实施方案的发光颗粒是通过使具有自由基聚合能力的具有双键的化合物共聚而获得的发光颗粒。
适当时，该方法可进一步包括提供用于在发光颗粒的表面上结合配体的官能团的步骤(第三步骤)。这里，可使用羧基基团、氨基基团、硫醇基团、环氧基团、马来酰亚胺基团、琥珀酰亚胺基团、或硅烷氧化物(s i l icon alkoxide)基团中的任一种作为能够结合配体的官能团
(1.自由基聚合性单体)
自由基聚合性单体可包括苯乙烯系单体。自由基聚合性单体还可包括选自由以下构成的组的单体：丙烯酸酯系单体，和甲基丙烯酸酯系单体。此类单体的实例可包括丁二烯、乙酸乙烯酯、氯乙烯、丙烯腈、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯腈和丙烯酸甲酯。除苯乙烯系单体之外，可使用选自上述单体中的至少一种。即，那些单体可单独使用或组合使用。另外，每个分子具有两个以上双键的单体例如二乙烯基苯可用作交联剂。
另外，可进一步使用含有有机硅烷的自由基聚合性单体以便将硅氧烷键纳入发光颗粒。有机硅烷化合物可为例如乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、对苯乙烯基三甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基甲基二甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基甲基二乙氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基三乙氧基硅烷或3-丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。
可使用选自那些单体中的至少一种。也就是说，可单独地使用或组合使用那些有机硅烷化合物。含有有机硅烷的自由基聚合性单体在合成的发光颗粒中形成无机氧化物的主链从而改善发光颗粒的物理和化学稳定性。此外，含有有机硅烷的自由基聚合性单体增强具有能够将发光颗粒表面上的亲水聚合物与配体结合的官能团的单元和包括苯乙烯的聚合物细颗粒用主链材料之间的亲和力。
当硅氧烷键纳入发光颗粒中时，具有硅氧烷键的单元与苯乙烯单体的比率优选为40质量％以下。
此外，使用含有有机硅烷的自由基聚合性单体可在发光颗粒的表面上提供硅醇基团。在硅醇基团和显示亲水性的聚合物(例如PV聚乙烯吡咯烷酮)之间具有氢键，聚乙烯吡咯烷酮更强地吸附至颗粒表面上。
(2.自由基聚合引发剂)
选自例如偶氮化合物和有机过氧化物的宽广范围的化合物可各自用作自由基聚合引发剂。自由基聚合引发剂的具体实例可包括：2,2'-偶氮双(异丁腈)、2,2'-偶氮双(2,4-二甲基戊腈)、2,2'-偶氮双(2-甲基丁腈)、4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)、2,2'-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐、2,2'-偶氮双(2-甲基丙酸)二甲酯、叔丁基过氧化氢、过氧化苯甲酰、过硫酸铵(APS)、过硫酸钠(NPS)和过硫酸钾(KPS)。
(3.亲水聚合物)
用于抑制非特异性吸附的亲水聚合物的实例包括亲水聚合物，其各自含有具有醚、甜菜碱、吡咯烷酮环等的单元。亲水聚合物包含在合成发光颗粒中，并且可主要存在于颗粒的表面上。作为优选实例，描述其中使用具有吡咯烷酮环(下文有时简写为“PVP”)的聚合物的情况。
可在合成颗粒时供给PVP，并且添加PVP可同时赋予颗粒非特异性吸附抑制能力和配体结合能力。PVP比自由基聚合性单体更亲水，因此PVP存在于溶剂和在合成时产生的颗粒之间的界面处。通过在聚合时包括PVP的一部分聚合物链，或通过物理/化学吸附例如吡咯烷酮环和苯乙烯(自由基聚合性单体)之间的相互作用，使PVP吸附到颗粒的表面上。
PVP的分子量优选为10,000以上且100,000以下，更适宜为40,000以上且70,000以下。当分子量小于10,000时，发光颗粒的表面的亲水性弱，因此非特异性吸附容易发生。当分子量大于100,000时，发光颗粒的表面的亲水层变得过厚，结果是发光颗粒凝胶化并且变得难以处理。
在发光颗粒的合成时，作为PVP的补充或独立于PVP，可添加另一亲水聚合物作为保护胶体。
在如以上所述制备发光颗粒的实例中，在将30μL的0.1质量％的颗粒分散体添加到60μL的与16μL的血清混合的缓冲溶液中并将整体在37℃下静置5分钟。在添加之前和之后，在10mm的光路和572nm的波长下，吸收光谱的差异为0.1或更小。即，血清中的杂质的非特异性吸附足够低。
(4.水性介质)
上述合成时要使用的水溶液(水性介质)优选在介质中含有80％以上且100％以下的水。水溶液的实例包括水和通过混合水与可溶于水的有机溶剂例如甲醇、乙醇、异丙醇或丙酮获得的溶液。当除水以外的有机溶液以大于20％纳入时，在发光颗粒产生时可发生聚合性单体的溶解
另外，当使用含有有机硅烷的自由基聚合性单体时，水溶液(水性介质)优选具有预先调节至6以上且9以下的pH。当pH值小于6或大于9时，有机硅烷化合物中的烷氧基基团或硅醇基团在形成发光颗粒之前可以经历缩聚或与另一官能团的反应，从而导致待获得的颗粒的凝集。在该实施方案中，在颗粒形成之前，不特意使烷氧基经历缩聚。
优选用pH缓冲剂调节pH，但可以用酸或碱调节。除前述之外，可通过以相对水性介质为10％或更小的比率添加来使用表面活性剂、消泡剂、盐、增稠剂等。
在根据该实施方案的聚合物颗粒的制造中，优选地，首先将PVP溶解在pH调节为6至9的水性介质中。PVP的添加量为0.01质量％至10质量％，优选0.03质量％至5质量％，相对于所述水性介质计。当添加量为0.01质量％以下时，吸附到聚合物细颗粒上的量小，并且其效果没有表现出来。另外，当添加量为10质量％以上时，水性介质的粘度可能提高从而妨碍充分搅拌。
随后，将自由基聚合性单体(A)添加到上述水性介质中以制备乳液。此时，也可通过向水性介质中添加含有有机硅烷的自由基聚合性单体(B)作为(A)的补充来制备乳液。(A)和(B)之间的质量比为6:4至10:0。此外，制备的单体液体与发光稀土络合物混合。此时，当发光稀土络合物的溶解性低时，可添加非水溶性的有机溶剂。发光稀土络合物和单体之间的质量比为1:1000至1:10。
当(A)为60％以下时，颗粒整体的比重可以增加，从而导致颗粒的显著沉降。另外，(B)可不存在，但是更适宜添加(B)以便增加PVP和发光颗粒之间的粘合性。
水性介质与(A)和(B)的总量之间的质量比优选为5:5至9.5:0.5。当水性介质的比率为50％以下时，待制造颗粒的非特异性凝集可成为问题。另外，即使当所述比率为95％以上时，发光颗粒的制造也没有问题，但其产量可能减少。
通过溶解在水、缓冲剂等中来使用自由基聚合引发剂。相对于(A)和(B)的总质量计，自由基聚合引发剂的用量可在0.5质量％和10质量％之间。
在上述的加热乳液的步骤中，仅需要均匀加热整个乳液。加热温度可以在50℃和80℃之间任意设定，并且加热时间可以在2小时和24小时之间任意设定。通过加热乳液，使单体聚合。
能够结合配体的官能团优选是能够结合例如蛋白质、核酸、肽、氨基酸、或氨基基团的官能团。这样的官能团的实例包括：羧基基团、氨基基团、硫醇基团、环氧基团、马来酰亚胺基团、琥珀酰亚胺基和硅烷氧化物基团。可混合具有能够结合配体的官能团的硅烷偶联剂和所合成的发光颗粒以便在发光颗粒表面上提供官能团。具体地，例如，可制备具有羧基基团的硅烷偶联剂的水溶液并与合成的发光颗粒的分散体混合从而在颗粒表面上提供羧基基团。此时，可将分散剂例如Tween20添加到反应溶液。反应温度可以在0℃和80℃之间任意设定，以及反应时间可以在1小时和24小时之间任意设定。为了抑制硅烷偶联剂的急剧缩合反应，适宜的是将温度设置为等于或低于约25℃的室温，并且将反应时间设置为约3小时至约14小时。根据能够结合配体的官能团，可通过添加酸或碱催化剂来促进与颗粒表面的反应。
可通过将配体例如各种抗体中的任何与其结合从而赋予通过乳液聚合等合成的颗粒对目标物质的亲和力。结合配体的技术没有特别限制，并且仅需要选择用于通过利用亲水层3或颗粒基质2上存在的官能团来结合目标抗体的最佳技术。
(大粒径颗粒的制造方法)
可以按与上述的发光颗粒合成方法相同的方式来获得大粒径颗粒，但不包括引入稀土络合物4的步骤。
然而，大粒径颗粒可含有不同于稀土络合物4的荧光染料。
(亲和颗粒)
在该实施方案中，“配体”是指与特定目标物质特异性结合的化合物。配体在预定位点与目标物质结合并且具有选择性地或特异性地高的亲和力。例如，目标物质和配体的组合、或配体和目标物质的组合的典型实例可以包括如下。即实例包括：抗原和抗体；酶蛋白质及其底物；信号物质例如激素或神经递质，及其受体；以及核酸。然而，该实施方案中的配体不限于此。核酸的实例包括脱氧核糖核酸。该实施方案中的亲和颗粒对于目标物质具有选择性或特异性的亲和力。该实施方案中的配体的典型实例包括抗体、抗原和核酸。
迄今已知的方法可应用于使根据该实施方案的颗粒的反应性官能团与配体化学结合的化学反应方法，只要能够实现本发明的目的。另外，当配体被酰胺键合时，可适当地使用催化剂诸如1-[3-(二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺]。
当使用抗体(抗原)作为配体并且抗原(抗体)作为目标物质时，该实施方案中的亲和颗粒可优选应用于临床检查、生化研究等领域中广泛使用的胶乳免疫凝集测量方法。
(检查试剂盒)
根据该实施方案的检查试剂盒包括第一颗粒和第二颗粒。此外，该检查试剂盒可包括分散介质。另外，在检查试剂盒中，第一颗粒和第二颗粒可分散在分散介质中。另外，检查试剂盒可包括含有第一颗粒、第二颗粒和分散介质的试剂。有待纳入该实施方案中的试剂中的根据该实施方案的亲和颗粒的量优选为0.000001质量％至20质量％，更优选0.0001质量％至1质量％。根据该实施方案的试剂除根据该实施方案的亲和颗粒之外可包括第三物质，例如溶剂或阻滞剂，只要可实现本发明的目的。该试剂可包括两种或更多种第三物质的组合，例如溶剂和阻滞剂。有待用于该实施方案的溶剂的实例包括各种缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液、古德缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液(Tr i sbuffer solut ions)和氨缓冲溶液，但该实施方案中的试剂中的溶剂不限于此。
该检查试剂盒可包括上述试剂和包封所述试剂的壳体。
另外，根据该实施方案的试剂盒可含有增感剂用于促进经由目标物质的颗粒凝集。增感剂的实例包括聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、和多藻酸，但是本发明不限于此。另外，根据该实施方案的试剂盒可包括阳性对照、阴性对照、血清稀释剂等。作为阳性对照或阴性对照的介质，可使用不含所述目标物质的血清、生理盐水、或溶剂。根据该实施方案的试剂盒可以与用于通过体外诊断对试样中的目标物质进行一般检测的试剂盒相同的方式用于检测根据该实施方案的目标物质的方法。另外，也可通过迄今已知的方法来测量目标物质的浓度，并且特别地，该试剂盒适合用于通过胶乳凝集法来检测试样中的目标物质
(检查方法)
该实施方案中的测定目标物质的存在与否或目标物质的浓度的方法包括将根据该实施方案的第一颗粒和第二颗粒与可能含有目标物质的样品液体混合的步骤。该混合优选在pH 3.0至pH 11.0的范围内进行。另外，混合温度处在0℃至100℃、或4℃至50℃、或甚至20℃至50℃的范围内，并且混合时间处在1秒至2小时、或1分钟至60分钟的范围内。另外，这种方法优选使用溶剂。另外，在根据该实施方案的方法中，第一颗粒和第二颗粒的浓度优选如以下描述。即，在反应体系中，它们的总量优选为0.000001质量％至1质量％、更优选0.00001质量％至0.001质量％。在根据该实施方案的检测方法中，通过荧光消偏振法来检测作为混合第一颗粒、第二颗粒和试样的结果而发生的凝集反应。
即，该检测方法具体包括以下步骤：混合检查试剂与试样从而提供混合液体；用偏振光照射所述混合液体；和单独检测所述混合液体中的亲和颗粒的发光的偏振光分量。
通过光学检测在混合液体中发生的上述凝集反应，检测所述试样中的目标物质，并且此外，还可测量目标物质的浓度。
实施例
下面通过实施例具体描述本发明。然而，本发明不限于这些实施例。
(1)发光颗粒的制造
将聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30：由东京化成工业株式会社制造)和十二烷基硫酸钠(由和光纯药工业株式会社制造，下文简写为“SDS”)溶解在pH为7的2-吗啉乙烷磺酸(MES)缓冲溶液(由岸田化学株式会社制造)中从而制备溶剂A。使用由Central TechnoCorporation制造的Eu(TTA)3Phen作为稀土络合物。Eu(TTA)3Phen也表示为[三(2-噻吩甲酰三氟丙酮)(1,10-菲咯啉)铕(III)]([tris(2-thenoyl-trifluoroacetonato)(1,10-phenanthroline)europium(III)])。将Eu(TTA)3Phen与苯乙烯单体(由岸田化学株式会社制造)和3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(由东京化成工业株式会社制造，下文简写为“MPS”)混合从而制备反应液B。将反应液B添加到四颈烧瓶中的溶剂A中，并使用设置为300rpm的机械搅拌器来搅拌混合物。在氮气流条件下搅拌30分钟之后，将准备好的油浴的温度设置为70℃，并进行氮气流持续另外30分钟。在加热和搅拌之后，将其中溶解有过硫酸钾(由Sigma-Aldr ich制造，KPS)的水溶液添加到反应溶液中，并进行乳液聚合10小时。在反应之后，离心所得悬浮液，去除上清液，并用纯水重新分散沉淀物。离心和重新分散的操作重复3次以冲洗产物。所得沉淀物用纯水重新分散从而提供发光颗粒分散体。表1中示出所用的试剂的重量比。
[表1]
表1
(2)大粒径颗粒的制造
将聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30：由东京化成工业株式会社制造)和十二烷基硫酸钠(由和光纯药工业株式会社制造，SDS)溶解在pH为7的2-吗啉乙烷磺酸(MES)缓冲溶液(由岸田化学株式会社制造)中从而制备溶剂A。苯乙烯单体(由岸田化学株式会社制造)与3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(由东京化成工业株式会社制造，MPS)混合从而制备反应液B。将反应液B添加至四颈烧瓶中的溶剂A，并使用设置为300rpm的机械搅拌器来搅拌混合物。在氮气流条件下搅拌30分钟之后，将准备好的油浴的温度设置为70℃，并进行氮气流持续另外30分钟。
在加热和搅拌之后，将其中溶解有过硫酸钾(由Sigma-Aldr ich制造，KPS)的水溶液添加到反应溶液中，并进行乳液聚合10小时。在反应之后，离心所得悬浮液，去除上清液，并用纯水重新分散沉淀物。离心和重新分散的操作重复3次以冲洗产物。所得沉淀物用纯水重新分散从而提供大粒径颗粒分散体。表2中示出了所用试剂的重量比。
[表2]
表2
取通过乳液聚合获得的发光颗粒和大粒径颗粒的分散体的等分试样并添加到其中溶解有1重量％的Tween 20(由岸田化学株式会社制造)的水溶液。在10分钟的搅拌之后，添加具有羧酸作为有机官能团的硅烷偶联剂X12-1135(由信越化学工业株式会社制造)，并搅拌混合物过夜。在搅拌之后，离心分散体，去除上清液，并用纯水重新分散沉淀物。进行离心和重新分散的操作3次或更多次以冲洗产物。将冲洗之后的沉淀物重新分散在纯水中以提供发光颗粒和大粒径颗粒的分散体。所述颗粒、纯水和X12-1135之间的重量比被设置为1:300:2。
(3)抗-CRP抗体改性的亲和颗粒的制造
取合成的发光颗粒和大粒径颗粒的1.2重量％的颗粒分散体0.25mL的等分试样，并且用1.6mL的pH为6.0的MES缓冲溶液代替溶剂。向颗粒MES缓冲溶液中以0.5重量％添加1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠，并且使混合物在25℃下经历反应1小时。在反应之后，用pH为5.0的MES缓冲溶液冲洗分散体，以100μg/mL添加抗-CRP抗体，并在25℃下将抗-CRP抗体结合至颗粒持续2小时。在结合之后，用具有pH为8的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液冲洗颗粒。在反应之后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗颗粒从而提供浓度为0.3重量％的CRP抗体改性的亲和颗粒。
通过用BCA检验测量添加有抗体的缓冲溶液中的抗体浓度的降低量来确认抗体的结合。
(4)亲和颗粒和抗原溶液之间的反应
观察所获得的CRP抗体改性的亲和颗粒与使用MES缓冲溶液稀释的CRP抗原混合前后的荧光偏振的变化。使用固定为0.0001mg/mL的CRP抗体改性的亲和颗粒，并使用CRP以0pg/mL至1,000pg/mL的抗原浓度来进行研究。在常温下进行观察。随后描述荧光偏振用测量方法。
(实施例1)
制备如下的分散体：其中对应于所合成的发光亲和颗粒-1的样品和对应于所合成的大粒径亲和颗粒-1的样品以9:1的比率(按重量比)混合。所制备的分散体与用MES缓冲溶液稀释的CRP抗原混合，并且观察混合前后的荧光偏振的变化。分散体中的颗粒的总量设置为0.001mg/mL，并且CRP抗原设置为1pg/mL。在常温下进行测量。
(实施例2)
进行与实施例1中相同的研究，除了对应于所合成的发光亲和颗粒-1的样品和对应于所合成的大粒径亲和颗粒-1的样品设置为5:5的比率(按重量比)。
(实施例3)
进行与实施例1中相同的研究，除了将对应于所合成的发光亲和颗粒-1的样品和对应于所合成的大粒径亲和颗粒-1的样品设置为1:9的比率(按重量比)。
(实施例4)
制备如下的分散体：其中对应于所合成的发光亲和颗粒-2的样品和对应于所合成的大粒径亲和颗粒-2的样品以5:5的比率(按重量比)混合。将制备的分散体与用MES缓冲溶液稀释的CRP抗原混合，并观察混合前后的荧光偏振的变化。分散体中的颗粒的总量设置为0.001mg/mL，并且CRP抗原设置为10pg/mL。在常温下进行测量。
(比较例1)
制备对应于所合成的发光亲和颗粒-1的样品的分散体。制备的分散体与用MES缓冲溶液稀释的CRP抗原混合，并且观察混合前后的荧光偏振的变化。分散体中的颗粒的总量设置为0.001mg/mL，并且CRP抗原设置为1pg/mL。在常温下进行测量。
(比较例2)
制备对应于所合成的大粒径亲和颗粒-1的样品的分散体。所制备的分散体与用MES缓冲溶液稀释的CRP抗原混合，并且观察混合前后的荧光偏振的变化。分散体中的颗粒的总量设置为0.001mg/mL，并且CRP抗原设置为1pg/mL。在常温下进行测量。
(比较例3)
制备对应于所合成的发光亲和颗粒-2的样品的分散体。所制备的分散体与用MES缓冲溶液稀释的CRP抗原混合，并且观察混合前后的荧光偏振的变化。分散体中的颗粒的总量设置为0.001mg/mL，并且CRP抗原设置为1pg/mL。在常温下进行测量。
(产物的评价)
实施例和比较例中的产物各自经历如下评价。
使用电子显微镜(由日立高新技术公司制造的S5500)来评价产物的形状。
通过使用动态光散射(由Malvern制造的Zetas izer Nano S)来评价产物的平均粒径。
使用质谱仪(由理学株式会社制造的Thermo plus TG8120)来评价其中分散有产物的悬浮体的浓度。
使用340nm的激发光并使用置于激发侧和发光侧的每一侧上的光路中的偏光器，在室温下测量含有产物的分散体的荧光光谱。利用被固定的激发侧上的偏光器的方向来进行测量，并且发光侧上的偏光器被放置在平行或垂直于激发侧上的偏光器的方向上。所用的装置是由日立高新技术公司制造的荧光分光光度计F-4500。用于分析偏振发光的观察光的峰值波长被设置为611nm。用方程1来分析对偏振发光的所得数据以确定偏振各向异性“r”。
如以下描述进行产物的非特异性凝集抑制评价。
将60μl的用缓冲溶液稀释15倍的人血清溶液添加到30μl的实施例1至4和比较例1至3中制造的各种发光亲和颗粒分散体(3mg/mL)，并且混合物保持在37℃的温度下持续5分钟。在保温前后测量527nm处的吸光度，并对保温前后的吸光度的变化量进行3次测量。
(性能评价)
根据非特异性凝集抑制评价的结果，在全部实施例和比较例中，吸光度的变化等于或小于特定数值。即，在全部实施例1至4和比较例1至3中，吸光度的变化等于或小于特定数值，即0.01或更小，因此认识到发光颗粒能够抑制非特异性吸附。
表3中示出实施例1、2和3以及比较例1和2的颗粒材料的结构和物理性质。
表3
表3
实施例1、2和3和比较例1的发光亲和颗粒-1具有98nm的尺寸，并且在每个实施例中也确认了pdi值为0.024即小于0.1的单分散颗粒。实施例1、2和3以及比较例2的大粒径颗粒-1具有347nm的尺寸，并且在每个实施例中也确认了pdi值为0.082即小于0.1的单分散颗粒。当比较它们的在反应之后的偏振各向异性“r”和反应前后偏振各向异性的变化Δr的各自数值时，揭示了混合大粒径亲和颗粒的实施例具有比不包括大粒径亲和颗粒的比较例1更高的数值。此外，揭示了在实施例3、2和1中在反应之后的偏振各向异性“r”和反应前后的偏振程度的变化Δr的数值较高，顺序为实施例3、2和1并且所述实施例3、2和1具有渐增的大粒径亲和颗粒混合比率。揭示了具有最大偏振程度变化的实施例3与比较例1相比具有60倍的Δr值。
同时，在不包括发光颗粒的比较例2中，不能检测到偏振各向异性。
表4中示出实施例4和比较例3的颗粒材料的结构和物理性质。
表4
实施例4和比较例3的发光亲和颗粒-2具有207nm的尺寸，并且在每个实施例中也确认了pdi值为0.039即小于0.1的单分散颗粒。实施例4的大粒径亲和颗粒-2具有275nm的尺寸，并且在每个实施例中也确认为了pdi值为0.082即小于0.1的单分散颗粒。当比较它们的在反应之后的偏振各向异性“r”和反应前后偏振各向异性的变化Δr的各自值时，揭示了其中混合大粒径亲和颗粒的实施例4具有比不包括大粒径亲和颗粒的比较例3更高的数值。
通过荧光消偏振法测定的偏振各向异性取决于颗粒尺寸(凝集体尺寸)，并与颗粒(凝集体)的半径的立方成比例。根据本发明的实施例的测量结果是通过研究增加颗粒(凝集体)尺寸的凝集反应所获得的结果，并且是与荧光消偏振法的测量原则一致的合乎逻辑的结果。
因此，显示了根据本发明的测量方法具有极高的检测灵敏度，并且本发明的检查试剂盒或发光亲和颗粒和大粒径亲和颗粒能够实现高灵敏度测量。
本发明不限于以上描述的实施方案，并且可在不偏离本发明的精神和范围的情况下进行各种改变和修改。附上以下权利要求书以便使本发明的范围公开。
本申请要求基于2021年6月8日提交的日本专利申请第2021-096211号的优先权，通过引用将其描述整体并入本文。
附图标记列表
1第一颗粒(发光亲和颗粒)
2颗粒基质
3亲水层
4稀土络合物
5配体
6目标物质
7第二颗粒(大粒径亲和颗粒)
8凝集体

Claims (18)

1.一种确定样品液体中的目标物质的存在与否和目标物质浓度中的至少任一者的方法，该方法包括以下步骤：
(a)制备与目标物质特异性结合并且含有稀土络合物的第一颗粒，和具有比第一颗粒更大的平均粒径并且与目标物质特异性结合的第二颗粒；
(b)将样品液体、第一颗粒和第二颗粒混合以提供混合液体；和
(c)从步骤(b)中获得的混合液体的偏振各向异性来确定目标物质的存在与否和目标物质浓度中的至少任一者。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过以下方程1确定偏振各向异性：
[数1]
其中
<r>表示偏振各向异性，
IVV表示在被第一偏振光束激发时具有的振动方向平行于第一偏振光束的振动方向的发光分量的发光强度，
IVH表示在被第一偏振光束激发时具有的振动方向垂直于第一偏振光束的振动方向的发光分量的发光强度，
IHV表示在被第二偏振光束激发时具有的振动方向垂直于第二偏振光束的振动方向的发光分量的发光强度，所述第二偏振光束的振动方向垂直于第一偏振光束的振动方向，
IHH表示在被第二偏振光束激发时具有的振动方向平行于第二偏振光束的振动方向的发光分量的发光强度，所述第二偏振光束的振动方向垂直于第一偏振光束的振动方向，和
G表示校正值。
3.一种检查试剂盒，其用于确定目标物质的存在与否和目标物质浓度中的至少任一者，该检查试剂盒包含：
与目标物质特异性结合的第一颗粒；和
具有比第一颗粒更大的平均粒径并且与目标物质特异性结合的第二颗粒，
其中第一颗粒含有稀土络合物，
其中第一颗粒具有10nm以上且1μm以下的平均粒径，并且
其中第二颗粒具有100nm以上且5μm以下的平均粒径。
4.根据权利要求3所述的检查试剂盒，
其中第一颗粒
含有聚苯乙烯和具有硅氧烷键的聚合物，
含有在第一颗粒表面中的亲水聚合物，和
含有在第一颗粒内部的稀土络合物。
5.根据权利要求3或4所述的检查试剂盒，其中所述稀土络合物是选自由以下构成的组中的稀土的络合物：铕、铽、钕、铒、钇、镧、铈、钐、钆、镝、铥、镱和钪。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的检查试剂盒，
其中第一颗粒和第二颗粒经由目标物质形成凝集体，
其中与分散介质中第一颗粒显示的偏振各向异性相比，分散介质中凝集体显示的偏振各向异性提高0.004以上，并且
其中偏振各向异性各自由以下方程1限定：
[数2]
其中
<r>表示偏振各向异性，
IVV表示在被第一偏振光束激发时具有的振动方向平行于第一偏振光束的振动方向的发光分量的发光强度，
IVH表示在被第一偏振光束激发时具有的振动方向垂直于第一偏振光束的振动方向的发光分量的发光强度，
IHV表示在被第二偏振光束激发时具有的振动方向垂直于第二偏振光束的振动方向的发光分量的发光强度，所述第二偏振光束的振动方向垂直于第一偏振光束的振动方向，
IHH表示在被第二偏振光束激发时具有的振动方向平行于第二偏振光束的振动方向的发光分量的发光强度，所述第二偏振光束的振动方向垂直于第一偏振光束的振动方向，和
G表示校正值。
7.根据权利要求6所述的检查试剂盒，其中凝集体在分散介质中显示0.1以上的偏振各向异性。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的检查试剂盒，
其中第一颗粒的激发波长和第二颗粒的激发波长彼此不同，或
其中第一颗粒的发光波长和第二颗粒的发光波长彼此不同，或
其中第一颗粒的激发波长和第二颗粒的激发波长彼此不同，并且第一颗粒的发光波长和第二颗粒的发光波长彼此不同。
9.根据权利要求3至8中任一项所述的检查试剂盒，其中第二颗粒不被波长为300nm以上且450nm以下的激发光激发。
10.根据权利要求3至9中任一项所述的检查试剂盒，其中第二颗粒没有在550nm以上至650nm以下的波长区域中的发光最大值。
11.根据权利要求3至10中任一项所述的检查试剂盒，其中第一颗粒的平均粒径为20nm以上且400nm以下。
12.根据权利要求3至11中任一项所述的检查试剂盒，其中第一颗粒和第二颗粒各自具有与目标物质特异性结合的配体。
13.根据权利要求12所述的检查试剂盒，其中所述配体选自由以下构成的组：抗体、抗原和核酸。
14.根据权利要求3至13中任一项所述的检查试剂盒，其中第一颗粒和第二颗粒中的至少任一种在它们的颗粒表面上具有含亲水聚合物的层，所述亲水聚合物含有醚、甜菜碱和吡咯烷酮环中任一种。
15.根据权利要求3至14中任一项所述的检查试剂盒，其中第一颗粒和第二颗粒分散在分散介质中。
16.根据权利要求3至15中任一项所述的检查试剂盒，其中检查试剂盒被包封在壳体中。
17.权利要求3至16中任一项所述的检查试剂盒的第一颗粒的制造方法，该方法包括至少：
将稀土络合物、包括苯乙烯的自由基聚合性单体、自由基聚合引发剂和含有具有吡咯烷酮环的单元的聚合物与水性介质混合以制备乳液的第一步骤；和
通过搅拌所述乳液使所述自由基聚合性单体聚合的第二步骤。
18.权利要求3至16中任一项所述的检查试剂盒的制造方法，该方法包括将第一颗粒和第二颗粒分散在分散介质中的步骤。
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