CN117701758A - 一种与水果萝卜肉质根糠心性状相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与水果萝卜肉质根糠心性状相关的SNP分子标记及其应用。本发明以萝卜“XYB36‑2”为参考基因组，发现与萝卜肉质根糠心性状紧密连锁的第一SNP分子标记和第二SNP分子标记；所述第一SNP分子标记对应XYB36‑2萝卜基因组第8号染色体第22720532bp，碱基为G/T；所述第二SNP分子标记对应XYB36‑2萝卜基因组第8号染色体第24855343bp，碱基为G/T。使用本发明提供的SNP分子标记可以快速、稳定、高效、低成本的鉴定水果萝卜肉质根糠心性状，为肉质根耐糠心水果萝卜的育种奠定基础，对肉质根耐糠心表型鉴定准确率为83.6％。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与水果萝卜肉质根糠心性状相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
萝卜(Raphanus sativus L.)是我国大宗蔬菜之一，年栽培面积达1800万亩。近年来，青萝卜品种水果萝卜，以其脆甜、爽口、多汁等鲜食性特征，深受我国蔬菜消费市场的青睐。但在农业生产过程中发现，大部分水果萝卜在肉质根发育期、收获期和货架期均呈现糠心病症，导致肉质根水分与营养物质严重流失，并无法食用。这一生理病害严重影响水果萝卜产量与品质的形成，限制了萝卜产业的进一步发展。
传统糠心表型调查手段依赖于损伤性取样调查，被调查材料存活率极低，限制了育种家利用传统育种方法培育耐糠心水果萝卜品种。开发一种非损伤性表型调查手段，对培育耐糠心萝卜品种具有重大意义。
SNP(单核苷酸多态性)是基因组变异的最小单位，将SNP开发为分子标记可针对性鉴定某一遗传性状。挖掘耐糠心表型高度关联SNP，并开发成有效分子标记，对实现水果萝卜糠心表型非损伤性鉴定，培育耐糠心水果萝卜新品种至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供开发与水果萝卜肉质根糠心性状相关的SNP分子标记，在不损伤肉质根的前提下，快速、稳定、高效、低成本的鉴定水果萝卜肉质根糠心性状，为肉质根耐糠心水果萝卜的育种奠定基础。
本发明提供了一种与水果萝卜肉质根糠心性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记包括第一SNP分子标记和第二SNP分子标记；
所述第一SNP分子标记对应于XYB36-2萝卜基因组第8号染色体第22720532bp，碱基为G/T；
所述第二SNP分子标记对应于XYB36-2萝卜基因组第8号染色体第24855343bp，碱基为G/T。
本发明还提供了一种与水果萝卜肉质根糠心性状相关的DNA片段，所述DNA片段包括第一DNA片段和第二DNA片段；
所述第一DNA片段包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其中Y为G/T；
所述第二DNA片段包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，其中Y为G/T。
本发明还提供了扩增上述技术方案所述SNP分子标记或DNA片段的引物组合，所述引物组合包括第一引物对和第二引物对；
所述第一引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的第一上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的第一反向引物；
所述第二引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的第二正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的第二上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的第二反向引物。
优选的，所述第一正向引物和第一上游引物的5'末端分别连接荧光基团，且所述第一正向引物和第一上游引物连接的荧光基团不同；
所述第二正向引物和第二上游引物的5'末端分别连接荧光基团，且所述第二正向引物和第二上游引物连接的荧光基团不同。
优选的，所述第一正向引物的5'末端连接荧光基团FAM；所述第一上游引物的5'末端连接荧光基团HEX；
所述第二正向引物的5'末端连接荧光基团FAM；所述第二上游引物的5'末端连接荧光基团HEX。
本发明还提供了扩增上述技术方案所述引物组合在制备检测上述技术方案所述SNP分子标记KASP分型产品中的应用。
本发明还提供了一种检测上述技术方案所述SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物组合。
本发明还提供了上述技术方案所述SNP分子标记或DNA片段或引物组合或试剂盒在鉴定肉质根耐糠心水果萝卜中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述SNP分子标记或DNA片段或引物组合或试剂盒在肉质根耐糠心水果萝卜辅助育种中的应用。
本发明还提供了一种鉴定肉质根耐糠心水果萝卜的方法，包括如下步骤：
以待测水果萝卜样品的DNA为模板，利用上述技术方案所述的引物组合中的第一引物对进行PCR扩增，得到得到第一PCR扩增产物；
以待测水果萝卜样品的DNA为模板，利用上述技术方案所述的引物组合中的第二引物对进行PCR扩增，得到第二PCR扩增产物；
若所述第一PCR扩增产物对应于XYB36-2萝卜基因组第8号染色体22720532位脱氧核糖核苷酸对是G:G，且所述第二PCR扩增产物对应于XYB36-2萝卜基因组第8号染色体24855343位脱氧核糖核苷酸对是G:G，则所述待测水果萝卜样品为耐糠心水果萝卜。
有益效果：
本发明以京研绿秀萝卜和绿如玉萝卜为亲本，利用IlluminaHiseq 2500测序平台对双亲材料以及F2群体极端表型混池材料分别进行全基因组重测序。以萝卜“XYB36-2”为参考基因组(http://brassicadb.cn/)分析双亲间SNP位点多态性，发现与萝卜肉质根糠心性状紧密连锁的SNP位点，包括第一SNP分子标记和第二SNP分子标记；所述第一SNP分子标记对应于XYB36-2萝卜基因组第8号染色体第22720532bp，碱基为G/T；所述第二SNP分子标记对应于XYB36-2萝卜基因组第8号染色体第24855343bp，碱基为G/T。基于上述SNP位点可以快速、稳定、高效、低成本的鉴定水果萝卜肉质根糠心性状，为肉质根耐糠心水果萝卜的育种奠定基础。实施例结果表明，使用本发明提供的SNP分子标记对肉质根耐糠心表型鉴定准确率为83.6％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为萝卜肉质根糠心等级划分标准；其中，红色方框指示糠心部位，标尺为5cm；
图2为绿如玉萝卜、京研绿秀萝卜及其后代糠心表型鉴定结果；其中A为绿如玉萝卜、京研绿秀萝卜与F1自交系糠心表型，P74为京研绿秀萝卜，P75为绿如玉萝卜，标尺为5cm；B为绿如玉萝卜和京研绿秀萝卜的F2分离遗传群体糠心等级分布结果；
图3为实施例2中BSA混池测序挖掘控制水果萝卜肉质根耐糠心关键调控位点对应的结果；
图4为KASP基因分型PCR方法对不同遗传材料进行基因型分型结果；其中，A为P08SNP1分型结果，聚合Y轴红色标记样品为G:G纯合型，聚合X轴蓝色标记样品为T:T纯合型，聚合中部绿色样品为G:T杂合型；B为P08SNP2分型结果，聚合Y轴红色标记样品为G:G纯合型，聚合X轴蓝色标记样品为T:T纯合型，聚合中部绿色样品为G:T杂合型。
具体实施方式
本发明提供了一种与水果萝卜肉质根糠心性状相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记包括第一SNP分子标记和第二SNP分子标记；
所述第一SNP分子标记对应于XYB36-2萝卜基因组第8号染色体第22720532bp，碱基为G/T；
所述第二SNP分子标记对应于XYB36-2萝卜基因组第8号染色体第24855343bp，碱基为G/T。
本发明还提供了一种与水果萝卜肉质根糠心性状相关的DNA片段，所述DNA片段包括第一DNA片段和第二DNA片段；
所述第一DNA片段包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其中Y为G/T；
所述第二DNA片段包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，其中Y为G/T。
本发明还提供了扩增上述技术方案所述SNP分子标记或DNA片段的引物组合，所述引物组合包括第一引物对和第二引物对；
所述第一引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的第一上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的第一反向引物；
所述第二引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的第二正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的第二上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的第二反向引物。
在本发明中，所述第一正向引物和第一上游引物的5'末端优选分别连接荧光基团，且所述第一正向引物和第一上游引物连接的荧光基团不同。本发明所述第一正向引物的5'末端优选连接荧光基团FAM；所述第一上游引物的5'末端优选连接荧光基团HEX。本发明在所述第一正向引物和第一上游引物的5'末端连接荧光基团，能够用于KASP分型检测。
在本发明中，所述第二正向引物和第二上游引物的5'末端优选分别连接荧光基团，且所述第二正向引物和第二上游引物连接的荧光基团不同。本发明所述第二正向引物的5'末端优选连接荧光基团FAM；所述第二上游引物的5'末端优选连接荧光基团HEX。本发明在所述第二正向引物和第二上游引物的5'末端分别连接荧光基团，能够用于KASP分型检测。
本发明所述荧光基团FAM的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.9所示；所述荧光基团HEX的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.10所示。
本发明SEQ ID NO.1～10所述的核苷酸序列信息具体如下：
SEQ ID NO.1：5'-AAATTACTCTAATAATATATTTATTGGTTTGCTCCTCGT AACGGCTGAGTATTTTTTTTTGTTTCATAATGAATATACTTTCATAAAAACTCCCACTCACYTTAATCAAACTCAATGCGATAATACTTTCATAAACATCGAATTTCATGTATTTCGAAATAGGAAAGATATCCTTTTGACTTTTTTTCTTTGTTCTGAAAA-3'；其中，Y为G/T；
SEQ ID NO.2：5'-AGTATACTCACAGAAGCTGAATCGATGGTGACAATT CCGTGGAGATTTAGCTGAACTCTCACTTTGACACATGCTGCTTCTGCGTGGGAAATTTGAAAAGYACGAATCTACAAAAAACATCACAGAACAGACTAAGAGTTCCAGTACAGAGAGCCAGAGACTAATGGTGGTATAATCAGCCAAAACATACTTAGATTGTAG-3'；其中，Y为G/T；
SEQ ID NO.3：5'-ATATACTTTCATAAAAACTCCCACTCACT-3'；
SEQ ID NO.4：5'-TACTTTCATAAAAACTCCCACTCACG-3'；
SEQ ID NO.5：5'-GATGTTTATGAAAGTATTATCGCATTGAGTTTG-3'；
SEQ ID NO.6：5'-CGAACCGAGTGTCGTGACTTG-3'；
SEQ ID NO.7：5'-GCGAACCGAGTGTCGTGACTTA-3'；
SEQ ID NO.8：5'-CGTTTAGCCTTACAATATCCGTTTAATAAAG-3'；
SEQ ID NO.9：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'；
SEQ ID NO.10：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'；
本发明还提供了扩增上述技术方案所述引物组合在制备检测上述技术方案所述SNP分子标记KASP分型产品中的应用。在本发明中，所述KASP分型产品优选包括试剂盒。
本发明还提供了一种检测上述技术方案所述SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物组合。在本发明中，所述试剂盒还优选包括荧光基团探针、荧光基团淬灭探针、高保真DNA合成酶和dNTP。
本发明提供的SNP分子标记或DNA片段与水果萝卜肉质根糠心性状密切相关，鉴于本发明提供的SNP分子标记或DNA片段的作用，上述技术方案所述SNP分子标记或DNA片段或引物组合或试剂盒在鉴定肉质根耐糠心水果萝卜中的应用，以及上述技术方案所述SNP分子标记或DNA片段或引物组合或试剂盒在肉质根耐糠心水果萝卜辅助育种中的应用同样属于本发明的保护范围
本发明还提供了一种鉴定肉质根耐糠心水果萝卜的方法，包括如下步骤：
以待测水果萝卜样品的DNA为模板，利用上述技术方案所述的引物组合中的第一引物对进行PCR扩增，得到第一PCR扩增产物；
以待测水果萝卜样品的DNA为模板，利用上述技术方案所述的引物组合中的第二引物对进行PCR扩增，得到第二PCR扩增产物；
若所述第一PCR扩增产物对应于XYB36-2萝卜基因组第8号染色体22720532位脱氧核糖核苷酸对是G:G，且所述第二PCR扩增产物对应于XYB36-2萝卜基因组第8号染色体24855343位脱氧核糖核苷酸对是G:G，则所述待测水果萝卜样品为耐糠心水果萝卜。
本发明以待测水果萝卜样品的DNA为模板，利用上述技术方案所述的引物组合中的第一引物对进行PCR扩增，得到第一PCR扩增产物。在本发明中，当所述第一正向引物和第一上游引物的5'末端分别连接荧光基团时，所述PCR扩增的反应体系优选以10μL计，包括50ng萝卜基因组DNA，5μL KASP V4.02×MasterMix，0.14μL KASP 72×assaymix和余量的ddH2O。本发明所述KASP V4.02×MasterMix优选包括荧光基团探针、荧光淬灭探针、高保真DNA合成酶和dNTP。本发明所述KASP 72×assay mix优选包括100μmol·L-1正向引物、100μmol·L-1上游引物、100μmol·L-1反向引物和ddH2O，体积比优选为12：12：30：46；所述PCR扩增的反应程序优选包括：95℃预变性15min；94℃变性20s，61℃退火60s(每循环降0.6℃)，10个循环；94℃变性20s，55℃退火60s，26个循环。
本发明以待测水果萝卜样品的DNA为模板，利用上述技术方案所述的引物组合中的第二引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。本发明所述PCR扩增的反应体系和程序已在上文记载，在此不作赘述。
本发明基于所述第一PCR扩增产物和第二PCR扩增产物即可判断待测水果萝卜样品的肉质根糠心表型，具体的：若所述第一PCR扩增产物对应于XYB36-2萝卜基因组第8号染色体22720532位脱氧核糖核苷酸对是G:G，且所述第二PCR扩增产物对应于XYB36-2萝卜基因组第8号染色体24855343位脱氧核糖核苷酸对是G:G，则所述待测水果萝卜样品为耐糠心水果萝卜，其余结果均为糠心水果萝卜。本发明优选根据荧光结果进行判定，具体的：若所述第一PCR扩增产物荧光信号显示为红色，且所述第二PCR扩增产物荧光信号显示为红色，则所述所述待测水果萝卜样品为耐糠心水果萝卜，其余结果均为糠心水果萝卜。本发明在具体实施中，优选参考http://www.cgris.net发布的《萝卜种质资源描述规范》，萝卜糠心分为5个级别。0级：无糠心；1级：肉质根中心部位有少数呈分散的、点状或条状的泛白组织；3级：肉质根中心向外约1/3的组织呈泛白状态；5级：肉质根中心向外约2/3的组织呈泛白状态；7级：整个肉质根内部完全糠心。其中，糠心0级和1级表型被视为耐糠心表型，糠心3级到7级被视为糠心表型。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种与水果萝卜肉质根糠心性状相关的SNP分子标记及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.水果萝卜肉质根糠心性状的评价标准
对北京市农林科学院蔬菜研究所储存的57份水果萝卜种植资源进行糠心表型调查。依据参考规范将水果萝卜糠心程度划分为5个等级(图1)：
糠心0级：无糠心组织；
糠心1级：肉质根中心部位有少数呈分散的、点状或条状的泛白组织；
糠心3级：肉质根中心向外约1/3的组织呈泛白状态；
糠心5级：肉质根中心向外约2/3的组织呈泛白状态；
糠心7级：整个肉质根内部完全糠心；
其中，糠心0级和1级表型被视为耐糠心表型，糠心3级到7级被视为糠心表型。
2.基于步骤1的评价标准，以京研绿秀萝卜(糠心品种，糠心7级)和绿如玉萝卜(耐糠心品种，糠心0级)为亲本构建分离遗传群体，其中，京研绿秀萝卜(以下将该材料记为P74)和绿如玉萝卜(以下将该材料记为P75)均购自京研益农(北京)种业有限公司。通过对F2分离群体糠心表型调查发现，F1代植株呈现糠心3级表型，F2分离遗传群体单株糠心表型呈现不同等级分布(图2)。因此表明，萝卜肉质根糠心是受主效基因控制的数量遗传性状。
实施例2
控制萝卜肉质根耐糠心关键QTL位点挖掘
1.为探究控制萝卜肉质糠心的遗传机制，对实施例1中F2分离遗传群体进行BSA混池测序分析。从354份F2分离遗传群体中，各选择20株具有极端糠心(7级)与极端耐糠心(0级)表型的单株，取等量基因组DNA均匀混合，构建极端耐糠心表型混池pp1和极端糠心表型混池pp2；
2.利用CTAB法提取不同萝卜遗传材料叶片基因组DNA，并使用ddH2O溶解全基因组DNA；利用Illumina Hiseq 2500测序平台对P74、P75、pp1和pp2基因组DNA样品进行重测序。以萝卜“XYB36-2”为参考基因组(http://brassicadb.cn/)分析双亲间SNP位点多态性，分别获得4.82、5.03、6.56和6.82Gb clean reads，测序深度达12.6×、13.1×、17.1×和17.8×，数据量满足后续分析需求。
3.利用GATK(v3.8)软件分析各遗传材料基因组间SNP位点变异频率。首先，依据以下标准对SNP变异位点进行过滤：1.过滤掉有多个基因型的SNP位点，只保留二等位基因型位点；2.过滤掉混池reads支持度小于4的SNP位点；3.过滤掉混池之间基因型纯合且一致的SNP位点；4.过滤掉非两亲本纯合且不一致的SNP位点。最终获得高质量SNP位点641047个。随后，利用SNP-index算法分析混池间高质量SNP位点变异频率，发现仅萝卜8号染色体(对应于XYB36-2萝卜基因)22090000～25400000区间(3.31Mb)内ΔSNP-index值显著高于0.5(P<0.001；图3)。因此，萝卜8号染色体中存在控制肉质根耐糠心的主效QTL区间。
实施例3
挖掘快速鉴定水果萝卜肉质根耐糠心表型SNP位点
1.基于实施例2的结论，进一步发现在控制萝卜肉质根耐糠心区间内共存在18538个SNP位点，其中ΔSNP-index大于0.5且P值小于0.001的SNP位点为6551个。为开发检测耐糠心表型的可靠SNP分子标记，依据萝卜参考基因组(萝卜“XYB36-2”基因组)序列，在萝卜8号染色体主效调控区间两侧选取22720532位与24855343位高质量SNP位点进行克隆验证。分别在各SNP位点上下游100bp设计特异引物，具体的引物信息如表1所示。
表1基于SNP位点设计的引物
注：引物中下划线部分为FAM荧光标签序列，加粗部分为HEX荧光标签序列。
2.以双亲材料基因组DNA为模板，利用高保真聚合酶扩增含有特异SNP的DNA片段。对PCR产物进行测序进行分析，结果如表2所示。
表2不同材料对应的扩增结果
根据表2可以看出，8号染色体22720532位核苷酸对在P74材料中为T:T纯合型，在P75材料中为G:G纯合型，命名该SNP位点为P08SNP1(第一SNP分子标记对应位点)；8号染色体24855343位核苷酸对在P74材料中为T:T纯合型，在P75材料中为G:G纯合型，命名该SNP位点为P08SNP2(第二SNP分子标记对应位点)。
3.为检验上述SNP位点能否开发成可靠分子标记，利用KASP基因分型PCR方法对P74、P75、F1代(2株)和F2极端表型单株(极端耐抗性4株和极端糠心4株)材料进行基因分型分析；
KASP基因分型PCR反应体系：50ng萝卜基因组DNA，5μL KASP V4.02×Master Mix，0.14μL KASP 72×assay mix，加ddH2O至10μL(适于96孔板)。其中，KASP V4.02×MasterMix为LGC公司产品，由FAM荧光基团探针(激发波长为485nm，发射波长为520nm)、HEX荧光基团探针(激发波长为528nm，发射波长为560nm)、FAM荧光淬灭探针、HEX荧光淬灭探针、高保真DNA合成酶和dNTP等组成。KASP 72×assay mix由浓度为100μmol·L-1的正向引物、100μmol·L-1上游引物、100μmol·L-1反向引物与ddH2O，按体积比12：12：30：46混合制备；每批次PCR反应设置1个空白阴性对照；
KASP基因分型PCR反应程序：95℃预变性15min；94℃变性20s，61℃退火60s(每循环降0.6℃)，10个循环；94℃变性20s，55℃退火60s，26个循环；
利用双向单激发读板仪PHERAstar在不同激发波长条件下收集KASP基因分型PCR产物荧光信号。通过KrakenTM软件对PHERAstar扫描数据，并分析特异SNP位点多态性。其中，连接FAM荧光标签序列的纯合等位基因型样本呈现蓝色标记，检测样本聚合于X轴附近；连接HEX荧光标签序列的纯合等位基因型样本呈现红色标记，检测样本聚合于Y轴附近；杂合等位基因型样本呈现绿色标记，检测样品聚合于X与Y轴中间；粉色标记代表扩增产物无法明确分型样品；黑色标记代表阴性对照组。
KASP基因分型PCR结果显示，SNP位点P08SNP1和P08SNP2检测引物能对不同遗传材料进行准确分型(图4)。P08SNP1位点T:T纯合或G:T杂合型，植株表型为糠心7级；该位点为G:G纯合型，肉质根表型为糠心0级。P08SNP2位点T:T纯合或G:T杂合型，肉质根表型为糠心7级，该位点为G:G纯合型，植株表型为糠心0级。SNP位点P08SNP1位点G:G纯合型和P08SNP2位点G:G纯合型可作为分子标记，用于鉴定水果萝卜肉质根耐糠心表型，故将它们分别命名为SNP分子标记P08SNP1[G:G]和P08SNP2[G:G]；
如果P08SNP1位点为T:T纯合型和P08SNP2位点为T:T纯合型，则该材料为糠心表型；如果P08SNP1位点为G:T杂合型，P08SNP2位点为T:T纯合型或G:T杂合型或G:G纯合型，则该材料为糠心表型；如果P08SNP1位点为G:G纯合型和P08SNP2位点为G:G纯合型，则该材料为耐糠心表型。
实施例4
水果萝卜耐糠心表型检测SNP分子标记P08SNP1[G:G]和P08SNP2[G:G]应用评价
为明确SNP分子标记P08SNP1[G:G]和P08SNP2[G:G]鉴定水果萝卜肉质根耐糠心表型的准确率，对F2分离群体(354份)单株进行基因型与糠心表型关联分析。在F2分离群体中，P08SNP1位点为G:G纯合型且P08SNP2位点为G:G纯合型的为67株，其中，肉质根呈现耐糠心表型为56株，肉质根呈现糠心表型为11株，P08SNP1[G:G]和P08SNP2[G:G]双标记表型鉴定准确率为83.6％(表3)。
表3水果萝卜F2分离群体肉质根糠心表型与基因型分析
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根据上述内容可以看出，本发明开发的分子标记P08SNP1[G:G]和P08SNP2[G:G]与萝卜肉质根糠心表型密切相关，基于分子标记P08SNP1[G:G]和P08SNP2[G:G]共同检测对萝卜肉质根耐糠心表型鉴定成功率高，可应用于非损伤条件下对水果萝卜耐糠心表型的大规模筛选，亦可应用于分子标记辅助选择，从回交及分离群体中快速筛选优良育种材料。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种与水果萝卜肉质根糠心性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记包括第一SNP分子标记和第二SNP分子标记；
所述第一SNP分子标记对应于XYB36-2萝卜基因组第8号染色体第22720532bp，碱基为G/T；
所述第二SNP分子标记对应于XYB36-2萝卜基因组第8号染色体第24855343bp，碱基为G/T。
2.一种与水果萝卜肉质根糠心性状相关的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段包括第一DNA片段和第二DNA片段；
所述第一DNA片段包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其中Y为G/T；
所述第二DNA片段包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，其中Y为G/T。
3.扩增权利要求1所述SNP分子标记或权利要求2所述DNA片段的引物组合，所述引物组合包括第一引物对和第二引物对；
所述第一引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的第一上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的第一反向引物；
所述第二引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的第二正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的第二上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的第二反向引物。
4.根据权利要求3所述的引物组合，其特征在于，所述第一正向引物和第一上游引物的5'末端分别连接荧光基团，且所述第一正向引物和第一上游引物连接的荧光基团激发出的荧光颜色不同；
所述第二正向引物和第二上游引物的5'末端分别连接荧光基团，且所述第二正向引物和第二上游引物连接的荧光基团激发出的荧光颜色不同。
5.根据权利要求4所述的引物组合，其特征在于，所述第一正向引物的5'末端连接荧光基团FAM；所述第一上游引物的5'末端连接荧光基团HEX；
所述第二正向引物的5'末端连接荧光基团FAM；所述第二上游引物的5'末端连接荧光基团HEX。
6.权利要求4或5所述的引物组合在制备检测权利要求1所述SNP分子标记KASP分型产品中的应用。
7.一种检测权利要求1所述SNP分子标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3～5任一项所述的引物组合。
8.权利要求1所述SNP分子标记或权利要求2所述DNA片段或权利要求3～5任一项所述的引物组合或权利要求7所述的试剂盒在鉴定肉质根耐糠心水果萝卜中的应用。
9.权利要求1所述SNP分子标记或权利要求2所述DNA片段或权利要求3～5任一项所述的引物组合或权利要求7所述的试剂盒在肉质根耐糠心水果萝卜辅助育种中的应用。
10.一种鉴定肉质根耐糠心水果萝卜的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以待测水果萝卜样品的DNA为模板，利用权利要求3～5任一项所述的引物组合中的第一引物对进行PCR扩增，得到第一PCR扩增产物；
以待测水果萝卜样品的DNA为模板，利用权利要求3～5任一项所述的引物组合中的第二引物对进行PCR扩增，得到第二PCR扩增产物；
若所述第一PCR扩增产物对应于XYB36-2萝卜基因组第8号染色体22720532位脱氧核糖核苷酸对是G:G，且所述第二PCR扩增产物对应于XYB36-2萝卜基因组第8号染色体24855343位脱氧核糖核苷酸对是G:G，则所述待测水果萝卜样品为耐糠心水果萝卜。
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