CN117683782B - 甘草中frp家族基因、其编码的蛋白和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甘草GiFRPs基因、其编码的蛋白和应用，通过基因克隆进行功能研究发现所述GiFRP1‑5基因负调控胀果甘草中LCA的合成积累，此外我们进一步研究发现Gi FRP3和GiFRP4基因可以负调控总黄酮、异甘草苷、大豆苷元、刺甘草查尔酮、异甘草素和甘草查尔酮C的合成积累。以上基因沉默株系中相应化合物的含量上升。其中GiFRP4过表达后可促进毛状根生长，并且MeJA处理后可提高总黄酮和LCA的含量，可提高总黄酮含量约4倍，提高LCA含量约184倍。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及甘草中FRP家族基因、其编码的蛋白和应用。
背景技术
植物在应对生物和非生物胁迫时会产生多种特殊代谢物，这些化合物的化学结构因植物分类而不同，通常具有科、属或物种特异性。甘草的特殊代谢物非常复杂，因其具有丰富的营养价值、治疗特性和资源丰富而受到国内外研究学者的关注。
甘草入药历史悠久，是世界上最古老和最受欢迎的药用植物之一，自公元前4000年以来，被中西方文化中的草药和传统医学广泛使用。甘草的商用部位来自其根及根茎，根中化学成分复杂，包括氨基酸、蛋白质、单糖、多糖、矿物质盐、三萜皂苷、黄酮、香豆素和生物碱等。近年来，随着现代药理学研究的不断深入，人们已经从甘草中发掘出了许多有价值的、具有显著药理活性的物质，例如16种甘草类黄酮通过抑制细胞周期和调节多种信号通路可能发挥的抗癌活性，以及甘草甜素，β-甘草次酸，甘草素，异甘草素，甘草查尔酮A，甘草查尔酮E和刺甘草查尔酮作为主要成分发挥着抗病毒和抗菌活性。在这些成分中，甘草查尔酮A是最丰富的一种，主要存在于胀果甘草(Glycyrrhiza inflata B.)中，是胀果甘草的特征性成分。近年来，甘草被过度和不可持续性的采挖，导致野生资源迅速减少，人工种植甘草逐渐增多。甘草中的重要活性成分与其生长年限、复杂的生长发育环境以及生产方式有很大关系。大多数人工栽培甘草的有效成分含量偏低，不满足药典要求，严重影响甘草的开发利用。为了解决甘草的市场供求矛盾问题，推进甘草重要活性成分的生物合成途径及调控机制研究十分必要。因此，利用分子生物学技术系统帮助提高植物活性成分含量显得非常重要。
FRP(Flavonoid Regulating Protein)对调控植物次生代谢具有重要作用。通常情况下，胀果甘草根中的GiFRPs表达水平较低，因此通过调节这些GiFRPs的表达水平，可以影响基因的表达，进而调控植物的生长和次生代谢产物的生物合成。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种甘草GiFRPs基因、其编码的蛋白和应用，通过基因克隆进行功能研究发现所述GiFRP1-5基因负调控胀果甘草中LCA的合成积累，此外我们进一步研究发现GiFRP3和GiFRP4基因可以负调控总黄酮、异甘草苷、大豆苷元、刺甘草查尔酮、异甘草素和甘草查尔酮C的合成积累。其中GiFRP4过表达后可促进毛状根生长，并且激素处理后可提高黄酮类化合物的含量，尤其是茉莉酸甲酯处理OE-GiFRP4毛状根，可提高总黄酮含量约2.5倍，提高LCA含量约90倍。
具体技术方案为：
一种甘草GiFRP1基因，所述甘草GiFRP1基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。或为与SEQ ID NO.1完全互补配对的序列；或为在SEQ ID NO.1所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列。
一种甘草RNAi-GiFRP1沉默基因，所述甘草RNAi-GiFRP1基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。或为SEQ ID NO.1中200～300bp且在基因组中高度特异的片段；或为在SEQ ID NO.2所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列。
一种甘草GiFRP1蛋白，所述甘草GiFRP1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；或为在SEQ ID NO.3所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸，或末端修饰，且具有相同功能的氨基酸序列。
一种甘草GiFRP2基因，所述甘草GiFRP2基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。或为与SEQ ID NO.4完全互补配对的序列；或为在SEQ ID NO.4所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列。
一种甘草RNAi-GiFRP2沉默基因，所述甘草RNAi-GiFRP2基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。或为SEQ ID NO.4中200～300bp且在基因组中高度特异的片段；或为在SEQ ID NO.5所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列。
一种甘草GiFRP2蛋白，所述甘草GiFRP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；或为在SEQ ID NO.6所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸，或末端修饰，且具有相同功能的氨基酸序列。
一种甘草GiFRP3基因，所述甘草GiFRP3基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。或为与SEQ ID NO.7完全互补配对的序列；或为在SEQ ID NO.7所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列。
一种甘草RNAi-GiFRP3沉默基因，所述甘草RNAi-GiFRP3基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。或为SEQ ID NO.7中200～300bp且在基因组中高度特异的片段；或为在SEQ ID NO.8所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列。
一种甘草GiFRP3蛋白，所述甘草GiFRP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；或为在SEQ ID NO.9所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸，或末端修饰，且具有相同功能的氨基酸序列。
一种甘草GiFRP4基因，所述甘草GiFRP4基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示。或为与SEQ ID NO.10完全互补配对的序列；或为在SEQ ID NO.10所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列。
一种甘草RNAi-GiFRP4沉默基因，所述甘草RNAi-GiFRP4基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。或为SEQ ID NO.10中200～300bp且在基因组中高度特异的片段；或为在SEQ ID NO.11所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列。
一种甘草GiFRP4蛋白，所述甘草GiFRP4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；或为在SEQ ID NO.12所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸，或末端修饰，且具有相同功能的氨基酸序列。
一种甘草GiFRP5基因，所述甘草GiFRP5基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示。或为与SEQ ID NO.13完全互补配对的序列；或为在SEQ ID NO.13所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列。
一种甘草RNAi-GiFRP5沉默基因，所述甘草RNAi-GiFRP5基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。或为SEQ ID NO.13中200～300bp且在基因组中高度特异的片段；或为在SEQ ID NO.14所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列。
一种甘草GiFRP5蛋白，所述甘草GiFRP5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；或为在SEQ ID NO.15所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸，或末端修饰，且具有相同功能的氨基酸序列。
本发明提供了上述甘草GiFRPs基因或上述甘草GiFRPs蛋白在植物育种中负调控LCA合成积累的应用。
本发明提供了上述甘草GiFRP3和GiFRP4重组表达载体或重组菌在植物育种中负调控总黄酮、异甘草苷、大豆苷元、刺甘草查尔酮、异甘草素和甘草查尔酮C含量的应用。
本发明提供了上述甘草GiFRP4基因促进毛状根生长并且利用MeJA处理提高植物类黄酮含量中的应用。
一种调控植物LCA含量的方法，所述方法为将上述甘草GiFRP1、2、3、4、5基因的过表达载体或敲除载体转入甘草毛状根中，并使其表达。本发明还提供了含有上述甘草重组表达载体、重组菌和转基因植物株系。
在其中一些实施例中，所述转入甘草毛状根是通过发根农杆菌介导。
在其中一些实施例中，所述发根农杆菌为MSU440。
在其中一些实施例中，所述甘草为胀果甘草。
在其中一些实施例中，所述毛状根为1月龄。
在其中一些实施例中，所述类黄酮为LCA。
在其中一些实施例中，所述方法包括以下步骤：
一种调控植物总黄酮、异甘草苷、大豆苷元、刺甘草查尔酮、异甘草素和甘草查尔酮C含量的方法，所述方法为将GiFRP3、4基因的敲除载体转入甘草毛状根，并使其表达。本发明还提供了含有上述甘草pSuper/RNAi-GiFRP3/GiFRP4的重组表达载体、重组菌和转基因植物株系。
在其中一些实施例中，所述转入甘草毛状根是通过发根农杆菌介导。
在其中一些实施例中，所述发根农杆菌为MSU440。
在其中一些实施例中，所述甘草为胀果甘草。
在其中一些实施例中，所述毛状根为1月龄。
在其中一些实施例中，所述类黄酮为总黄酮。
在其中一些实施例中，所述JA为MeJA。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了5种能负调控LCA生物合成的甘草GiFRPs基因，其中2种能负调控总黄酮的生物合成。此外GiFRP4基因还能够受MeJA抑制，从而大大促进总黄酮和LCA的合成积累，进而提高甘草的药用价值和经济价值。本发明提供的方法具有快速、高效和成本低等优点，在医药产品、食品添加剂、保健品和化妆品等领域具有广阔的应用空间。
附图说明
图1为GiFRPs基因和RNAi-GiFRPs基因CDS PCR扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳图。
图2为GiFRPs转基因毛状根中LCA的含量检测结果。
图3为提取的胀果甘草GiFRP3转基因毛状根的总黄酮(上)，以及培养的胀果甘草Gi FRP3中总黄酮、异甘草苷、大豆苷元、刺甘草查尔酮、异甘草素和甘草查尔酮C的含量检测结果(下)。
图4为提取的胀果甘草GiFRP4转基因毛状根的总黄酮(上)，以及培养的胀果甘草Gi FRP4中总黄酮、异甘草苷、大豆苷元、刺甘草查尔酮、异甘草素和甘草查尔酮C的含量检测结果(下)。
图5为pSuper-GiFRP4转基因毛状根促进生长的表型和统计分析(上)，以及MeJA处理后总黄酮和LCA的检测结果(下)。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本发明所述甘草GiFRP4基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。或为与SEQ ID NO.1完全互补配对的序列；或为在SEQ ID NO.1所示序列基础上经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸，且具有相同功能的核苷酸序列。
SEQ ID NO.1:
ATGAATCTTATCCCAAAAATCATTGCTGAGTCGACTCGGTGTATCGGTGGCTCGGCCATTA
TTTCATCGTTCATCGCGTTGGTAACCGCCGAAGTTTCTCCCGACCTCTACCAGAACAATT
CCCGCCAACCGTCGCTATCGATGTCGTCGTCGTCGTCTTCTTCTGCGAACGATGCCGTCG
CGCGCAACCGCATCCACTCTAGCAAGCTCTACTTCGATGTGCCTCCATCCAAGGTTCCGC
TTATCTACTCTGAGTCTTACGACATATCATTTCTCGGCATAGAGAAACTGCACCCGTTCGA
TTCGTCCAAATGGGGACGTGTATGTCGATTCCTTGTCTCTTTTGGTGTTCTGGATAAGAA
ATGCATTGTTGAGCCTCTCGAAGCTTCCAGGGATGACCTTCTAGTGGTACACTCAGAATC
GTACTTGAATAGTCTGAAGGAAAGTTCAAATGTTGCTATAATAATTGAGGTCCCTCCTGT
GGCATTATTTCCCAATTGTCTTGTGCAACATAAAGTTCTTTTCCCATTCAGGAAGCAGGT
TGGAGGAACTATATTGGCTGCAAAAGTTGCAAAAGAGAGAGGATGGGCCATTAATGTGG
GGGGAGGTTTTCATCACTGCTCTGCAGAAAATGGAGGTGGATTTTGTACTTATGCAGATA
TTTCTCTATGCATCCACTTTGCTTTTGTTCGGTTGAATATATCAAGGGTGATGATCATTGAT
CTTGATGCACATCAAGGAAACGGTCACGAAATGGACTTTGCTGATGATAGCCGAGTCTAT
ATCCTGGATATGTATAACCCTGGAATATATCCTTTGGATTATGAGGCTAGAAACTACATAA
ATCAGAAGGTTGAAGTAAAGAGTGGGACTATTACAGAAGAGTACTTGCAGAAATTAGAT
GAAGCACTTGAGGTTGCTGGGAAAAGGTTTAACCCTGAGTTGTTAATTTATAATGCTGG
AACTGACATCCTAGAAGGTGACCCACTAGGAAGGTTGAAGATTAGCCCCGACGGAATTG
CTTTTAGAGATGAGAAAGTTTTTCGGTTTGCTCGTGAGAAGAACATTCCTATTGTCATGC
TCACTTCAGGTGGATACATGAAATCCAGTGCCAGAGTCATTGCAGATTCAATAGTCAATC
TCTCGAAGAAATGCTTGATAGAAATGAACGGAGGTACAAAGGCCACATAA
SEQ ID NO.2:
CAGAAAATGGAGGTGGATTTTGTACTTATGCAGATATTTCTCTATGCATCCACTTTGCTTT
TGTTCGGTTGAATATATCAAGGGTGATGATCATTGATCTTGATGCACATCAAGGAAACGG
TCACGAAATGGACTTTGCTGATGATAGCCGAGTCTATATCCTGGATATGTATAACCCTGGA
ATATATCCTTTGGATTATGAGGCTAGAAACTACATAAATCAGAAGGTTGAAGTAAAGAGT
GGGACTATTACAGAAGAGTACTTGCAGAAATTAGATGAAGCACTTGAGGTTGCTG
SEQ ID NO.3:
MNLIPKIIAESTRCIGGSAIISSFIALVTAEVSPDLYQNNSRQPSLSMSSSSSSSANDAVARNRIH
SSKLYFDVPPSKVPLIYSESYDISFLGIEKLHPFDSSKWGRVCRFLVSFGVLDKKCIVEPLEAS
RDDLLVVHSESYLNSLKESSNVAIIIEVPPVALFPNCLVQHKVLFPFRKQVGGTILAAKVAKE
RGWAINVGGGFHHCSAENGGGFCTYADISLCIHFAFVRLNISRVMIIDLDAHQGNGHEMDF
ADDSRVYILDMYNPGIYPLDYEARNYINQKVEVKSGTITEEYLQKLDEALEVAGKRFNPEL
LIYNAGTDILEGDPLGRLKISPDGIAFRDEKVFRFAREKNIPIVMLTSGGYMKSSARVIADSIVNLSKKCLIEMNGGTKAT*(*表示终止)
SEQ ID NO.4:
ATGAGGGAACCTCCGTCGCCACCTCCGTCGTCAAAGCCCTCCGAAAGCATCTGCGTCCG
CGTCCGCTGCGCCGGATGCCGCACGATCCTGACCGTGGCGCCCGGGGTGACCGAGTTC
GCCTGCCCTATCTGCCGAATGCCGCAGATGCTTCCCCCCGAGCTGATGGACAGGGCCCA
CCAAAGGGCACCGCCGCGGCCGCCGTTGCCTCCTCCTCCTGCTCCCGGTACTTCGGAGC
AGCACTTGGCCTTACGCGGCATTGATCCCACTAAGATGCAGCTTCCCTGCGCTAGCTGCA
AGGCAATCCTCAACGTCCCTCACGGCCTCGAGAGGTTCTCTTGCCCCCAATGTTACGTT
GACCTCGCCGTCGATCTCTCCACGGTCAAGCAGTTCTCTCCCCCGCCTCCTCTCGAAGA
AGCTAACGAGCTGAGACAGAAAGATAGAAGAAGAAAAGTGAAGAGTGTGCGGAGTAG
TGAGAAGAGAAGCAAAATGAGTGGTCAACAAGGTCAACGCCGTGTGGGTTTACTATAC
GACGAGAGGATGTGTAAGCACCACTCAGAAGACGACGATTTCCATCCCGAAACCCCTAA
TCGCATTAGGGCTATTTGGAACAAGCTCCAAACCTCCCGCATTACCGACCGATGTGTGAT
TTTGGAGGCTAAAAAAGCTGAAGACAAGCATTTACATTCAGTCCACTCAAAAAATCATG
TCAATCTTATTAAGAACATCAGCTCTAAACAATTTGGTTCGCGGAGGCATAAGATTGCGT
CTAAATTGAATTCTATATATTTCAATGAAGGTTCATCGGAAGCTGCTTATCTTGCTGCTGG
CTCTGCTATAGAGGTTGTTAAAAGAGTGGCAAGCAGGGAATTGCATTCTGCTGTTGCTAT
TATTAGGCCTCCAGGTCATCATGCAGAAAAAAACGAAGCGATGGGATTTTGTCTGTTTAA
CAATGTTGCAATTGCCGCATCTTATCTATTAGATGAAAGACCAGAATTTGGTGTGAAGAA
AATCTTAATTGTTGATTGGGATGTCCATCATGGAAATGGTACTCAAAAAATGTTCTTGAAT
GATTCTCGAGTTTTATTCTTCTCCGTTCACAGGCATGAATTTGGGACTTTTTATCCATCTAA
TGATGATGGCTTTTATACCATGATTGGGGAAGGAAAAGGTGCTGGATACAATATAAATGT
GCCATGGGAGAATGCGAGATGCGGTGATGCAGACTACTTTGCAGTGTGGGATCACATCT
TGCTCCCTGTTGCCAAAGAATTTAATCCAGACATGATTATAGTTTCTGCCGGGTTTGATGC
AGCTGTTGGTGACCCTCTGGGAGGATGTCGTGTCACACCATATGGTTATTCTGTTCTGTT
GAAAAAGTTGATGAATTTCGCTGAAGGTAGGATTGCACTGGTTTTAGAAGGAGGATATA
ATCTTGACTCCATTGCAAAATCAATGCATGCTTGTTTGGAAGTTTTGCTAGAAGACAAGT
CTCTTAGTGGATCCTCAGAGGCCTATCCATTTGAGTCTACTTGGCGTGTAATTCAAGCGG
TGCGCAAGGAGTTAAGTCCCTTTTGGCCCATACTTGCCTGTGAAGTACCACCAGAATTAA
TTAGTCAAATGGCACCACCTCCGCATACTCTTATCTCAAGCTCTGACTCCGAGACCGAGG
ATGACAAGGGTCCACTCAATTCAGAAAATCTTGCAGAGCTTCTTCAGGATGTCATAAAA
CCACTTTCCAAACTGAAAGTCAATGCAGATGAAGAAACTGATGCCTCTAGTTCTTGGAG
ATCAGAATTGTCAAATGTTTACGTATGGTATGCCTCGTATGGATCAAATATGTGGAAACCA
AGATTTGATTGCTACATAGCAGGTGGGCAGGTGGAAGGTATGCAGAAGCCCTGTTCTGG
TTCAGTGAACAAAACTCTTCCAGAGGAAACCATGTGGAAAACTTTCCCTTGCCATATATT
TTTTGGCCGCGATTCCTCGAGTTCATGGGGTCCTGGAGGGGTTGCGTTTCTTAATCCTGA
GAAAAACTTTCAGCACAAGGCCTACATGTGCCTGCACAAAATTTCGCTAGAGCAGTTCA
ATGATATTTTATTTCAGGAAAATGGTTTAAGCCTTAATGCGGGCTCTTCTGTATTTGATATA
ACTACTCTGAATGCCATCTCTAACAAGGACTTCAGTTCTCATGAGGTTGTTGAGGGTGGT
TGGTATGGTAATGCTGTCTACTTAGGAAAGGAGCAGGATGTTCCAATAATTACCATGACG
TGTTCGCTTTCTGATATTGAGCACTTCAAATCTGGGAAGCTACCATTACTTGCCCCTAAC
AAAGCGTACGCCAACACCTTAATAAAAGGGTTGGTAGAGGGAGAACAGCTTTCAGAAG
CGGAAGCCATTGCTTACATAGAAGCTGCTGATAAATCGTTAAGACTTGCATAA
SEQ ID NO.5:
TCCGCATACTCTTATCTCAAGCTCTGACTCCGAGACCGAGGATGACAAGGGTCCACTCA
ATTCAGAAAATCTTGCAGAGCTTCTTCAGGATGTCATAAAACCACTTTCCAAACTGAAA
GTCAATGCAGATGAAGAAACTGATGCCTCTAGTTCTTGGAGATCAGAATTGTCAAATGTT
TACGTATGGTATGCCTCGTATGGATCAAATATGTGGAAACCAAGATTTGATTGCTACATAG
CAGGTGGGCAGGTGGAAGGT
SEQ ID NO.6:
MREPPSPPPSSKPSESICVRVRCAGCRTILTVAPGVTEFACPICRMPQMLPPELMDRAHQRAP
PRPPLPPPPAPGTSEQHLALRGIDPTKMQLPCASCKAILNVPHGLERFSCPQCYVDLAVDLST
VKQFSPPPPLEEANELRQKDRRRKVKSVRSSEKRSKMSGQQGQRRVGLLYDERMCKHHSE
DDDFHPETPNRIRAIWNKLQTSRITDRCVILEAKKAEDKHLHSVHSKNHVNLIKNISSKQFG
SRRHKIASKLNSIYFNEGSSEAAYLAAGSAIEVVKRVASRELHSAVAIIRPPGHHAEKNEAMG
FCLFNNVAIAASYLLDERPEFGVKKILIVDWDVHHGNGTQKMFLNDSRVLFFSVHRHEFGT
FYPSNDDGFYTMIGEGKGAGYNINVPWENARCGDADYFAVWDHILLPVAKEFNPDMIIVSA
GFDAAVGDPLGGCRVTPYGYSVLLKKLMNFAEGRIALVLEGGYNLDSIAKSMHACLEVLL
EDKSLSGSSEAYPFESTWRVIQAVRKELSPFWPILACEVPPELISQMAPPPHTLISSSDSETED
DKGPLNSENLAELLQDVIKPLSKLKVNADEETDASSSWRSELSNVYVWYASYGSNMWKPR
FDCYIAGGQVEGMQKPCSGSVNKTLPEETMWKTFPCHIFFGRDSSSSWGPGGVAFLNPEKN
FQHKAYMCLHKISLEQFNDILFQENGLSLNAGSSVFDITTLNAISNKDFSSHEVVEGGWYGN
AVYLGKEQDVPIITMTCSLSDIEHFKSGKLPLLAPNKAYANTLIKGLVEGEQLSEAEAIAYIEAADKSLRLA*
SEQ ID NO.7:
ATGGGGATGGAGGAGGAGAGAAGCAATAATAATAGTATCATAGAGGAAGGTGCTTCACT
ACCATCATCGGGTCCAGACGCAAAGAAGAGGAGGGTGACATACTTCTACGAACCCAGC
ATCGGTGACTACTACTACGGGCAAGGCCACCCGATGAAACCCCACCGAATCCGCATGGC
CCACAACCTCATCGTACACTACTCCCTCCACCGCCGCATGGAGATCAACCGTCCCTTCCC
CGCCGCAGCCCGCGATATCCGCTGCTTCCACTCCGATGACTACGTCGGCTTCCTCTCATC
AGTCTCACCCGAGACCCTCGCCGAGCCCTCCCACTCCCGCCAGCTCAAGCGCTTCAACG
TCGGCGAGGACTGCCCCGTCTTCGACGGACTCTTCAACTTCTGCCAGGCCTCCGCCGGC
GGCTCCATCGGCGCCGCCGTCAAGCTCAATCGCGGCGACGCCGACATCGCCATCAATTG
GGCCGGCGGCCTTCACCACGCTAAGAAGTCTGAAGCCTCTGGATTCTGTTACGTCAACG
ACATTGTTCTCGGTATCCTCGAGCTTCTCAAAGTTCACAGGCGTGTGCTGTACGTTGACA
TCGATGTTCACCATGGTGATGGTGTGGAGGAAGCCTTTTACACAACTGATAGAGTGATG
ACTGTGTCTTTTCATAAGTTTGGGGACTTTTTTCCTGGCACTGGACACATCAAAGACATT
GGGGTGGGTGCCGGAAAGAATTATGCTCTCAATGTCCCATTAAACGATGGAATGGATGAT
GAGAATTTCCGTAGTTTGTTTCGACCCATCCTTCAAAAAGTCATGGAGGTTTATCAACCT
GGTGCTGTTGTTCTTCAATGTGGAGCTGATTCATTGTCTGGTGACAGGTTGGGTTGCTTC
AACTTGTCTGTGAAAGGTCATGCTGATTGCCTTCGTTTCCTTAGATCTTTCAATGTTCCTC
TAATGGTATTGGGTGGGGGAGGATATACAATTCGCAATGTTGCTCGTTGTTGGTGTTATGA
GACAGCAGTAGCAGTAGGAGTGGAGCCTGATAATAAGTTGCCATATAATGAATATTATGA
GTATTTTGGCCCAGATTATACGCTCTATGTCGATCCAAGCAACATGGAGAACCTAAACAC
ACCCAAGGATATGGAAAAAATAAGGAACACACTACTAGAACAGCTTTCACGACTTCCCC
ATGCTCCCAGTGTACCTTTTCAGACAACACCATCAACCTTAGAAGCTCCAGAAGAGGCG
GAAGAGGACATGGATAGAAGACCAAAACATCGCAAATGGAGTGGTGAAGATTATGATTC
TGATTACGATGAAGATGAGAAGATCCAGAGCTCAAACTTCAGTGACCATATGAGGGATG
TTGCAGACGACATGGAAGAAGAGAAGCCAGAAGTGCATACATCTTTTTGTTGCTGA
SEQ ID NO.8:
TTTCCTTAGATCTTTCAATGTTCCTCTAATGGTATTGGGTGGGGGAGGATATACAATTCGC
AATGTTGCTCGTTGTTGGTGTTATGAGACAGCAGTAGCAGTAGGAGTGGAGCCTGATAAT
AAGTTGCCATATAATGAATATTATGAGTATTTTGGCCCAGATTATACGCTCTATGTCGATCC
AAGCAACATGGAGAACCTAAACACACCCAAGGATATGGAAAAAATAAGGAACACACTA
CTAG
SEQ ID NO.9:
MGMEEERSNNNSIIEEGASLPSSGPDAKKRRVTYFYEPSIGDYYYGQGHPMKPHRIRMAHN
LIVHYSLHRRMEINRPFPAAARDIRCFHSDDYVGFLSSVSPETLAEPSHSRQLKRFNVGEDCP
VFDGLFNFCQASAGGSIGAAVKLNRGDADIAINWAGGLHHAKKSEASGFCYVNDIVLGILE
LLKVHRRVLYVDIDVHHGDGVEEAFYTTDRVMTVSFHKFGDFFPGTGHIKDIGVGAGKNY
ALNVPLNDGMDDENFRSLFRPILQKVMEVYQPGAVVLQCGADSLSGDRLGCFNLSVKGHA
DCLRFLRSFNVPLMVLGGGGYTIRNVARCWCYETAVAVGVEPDNKLPYNEYYEYFGPDYT
LYVDPSNMENLNTPKDMEKIRNTLLEQLSRLPHAPSVPFQTTPSTLEAPEEAEEDMDRRPKHRKWSGEDYDSDYDEDEKIQSSNFSDHMRDVADDMEEEKPEVHTSFCC*
SEQ ID NO.10:
ATGGCTACTACGACGGATAGTATCGACGCAGCAGCAGCATCTTCTTCCACGGTGAATTAT
ATCGATGTTTTCTGGCATGAAGGGATGCTCAAGCATGACGCTGGGAAGGGAGTGTTTGA
CACGGGAATGGACCCAGGTTTTTTGGACGTGTTGGATAACCATCCTGAAAACTCAGACA
GGGTCAAAAACATGCTCTCTATCCTCAAAAGAGGCCCTATCTCCCCTTACATTTCTTGGA
ACCTTGGTAGACCTGCTCTCATCCCCGAGCTCCTTTCTTTCCACACTCCTGAATACGTGA
ATGAACTGGTAGAGGCTGATAAAGAAGGGGGGAAGATGCTTTGTGCTGGCACATTCTTG
AACCCCGGATCATGGGATGCTGCGCTTCTTGCTGCCGGGACTACACTGTCTTCAATGAA
GCATTTGCTGGATGGGAATGGAAAAGTTGCTTATGCTTTGGTTAGGCCCCCTGGTCACCA
TGCTCAGCCTTCTCAGGCTGATGGTTACTGTTTCCTCAACAATGCTGGCCTGGCAGTTCA
GTTAGCTTTAGATTCTGGGTGTAAGAAGGTTGCAGTTATAGATATTGATGTTCATTATGGA
AATGGCACAGCAGAAGGATTCTATTCATCTAATAAAGTTCTTACCATCTCTCTTCATATGA
ACCATGGATCATGGGGTCCATCTCATCCACAGAGTGGATCTGTTGATGAGCTAGGTGAAG
GAGAGGGTTATGGCTATAACTTAAACATACCTCTACCAAATGGAACAGGGGACAATGGG
TATATATATGCCTTCAAAGAGTTGGTTGTTCCATCAGTCCATAGATTTGGGCCTGATATGAT
AGTTATGGTTATTGGACAAGACTCAAGTGCATTTGATCCAAATGGAAGGCAATGCTTAAC
AATGGATGGCTATAGAGAAATTGGGAGGATAGTTCAAGGTCTTGCGACGAGGCACAGTG
ATGGACGGCTTCTAATTGTCCAGGAAGGTGGATATCATGTCACATATTCAGCATATTGTTT
ACATGCAACACTTGAGGGTGTTCTCAACCTACCATTGCCTCTACTACAAGATCCTGTTGC
TTGTTACCTAGAGGACGAGACATTTCCTGTCAAAGTTATAGAAGCCATTAAAAACTATAT
AAAAGATAAAATGCCCTTGTGGAAAACAGCTTAG
SEQ ID NO.11:
TATTGATGTTCATTATGGAAATGGCACAGCAGAAGGATTCTATTCATCTAATAAAGTTCTT
ACCATCTCTCTTCATATGAACCATGGATCATGGGGTCCATCTCATCCACAGAGTGGATCTG
TTGATGAGCTAGGTGAAGGAGAGGGTTATGGCTATAACTTAAACATACCTCTACCAAATG
GAACAGGGGACAATGGGTATATATATGCCTTCAAAGAGTTGGTTGTTCCATCAGTCCATA
GATTTGGGCCTGATATGATAGTTATGGTTATTGGACAAGACTCAGGTGCACT
SEQ ID NO.12:
MATTTDSIDAAAASSSTVNYIDVFWHEGMLKHDAGKGVFDTGMDPGFLDVLDNHPENSDRVKNMLSILKRGPISPYISWNLGRPALIPELLSFHTPEYVNELVEADKEGGKMLCAGTFLNPGSWDAALLAAGTTLSSMKHLLDGNGKVAYALVRPPGHHAQPSQADGYCFLNNAGLAVQLALDSGCKKVAVIDIDVHYGNGTAEGFYSSNKVLTISLHMNHGSWGPSHPQSGSVDELGEGEGYGYNLNIPLPNGTGDNGYIYAFKELVVPSVHRFGPDMIVMVIGQDSSAFDPNGRQCLTMDGYREIGRIVQGLATRHSDGRLLIVQEGGYHVTYSAYCLHATLEGVLNLPLPLLQDPVACYLEDETFPVKVIEAIKNYIKDKMPLWKTA*
SEQ ID NO.13:
ATGCGCTCCAAGGACAGAATCGCCTACTTCTACGACGGTGATGTGGGGAGTGTTTACTTT
GGGCCAAACCATCCCATGAAGCCTCACCGGCTATGCATGACCCACCATCTCGTTCTCTCG
TATGAGCTTCATAAGAAGATGGAAATTTATCGCCCGCACAAGGCTTATCCTGTTGAACTT
GCCCAGTTTCATTCAGCTGATTATGTTGAGTTTTTGCACAGGATTACACCTGACACTCAG
CACCTGTTCTCAAATGAACTGGCTAAATATAATCTCGGAGAAGACTGCCCTGTATTTGAC
AACTTATTTGAATTTTGTCAGATTTATGCTGGTGGAACTATAGATGCTGCACGCAGATTAA
ACAATCAACTGTGCGATATTGCTATAAACTGGGCTGGTGGACTACATCATGCCAAGAAAT
GTGAAGCATCTGGATTTTGTTACATCAATGACTTGGTTTTAGGGATCTTAGAGCTTCTTAA
GTATCATGCCCGTGTCTTGTATATTGATATAGATGTGCACCATGGGGATGGTGTAGAAGAA
GCCTTCTACTTTACTGACAGGGTGATGACTGTCAGTTTTCACAAGTTTGGAGATATGTTC
TTTCCAGGCACTGGTGATGCAAAGGAAATAGGAGAAAGAGAAGGAAAGTTTTATGCCAT
AAATGTCCCACTCAAGGATGGAATAGATGACCCTAGCTTCACTCGACTTTTCAAGACTAT
TATTTCCAAAGTAGTTGAAACATATCAACCTGGTGTGATAGTTCTCCAGTGTGGAGCAGA
TTCACTTGCTGGAGATCGCTTGGGCTGCTTCAATCTCTCTATTGATGGTCATGCTGAATGT
GTTAGATTCGTAAAGAGATTTAATTTGCCCTTACTGGTCACTGGAGGTGGGGGATACACG
AAAGAAAATGTTGCTCGGTGTTGGACAGTTGAAACTGGAGTTCTTCTAGATACGGAGCT
TCCAAATGAGATCCCAGAGAATGATTATATTAAATATTTTGCACCAGACTTCTCATTGAAG
ATTCCAAATGGGCACATAGAAAATTTAAATAGCAAATCATATCTTAGCACTATCAAAATGC
AAGTCTTGGAAAATCTCCGTTGCATCCAACATGCTCCAAGTGTACAAATGCAAGAGGTC
CCACCTGACTTCTACATTCCTGATTTCGATGAAGATGTGCAGAACCCTGATGAGCGCATT
GATCAGCACACTCAAGACAAGCACATCCAGCGCGACGATGAATATTATGAAGGTGACAA
CGACAATGATCATCAAATGGATGTTGCATAA
SEQ ID NO.14:
GCTGCTTCAATCTCTCTATTGATGGTCATGCTGAATGTGTTAGATTCGTAAAGAGATTTAA
TTTGCCCTTACTGGTGGGTTTATATCACTGTGTTTGCCTTCCATTCACCTGTATCATAAAGA
TCCCAGAGAATGATTATATTAAATATTTTGCACCAGACTTCTCATTGAAGATTCCAAATGG
GCACATAGAAAATTTAAATAGCAAATCATATCTTAGCACTATCAAAATGCAAGTCTTGGA
AAATCTCCGTTGCATCCAACATGCTCCAAGTGTACAAATGCAAGAGGTCCCACCTGACT
TCTACATTCCTGATTTC
SEQ ID NO.15:
MRSKDRIAYFYDGDVGSVYFGPNHPMKPHRLCMTHHLVLSYELHKKMEIYRPHKAYPVEL
AQFHSADYVEFLHRITPDTQHLFSNELAKYNLGEDCPVFDNLFEFCQIYAGGTIDAARRLNN
QLCDIAINWAGGLHHAKKCEASGFCYINDLVLGILELLKYHARVLYIDIDVHHGDGVEEAF
YFTDRVMTVSFHKFGDMFFPGTGDAKEIGEREGKFYAINVPLKDGIDDPSFTRLFKTIISKVV
ETYQPGVIVLQCGADSLAGDRLGCFNLSIDGHAECVRFVKRFNLPLLVTGGGGYTKENVAR
CWTVETGVLLDTELPNEIPENDYIKYFAPDFSLKIPNGHIENLNSKSYLSTIKMQVLENLRCI
QHAPSVQMQEVPPDFYIPDFDEDVQNPDERIDQHTQDKHIQRDDEYYEGDNDNDHQMDVA*
本发明中所用材料如下：
固体MS培养基，包括如下组分：4.43g/L MS培养基(Murashige&Skoog 15BasalMedium with Vitamins)、20g/L sucrose(蔗糖)、0.5g/L MES(吗啉乙磺酸)，调pH至5.7～6.0。
液体1/2MS培养基，包括如下组分：2.215g/L MS培养基(Murashige&Skoog BasalMedium with Vitamins)、20g/L sucrose、0.5g/L MES，调pH至5.7～6.0。
250mg/ml头孢母液配制包括以下步骤：称取12.5g头孢粉末，于50ml无菌去离子水溶解，并通过0.22μm滤膜过滤除菌，即得。
10mg/ml潮霉素母液配制包括以下步骤：称取0.5g潮霉素粉末，于50ml DMSO溶解，即得。
100mM MeJA(JA)母液配制包括以下步骤：吸取28.21μl 1.03g/ml的MeJA，于1.3ml无水乙醇溶解，并通过0.22μm滤膜过滤除菌，即得。
实施例1
本实施例克隆甘草GiFRPs基因，所述GiFRPs基因均来源于胀果甘草，其cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.13所示。
上述GiFRPs基因的cDNA阅读框可通过以下方法获得：
以实验室的胀果甘草甘草品种Gjj9为材料，提取其RNA，反转录为cDNA，根据已有的胀果甘草基因组序列设计引物克隆胀果甘草中GiFRPs基因CDS，pSuper-GiFRP1所述引物为SEQ ID NO.16所示的上游引物和下游引物；pSuper-GiFRP2所述引物为SEQ ID NO.17所示的上游引物和下游引物；pSuper-GiFRP3所述引物为SEQ ID NO.18所示的上游引物和下游引物；pSuper-GiFRP4所述引物为SEQ ID NO.19所示的上游引物和下游引物；pSuper-GiFRP5所述引物为SEQ ID NO.20所示的上游引物和下游引物。利用DNA高保真酶(High-Fidelity DNA Polymerase)进行PCR扩增，PCR反应体系为：cDNA模板：1μl；前引物(F):10uM；后引物(R)：10uM；PrimeStar Mix:5μl；ddH2O：3μl；总反应体系10μl。反应条件：94℃：5min，98℃：30s，55℃：30s，72℃：1min 30s，72℃：5min，16℃：∞；其中，98℃：30s，55℃：30s，72℃：1min 30s这三步33个循环。将10μl PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示。取目标条带进行测序，所得GiFRPs基因的CDS序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.13所示。
本实施例还以胀果甘草为材料，根据胀果甘草基因组序列设计引物从胀果甘草中克隆得到pRNAi-GiFRPs基因的CDS，其cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.14所示。克隆方法同上，pRNAiGG-Gi FRP1所述引物为SEQ ID NO.21所示的上游引物和下游引物；pRNAiGG-GiFRP2所述引物为SEQ IDNO.22所示的上游引物和下游引物；pRNAiGG-GiFRP3所述引物为SEQ ID NO.23所示的上游引物和下游引物；pRNAiGG-GiFRP4所述引物为SEQ ID NO.24所示的上游引物和下游引物；pRNAiGG-GiFRP5所述引物为SEQ ID NO.25所示的上游引物和下游引物。将10μl PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示。取目标条带进行测序，所得pRNAi-GiFRPs基因的CDS序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8、SE Q ID NO.11、SEQ ID NO.14所示。
SEQ ID NO.16:
F:5'GCTCTAGA ATGAATCTTATCCCAAAAATCATT 3'
R:5'CCCCCCGGG TGTGGCCTTTGTACCTCC 3'
SEQ ID NO.17:
F:5'AGAAAGCTTCTGCAGGGGCCCGGGATGAGGGAACCTCCGTCG 3'
R:5'TAGTATTTAAATGTCGACCCCGGGTGCAAGTCTTAACGATTTATCA 3'
SEQ ID NO.18:
F:5'GCTCTAGA ATGGGGATGGAGGAGGAGA 3'
R:5'CCC CCCGGG GCAACAAAAAGATGTATGCA 3'
SEQ ID NO.19:
F:5'GCTCTAGAATGGCTACTACGACGGATAGTATC 3'
R:5'CCCCCCGGGAGCTGTTTTCCACAAGGG 3'
SEQ ID NO.20:
F:5'AGAAAGCTTCTGCAGGGGCCCGGG ATGCGCTCCAAGGACAGAAT 3'R:5'TAGTATTTAAATGTCGACCCCGGG TGCAACATCCATTTGATGA 3'
SEQ ID NO.21:
F:5'ACCAGGTCTCAGGAGCAGAAAATGGAGGTGGATTTT 3'
R:5'ACCAGGTCTCATCGTCAGCAACCTCAAGTGCTTCA 3'
SEQ ID NO.22:
F:5'ACCAGGTCTCAGGAGTCCGCATACTCTTATCTCAAGCTC 3'
R:5'ACCAGGTCTCATCGTACCTTCCACCTGCCCACCT 3'
SEQ ID NO.23:
F:5'ACCAGGTCTCAGGAGTTTCCTTAGATCTTTCAATGTT 3'
R:5'ACCAGGTCTCATCGTCTAGTAGTGTGTTCCTTATTTTTT 3'
SEQ ID NO.24:
F:5'ACCAGGTCTCAGGAGTATTGATGTTCATTATGGAAATGGC 3'
R:5'ACCAGGTCTCATCGTAGTGCACCTGAGTCTTGTCCAAT 3'
SEQ ID NO.25:
F:5'ACCAGGTCTCAGGAGGCTGCTTCAATCTCTCTATTGAT 3'
R:5'ACCAGGTCTCATCGTGAAATCAGGAATGTAGAAGTCAG 3'
实施例2
本实施例提供一种甘草GiFRPs转基因毛状根，并检测其中LCA的含量。
实验方法：
1、重组表达载体、重组菌、转基因细胞系的获得
利用实施例1所述方法获得GiFRPs基因的CDS，然后将所述CDS连接到pSuper-GFP表达载体(Bouzakri et al.,2008)中，获得重组表达载体pSuper-GFP-GiFRPs。使用CaCl2介导的化学转化法将重组表达载体pSuper-GFP-GiFRPs导入发根农杆菌MSU440中。筛选抗链霉素和卡那霉素的农杆菌，进行菌液PCR，PCR使用的引物为：SEQ ID NO.26pSuper1300-F:5'GGATAAATAGCCTTGCTTCCTAT 3',pSuper1300-R:5'AACTTTATTGCCAAAT GTTTGAAC 3'；反应体系为：模板：1μl；pSuper1300-F:10uM；pSuper1300-R：10uM；T5 Mix:5μl；ddH2O：3μl；总反应体系10μl。反应条件：98℃：5min，98℃：30s，55℃：30s，72℃：1min 30s，72℃：5min，16℃：∞；其中，98℃：30s，55℃：30s，72℃：1min 30s这三步35个循环。挑选阳性菌落摇菌，扩大培养，至菌液OD值达到约0.5。
本实施例还以实施例1所述方法获得pRNAi-GiFRPs基因的CDS，然后将所述CDS连接到pRNAiGG表达载体(Yan et al.,2012)中，获得重组表达载体pRNAi-GiFRPs。使用CaCl2介导的化学转化法将重组表达载体pRNAi-GiFRPs导入发根农杆菌MSU440中。筛选抗链霉素和卡那霉素的农杆菌，进行菌液PCR，PCR使用的引物为：SEQ ID NO.27pRNAiGG-F:5'TCGAGAGTTCTCAACACAACATATAC 3',pccdb-R:5'CTTCTTCGTCTTACAC ATCACTTGT 3'；反应体系为：模板：1μl；pRNAiGG-F:10uM；pccdb-R：10uM；T5Mix:5μl；ddH2O：3μl；总反应体系10μl。反应条件：98℃：5min，98℃：30s，55℃：30s，72℃：1min 30s，72℃：5min，16℃：∞；其中，98℃：30s，55℃：30s，72℃：1min 30s这三步35个循环。挑选阳性菌落摇菌，扩大培养，至菌液OD值达到约0.5。
2、胀果甘草种子苗的种植
取300粒胀果甘草种子，置于50ml离心管中，加入10ml浓硫酸，浸泡15-20分钟。吸出浓硫酸，纯水快速冲洗5次，每次15ml，直至没有浓硫酸残留。加入20ml 2％NaClO，消毒15-20分钟。然后再倒出NaClO，用15ml无菌纯水清洗5次，每次静置10min。清洗完之后加入20ml无菌纯水，28℃、200rpm条件下震荡培养24h，甘草种子开始萌发，获得刚萌发的甘草种子苗。
3、胀果甘草毛状根诱导
用外植体浸染法浸染甘草外植体：在MS固体培养基上萌发6天的胀果甘草种子苗，在无菌超净工作台内将其下胚轴和子叶切下来，用于发根农杆菌浸染。浸染后的甘草外植体置于含有250mg/L头孢的1/2MS的培养基上，待胀果甘草毛状根从外植体长出3-5cm后，切下胀果甘草毛状根转移到含有250mg/L头孢的1/2MS培养基上。挑选能够在上述培养基上快速生长的胀果甘草毛状根转移到含有250mg/L头孢的1/2MS培养基中悬浮培养。
4、胀果甘草毛状根筛选
取液体培养的一部分毛根，提取DNA和RNA，以未转基因毛根为阴性对照(Control)，通过PCR筛选重组表达载体的转入情况，检测引物为：SEQ ID NO.28rolB-F:5'CTTATGA CAAACTCATAGATAAAAGGTT 3',rolB-R:5'TCGTAACTATCCAACTCACATCAC 3'；SEQ IDNO.29rolC-F:5'CAACCTGTTTCCTACTTTGTTAAC 3',rolC-R:5'AAACAAG TGACACACTCAGCTTC3'。反应体系为：cDNA模板：1μl；前引物(F):10uM；后引物(R)：10uM；T5 Mix:5μl；ddH2O：3μl。反应条件：98℃：5min，98℃：30s，52℃：30s，72℃：30s，72℃：5min，16℃：∞；其中，98℃：30s，52℃：30s，72℃：30s这三步35个循环。利用qRT-PCR实验技术用来检测GiFRPs基因的表达情况(以GiDR EB和GiCOPS作为内参)，内参引物为：SEQ ID NO.30GiDREB-F:GGTTGCTGAAATTC GGGAGC,GiDREB-R:CATTGGGGAAGTTGAGGCG；SEQ ID NO.31GiCOPS3-F:GGAAGCGCCAATACGAGG,GiCOPS3-R:ACAACAAGCACAGCAGAAGAAA。GiFRP1、GiFRP2、GiFRP3、GiFRP4、GiFRP5的检测引物一次为SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQID NO.36。反应体系为：cDNA模板：1μl；前引物(F):10uM；后引物(R)：10uM；TB Green Mix:5μl；ddH2O：3μl；总反应体系10μl。反应条件：(预变性)95℃：30s；(扩增)95℃：10s，60℃：30s；(融解曲线)95℃：1s，65℃：2.5s；(冷却)40℃：30s。其中，(扩增)95℃：10s，60℃：30s这一步40个循环。将具有显著高表达和显著低表达的GiFRPs的转基因毛根作为后续研究材料。
SEQ ID NO.32:
F:5'CAGAAAATGGAGGTGGATTTT 3'
R:5'CAGCAACCTCAAGTGCTTCA 3'
SEQ ID NO.33:
F:5'TCCGCATACTCTTATCTCAAGCTC 3'
R:5'ACCTTCCACCTGCCCACCT 3'
SEQ ID NO.34:
F:5'TTTCCTTAGATCTTTCAATGTT 3'
R:5'AGTAGTGTGTTCCTTATTTTTT 3'
SEQ ID NO.35:
F:5'TATTGATGTTCATTATGGAAATGGC 3'
R:5'AGTGCACCTGAGTCTTGTCCAAT 3'
SEQ ID NO.36:
F:5'GCTGCTTCAATCTCTCTATTGAT 3'
R:5'GAAATCAGGAATGTAGAAGTCAG 3'
5、甘草查尔酮A的提取
(1)将培养的胀果甘草毛状根使用液氮研磨并冻干，获得样品。
(2)纯甲醇提取：在每10mg样品中加入1ml甲醇，超声1小时，同时准备新的离心管，做好标记，超声结束后用移液枪吸取上清液至新的离心管；样品中再次加入1ml纯甲醇，超声1小时，两次合并滤液，蒸干浓缩。
(3)溶解：吸取300μl纯甲醇重悬提取的化合物，所得的提取液用0.22μm滤膜过滤，收集滤液(含LCA)。
6、甘草查尔酮A的含量测定
(1)色谱系统：采用C18柱(150mm×4.6mm,5μm,Shimadzu,Kyoto,Japan)，柱温40℃，流速1ml/min，进样量10μl；流动相A：乙腈，流动相B：0.1％甲酸水；梯度洗脱：t＝0min,30％A；t＝25min,55％A；t＝27min,95％A；t＝30min,95％A；t＝31min,30％A；t＝35min,30％A.LCA的检测波长为370nm。理论板数按LCA峰计算，应不少于8000。
(2)LCA含量计算：通过用不同浓度的LCA标品在HPLC上检测峰面积，建立浓度与峰面积之间的标准曲线，标品质量浓度与吸收值强度间具有良好线性。
结果参见图2。本实施例以胀果甘草GiFRPs转基因毛状根为实验材料，GiFRPs转基因毛状根在含有250μg/ml头孢的1/2MS液体培养基中生长一个月，筛选得到GiFRPs基因表达显著上调和显著下调的毛状根。如图2所示，与WT(未转基因毛根)相比，高表达的转基因毛状根OE-GiFRPs中LCA的含量均显著降低(几乎为0)，而基因表达显著下调的RN Ai-GiFRPs中LCA的含量均显著升高，如RNAi-GiFRP1的转基因毛状根中LCA含量约108ng/mg，与WT相比升高约10倍；RNAi-GiFRP2的转基因毛状根中LCA含量约188ng/mg，与WT相比升高约10倍；RNAi-GiFRP3的转基因毛状根中LCA含量约457ng/mg,与WT相比升高约27倍；RNAi-GiFRP4的转基因毛状根中LCA含量约141ng/mg,与WT相比升高约8倍；RNAi-GiFRP5的转基因毛状根中LCA含量约137ng/mg,与WT相比升高约8倍。说明GiFRPs负调控甘草中的甘草查尔酮A的合成积累。
实施例3
本实施例提供一种通过利用GiFRP3和GiFRP4基因负调控胀果甘草总黄酮、异甘草苷、大豆苷元、刺甘草查尔酮、异甘草素和甘草查尔酮C的合成积累的应用。
1、胀果甘草种子苗的种植
方法同实施例2
2、胀果甘草毛状根诱导
方法同实施例2
3、胀果甘草毛状根筛选
方法同实施例2
4、甘草总黄酮的提取
(1)将培养的胀果甘草毛状根使用液氮研磨并冻干，获得样品。
(2)冻干后称取10mg样品，置于2ml离心管。
(3)80％甲醇提取：将装有样品的2ml离心管中加入1ml 80％甲醇，超声提取1小时(240W，常温)。获得的提取液12000g离心2min，将上清液收集到新的2ml离心管中。超声提取重复两次。上清液收集后用0.22μm滤膜过滤，收集滤液(含总黄酮)。
5、甘草总黄酮的含量测定
总黄酮的检测方法使用分光光度法，根据《中国药典》2020版中的方法检测样品的OD值。具体如下：将2ml提取物加入10ml容量瓶中，然后加入1ml 5％Na2NO3溶液，充分混合后，溶液在室温下反应6分钟。然后，将1ml 10％Al(NO3)3溶液添加到容量瓶中，充分混合并在室温下保持6分钟。最后，将5ml 5％NaOH加入到容量瓶中，充分混合并反应15分钟。所得溶液在510nm处测定其吸光值。芦丁作为标品用于标准。
4、异甘草苷、大豆苷元、刺甘草查尔酮、异甘草素和甘草查尔酮C的提取
方法同实施例2甘草查尔酮A的提取
5、异甘草苷、大豆苷元、刺甘草查尔酮、异甘草素和甘草查尔酮C的含量测定
(1)色谱系统：采用C18柱(150mm×4.6mm,5μm,Shimadzu,Kyoto,Japan)，柱温40℃，流速1ml/min，进样量10μl；流动相A：乙腈，流动相B：0.1％甲酸水；梯度洗脱：t＝0min,30％A；t＝25min,55％A；t＝27min,95％A；t＝30min,95％A；t＝31min,30％A；t＝35min,30％A.异甘草苷、大豆苷元的检测波长为254nm，刺甘草查尔酮、异甘草素和甘草查尔酮C的检测波长为370nm。
(2)异甘草苷、大豆苷元、刺甘草查尔酮、异甘草素和甘草查尔酮C含量计算：通过用不同浓度的标品在HPLC上检测峰面积，建立浓度与峰面积之间的标准曲线，标品质量浓度与吸收值强度间具有良好线性。
结果参见图3～4。本实施例以胀果甘草GiFRP3和GiFRP4转基因毛状根为实验材料，GiFRP3和GiFRP4转基因毛状根在含有250μg/ml头孢的1/2MS液体培养基中生长一个月，筛选得到GiFRP3和GiFRP4基因表达显著上调和显著下调的毛状根。如图3所示，与WT相比，高表达的转基因毛状根OE-GiFRP3中的总黄酮、异甘草苷、大豆苷元、刺甘草查尔酮、异甘草素和甘草查尔酮C含量均无明显变化，而基因表达显著下调的RNAi-GiFRP3中总黄酮、异甘草苷、大豆苷元、刺甘草查尔酮、异甘草素和甘草查尔酮C的含量均显著升高，如RNAi-GiFRP3中总黄酮含量约67mg/g，而WT中总黄酮含量约37mg/g，升高约2倍；RN Ai-GiFRP3中异甘草苷含量约65ng/mg，而WT中异甘草苷含量约33ng/mg，升高约2倍；RNAi-GiFRP3中大豆苷元含量约3328ng/mg，而WT中异甘草苷含量约1323ng/mg，升高约2.5倍；RNAi-GiFRP3中刺甘草查尔酮含量约1ng/mg，而WT中异甘草苷含量约0.04ng/mg，升高约25倍；RNAi-GiFRP3中异甘草素含量约1.4ng/mg，而WT中异甘草苷含量约0.14ng/mg，升高约10倍；RNAi-GiFRP3中甘草查尔酮C含量约3.7ng/mg，而WT中异甘草苷含量约0.3ng/mg，升高约12倍。说明GiFRP3负调控胀果甘草中总黄酮、异甘草苷、大豆苷元、刺甘草查尔酮、异甘草素和甘草查尔酮C的合成积累。
如图4所示，结果与GiFRP3转基因毛状根相似。与WT相比，高表达的转基因毛状根OE-GiFRP4中的总黄酮、异甘草苷、大豆苷元、刺甘草查尔酮、异甘草素和甘草查尔酮C含量均无明显变化，而基因表达显著下调的RNAi-GiFRP4中总黄酮、异甘草苷、大豆苷元、刺甘草查尔酮、异甘草素和甘草查尔酮C的含量均显著升高，其中总黄酮含量约55mg/g，与WT相比升高约1.5倍；异甘草苷含量约83ng/mg，与WT相比升高约2.3倍；大豆苷元含量约3328ng/mg，与WT相比升高约2.5倍；刺甘草查尔酮含量约0.4ng/mg，与WT相比升高约11倍；异甘草素含量约0.4ng/mg，与WT相比升高约2.5倍；甘草查尔酮C含量约4ng/mg，与WT相比升高约13倍。说明GiFRP4负调控胀果甘草中总黄酮、异甘草苷、大豆苷元、刺甘草查尔酮、异甘草素和甘草查尔酮C的合成积累。
如图5所示，高表达的转基因毛状根OE-GiFRP4生长速度明显高于的pSuper空载诱导的转基因毛状根OE(上)，用100μM的MeJA处理OE和OE-GiFRP4毛状根，OE-GiFRP 4-JA中总黄酮含量约为138mg/g干重，比OE-CK(36mg/g干重)提高约4倍，OE-GiFR P4-JA中LCA含量约为727ng/mg干重，比OE-CK(3.9ng/mg干重)提高约184倍。
以上实验结果表明，OE-GiFRP4毛状根受MeJA处理后能够显著促进总黄酮和LCA的合成积累。因此，GiFRP4基因将可以应用于培育高品质的甘草品种，提高甘草的药用价值和经济价值。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (3)
1.胀果甘草GiFRP4基因过表达在促进胀果甘草毛状根生长中的应用；
所述胀果甘草GiFRP4基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
2.一种提高胀果甘草异甘草苷、大豆苷元含量的方法，其特征在于，所述方法为将胀果甘草GiFRP3基因或胀果甘草GiFRP4基因的敲除载体转入胀果甘草毛状根，并使其表达；
所述胀果甘草GiFRP3基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述胀果甘草GiFRP4基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的敲除载体中的沉默基因分别是：
胀果甘草RNAi-GiFRP3沉默基因，所述胀果甘草RNAi-GiFRP3沉默基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
胀果甘草RNAi-GiFRP4沉默基因，所述胀果甘草RNAi-GiFRP4沉默基因的cDNA阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
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| Jiangyi Zeng等.Histone Deacetylase GiSRT2 Negatively Regulates Flavonoid Biosynthesis in Glycyrrhiza inflata.《Cells》.2023,第12卷(第11期),摘要，第3页第3段，第6页图2. * |
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