CN112301038A

CN112301038A - 人参wrky64-04基因及其应用

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Publication number: CN112301038A
Application number: CN202011157639.2A
Authority: CN
Inventors: 张美萍; 王�义; 王康宇; 赵明珠; 李俐; 于恩; 刘涛
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2020-10-26
Filing date: 2020-10-26
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2040-10-26
Also published as: CN112301038B

Abstract

本发明公开了人参WRKY64‑04基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.2所示；一种植物超表达载体，它插入了如序列表SEQ ID NO.2所示的基因；人参WRKY64‑04基因在提高人参皂苷方面的应用。本发明优点：超表达人参WRKY64‑04基因，可以提高总皂苷与单体皂苷Rb1、Rd、Rg1和Re的含量。

Description

人参WRKY64-04基因及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及人参WRKY64-04基因及其应用。

背景技术

人参（Panax ginseng C. A. Meyer）为五加科（Araliaceaae）人参属植物，被称为“中药之王”，是闻名遐迩的“东北三宝”之一，驰名中外，享誉世界。吉林省是我国主要的人参产区，人参及其产业不仅是吉林省重要的经济组成部分，同时也是我国国民经济中最具特色的产业之一。人参具有极高的药用价值、研究价值及经济价值，人参主根入药的文字记载可追溯至至少2,000年前，《神农本草经》及《本草纲目》等中药典籍将其列为中药上品。现代医学研究表明，其在治疗疾病及保健方面具有重要功能。但是由于人参具有极高的药用价值及保健功能，市场需求量非常大。

植物在长期进化中形成了一系列机制，有的为了适应环境，有的对自生代谢产物相关，在这些机制中，基因表达调控了一些次生代谢产物的合成，转录因子在其中扮演着不可忽视的作用。WRKY转录因子是植物中特有的转录因子，可以参与植物的生长发育，形态建成和代谢调控等功能。最新研究发现WRKY转录因子可以参与植物次生代谢产物的合成，参与人参皂苷生物合成的机制研究成为可能。人参的生理活性成分种类多样，包括人参皂苷，多糖、黄酮类、挥发油、氨基酸、肽类、蛋白质、维生素、甾醇类、微量元素等。人参皂苷属于三萜类化合物，是人参最主要的有效活性成分，具有降糖、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等作用，是人参的次级代谢产物，主要通过甲羟戊酸（MVA）途径合成。

发状根生长迅速，稳定性强、变异性弱，而且培养时不受环境条件的限制，这些特点使其成为药用植物资源可持续发展的有效途径之一，利用发根农杆菌诱导药用植物产生的发状根，能合成该植物体中的有效药用成分，同时通过现代生物技术手段，可以实现定向改变药用植物中某一有效成分的含量或者种类，控制新成分合成，得到价值更高的产品。利用发根培养技术代替野生或人工栽培人参，不但可以缓解日益增长的市场需求，而且解决了人参栽培条件高、不能连做、抗病虫害能力弱等缺点，同时缩短了人参的生长周期，节省了大量种植人参的土地。

发明内容

本发明目的是为了提高人参中的皂苷含量，而提供一种人参WRKY64-04基因及其应用。

人参WRKY64-04基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

一种植物超表达载体，它插入了如序列表SEQ ID NO.1所示的基因。

人参WRKY64-04基因在提高人参皂苷含量方面的应用。

本发明提供了人参WRKY64-04基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示；一种植物超表达载体，它插入了如序列表SEQ ID NO.1所示的基因；人参WRKY64-04基因在提高人参皂苷方面的应用。本发明优点：超表达人参WRKY64-04基因，可以提高总皂苷与单体皂苷Rb1、Rd、Rg1和Re的含量。

附图说明

图1 基因克隆结果；

图2 大肠杆菌菌液PCR结果；

图3 植物表达载体酶切验证；

图4 农杆菌菌液PCR结果；

图5 人参发状根诱导；

图6 PCR检测结果；1-7，8-14，15-21，转PgWRKY64-04基因人参发状根DNA；6-7、13-14及20-21为3301表达载体上元件GFP和Bar转入人参发状根；5、12及19为转PgWRKY64-04基因人参发状根DNA；

图7 人参发状根的总皂苷含量检测；

图8 人参发状根的4种单体皂苷含量检测。

具体实施方式

材料来源：四年生人参大马牙主根，采自吉林省集安市。

实施例1 PgWRKY64-04基因的克隆

1、人参根总RNA提取及cDNA合成

用TRIZOL Plus提取4年生人参鲜根的总RNA，取1μg总RNA反转录为cDNA模板。

2、PgWRKY64-04基因全长ORF的克隆

PgWRKY64-04基因序列ORF长度为681bp，序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

利用Primer 5.0软件，设计添加XmaI酶切位点的PgWRKY64-04基因的引物PgWRKY64-04-F及引物PgWRKY64-04-R：

PgWRKY64-04-F：5’-TCCCCCGGGCGGGATCCCCGGCAACCCTGTATACATATG-3；

PgWRKY64-04-R：5’- TCCCCCGGGTGTCGAGAATGCTTTCCAGG -3’。

以4年生人参鲜根cDNA为模板，进行PCR扩增，从而获得PgWRKY64-04基因的全长序列（图1）。将获得的PgWRKY64-04基因全长cDNA进行胶回收，回收产物与T载体16℃连接过夜，连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有100 mg/L氨苄青霉素的抗性平板筛选转化子，挑取单克隆摇菌后进行菌液PCR（图2），取阳性克隆送测序公司测序。

实施例2 PgWRKY64-04基因植物超表达载体的构建

将上述测序正确的单克隆提取质粒DNA，用XmaI进行单酶切，同时将植物表达载体3301用XmaI单酶切，将酶切产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切后的载体3301的大片段及PgWRKY64-04基因片段，添加T4连接酶16℃连接过夜，将连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有50mg/L卡那霉素的抗性平板筛选转化子，挑取单克隆摇菌后进行菌液PCR鉴定和酶切鉴定（图3），均有目的条带，说明超表达载体构建成功，命名为3301- PgWRKY64-04。

冻融法转化发根农杆菌C58C1，进行PCR验证（图4），添加甘油保存阳性转化子于-80℃冰箱。

实施例3 农杆菌介导法转化PgWRKY64-04基因

将构建好的3301- PgWRKY64-04通过农杆菌介导法转化人参外植体，具体实施方案如下：

（1）外植体材料：人参不定根

（2）菌种的活化：取携带3301- PgWRKY64-04的C58C1菌种在固体LB平板划线，28℃暗培养2-4d，待长出单菌落后置于4℃冰箱待用；

（3）预培养：取人参不定根，切成约0.5-1 cm长的切段，接入添加激素1 500μl和激素250μl的 250ml固体MS培养基，在22℃、弱光条件下培养1d；

（4）浸染：取平板活化的携带3301- PgWRKY64-04的C58C1菌种，挑取单菌落接入液体LB培养基，28℃、180rpm摇床培养，待菌液生长浓度达到OD600=0.4时，收集菌体，用添加200μmol/L As的1/2 MS液体培养基重悬菌体至OD600=0.4，将重悬好的菌液置于28℃、50rpm摇床活化1h，将添加200μmol/L As的 1/2MS固体培养基平板培养皿，上面覆盖滤纸，把预培养的不定根切成小段放到滤纸上。将切完的根放入重悬菌液中，侵染15 min，灭菌滤纸吸干材料表面菌液，接于1/2 MS培养基置于22℃、黑暗条件共培养1 d；

（5）除菌：用无菌滤纸吸干侵染完的材料表面的菌液，然后将外值体材料置于固体1/2MS + 100mg/L头孢，22℃、暗培养，一个月后发根即可长出（图5）；

（6）PCR分子检测：对Ri质粒T-DNA区的rolC基因、GFP基因和Bar基因及3301-PgWRKY64-04载体的T-DNA区（载体左臂+基因5’端，基因中间区段，基因3’端+载体右臂以及3301全长）进行PCR检测，设计引物如下，检测结果如图6所示，说明已成功获得超表达PgWRKY64-04基因的人参发状根。

rolC-F：5’-ATGGCTGAAGACGACTTGTGTTC-3’;

rolC-R：5’-TTAGCCGATTGCAAACTT-3’;

GFP-F:5'- ATGGCCACAAGTTCAGCG-3'

GFP-R: 5'- GGTGGACAGGTAGTGGTTATCG -3'

Bar-F: 5'-AAACCCACGTCATGCCAGCTC-3'

Bar-R：5'-CGACAAGCACGGTCAACTTC-3'

3301- PgWRKY64-04-LF：5’-CGCTCTTTCTTTCCAAGGTAATAG-3’；

PgWRKY64-04-3’F：5’-TGAGGGAGTCTACCAGGAGC-3’；

PgWRKY64-04-5’R：5’-GAGAACAAAGAGTGAGAGGAGAGGG-3’；

3301- PgWRKY64-04-RR：5’-GTTGTACTCCATCTTATTGCCCAG-3’；

实施例4 转基因人参发状根皂苷含量检测

（1）供试品溶液的制备

选取培养出的阳性发状根株系2、阳性发状根株系6及阳性发状根株系11，分别取适量人参发状根，磨成粉末，用滤纸包好，加40 mL甲醇浸泡过夜后超声提取30 min；将滤纸包及甲醇提取液置于索氏提取器中，再加入60 mL甲醇，90 ℃提取，每隔12 h收集提取液，同时加入100 mL甲醇，重复3次；将提取液蒸干，加10 mL色谱甲醇回溶，经0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液；

（2）标准曲线的绘制

称取适量Re标准品，配成终浓度1.068 mg/mL标准溶液，分别取30 μL、60 μL、90 μL、120 μL、150 μL、180 μL置于具塞10 mL刻度试管中，60℃以下蒸干，加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL摇匀，将试管置于60 ℃恒温水浴锅加热15 min，流水冷却2 min，再加入5 mL冰醋酸充分摇匀，随行试剂做空白对照，于556 nm波长处测定吸光度值，以吸光度值为X轴，皂苷含量为Y轴，绘制标准曲线；

（3）样品总皂苷含量的测定

精密吸取供试品溶液0.1 mL 至10 mL具塞刻度试管中，按上述方法进行吸光度值测定，每个样品做三个平行，每个平行测三次重复，计算皂苷含量；野生型发状根为对照组；结果如图7所示，阳性发状根株系2、阳性发状根株系6及阳性发状根株系11的总皂苷含量显著高于野生型发状根含量，证明超表达PgWRKY64-04能够促进人参总皂苷合成。

（4）样品单体皂苷含量的测定

高效液相色谱法检测人参皂苷含量：将购买的4种单体皂苷（Rb1、Rd、Rg1和Re）标准品粉末以色谱甲醇配置为浓度约为1.0 mg/mL的单体皂苷标准品溶液，并取等体积各单体皂苷标准品溶液配置成混合标准品溶液。将单体皂苷标准品溶液、混合标准品溶液及提取的人参发状根皂苷样品以高效液相色谱法进行检测。

a.色谱条件：Waters C18色谱柱（4.6×250 mm，5 μm），流动相为乙腈和水，流动相流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 μL，检测波长为203 nm。

b.单体皂苷含量的计算公式：标准品浓度/标准品峰面积=样品浓度/样品峰面积。野生型发状根为对照组；结果如图8所示，与野生型发状根比较，阳性发状根株系的单体皂苷Rb1、Rd、Rg1和Re含量均显著提高，表明超表达PgWRKY64-04能够促进人参单体皂苷合成。

序列表

<110> 吉林农业大学

<120> 人参WRKY64-04基因及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 681

<212> DNA

<213> 人参(Panax ginseng C. A. Meyer)

<400> 2

atgattaatg atatatgcaa caagatggag tactacaata gatttgtgca cgatcaagat 60

gattccccgg aaactgcctc tggctctcca ctttccggcg aggataccat tatggccgat 120

accccgtcac ccaagaaaag taggaggatt gcagggaaga gagtggtgac agtggcaata 180

gccgatgggg atgtatatcc acctgctgat tcgtgggctt ggagaaaata tggacaaaaa 240

ccgatcaaag gttcacctaa tcccagggga tactaccggt gtagcagttc aaaaggctgt 300

ccggcaagaa aacaagtaga gaggagtcga aaagacccca ccgtggttgt aatcacctat 360

gcttgtgaac acaaccacct cattcccacc accaccaaac actctcaacc caccattccc 420

gtcaagtttc caccagaaga agtcgtggtt tttgccaacc agacagacct tgaacctgac 480

aacatagact ttgccgagtt cgttgctgat tttggctatt tcaccaacat aacgtctgtc 540

atactagaga gcactgtaat tacaagcccc agatgcatgg aacccgattc agcagtgatt 600

ttcacaaggg gagatgatga ggattccttg tttgctgacc ttggtgagct accgggatgt 660

tcactaattt ttcagcagta a 681

<210> 2

<211> 1465

<212> DNA

<213> 人参(Panax ginseng C. A. Mey)

<400> 2

ccggcaaccc tgtatacata tgcatataca tatacatatt tagtttatta gtgtacatga 60

tcatgtttgc ctcgtctcta actttctaga ttaaacactt taattaatta ctacaattta 120

tatcatattt ttatgattaa tgatatatgc aacaagatgg agtactacaa tagatttgtg 180

cacgatcaag atgattcccc ggaaactgcc tctggctctc cactttccgg cgaggatacc 240

attatggccg ataccccgtc acccaagaaa agtaggagga ttgcagggaa gagagtggtg 300

acagtggcaa tagccgatgg ggatgtatat ccacctgctg attcgtgggc ttggagaaaa 360

tatggacaaa aaccgatcaa aggttcacct aatcccaggg gatactaccg gtgtagcagt 420

tcaaaaggct gtccggcaag aaaacaagta gagaggagtc gaaaagaccc caccgtggtt 480

gtaatcacct atgcttgtga acacaaccac ctcattccca ccaccaccaa acactctcaa 540

cccaccattc ccgtcaagtt tccaccagaa gaagtcgtgg tttttgccaa ccagacagac 600

cttgaacctg acaacataga ctttgccgag ttcgttgctg attttggcta tttcaccaac 660

ataacgtctg tcatactaga gagcactgta attacaagcc ccagatgcat ggaacccgat 720

tcagcagtga ttttcacaag gggagatgat gaggattcct tgtttgctga ccttggtgag 780

ctaccgggat gttcactaat ttttcagcag taagacgaac aatgctttcc gcatagtcct 840

ccttacaaaa gtatatgaca gtaaatattc attacaacta tgataacatg atttttatgc 900

aggtatgcac gtgataaaaa ctatagatgt aacctccatt gtaacaatat tttttccccc 960

tgatcagatg acctctttag ccacaacctt aggtcccttg aatgttaatg tgtgaacatg 1020

tatagtaata ggctaccctt gcaggagggg gcttttgagc gaaagctttt cagcaaattc 1080

acataacata tatatatttt tattgttcga tcaacccata caaaaaagcc acaatctgaa 1140

cctatttaaa caatgcttcc acaaaaatat tcctttctat attctcatgg ataatattca 1200

tcgtaaatga aaaagataat gtacaaagaa acaacactaa tgtggcaagt ttccaactca 1260

aaaggcctag cttgagcagc aaccaaatct cttgagaaca gatgagtcgt ctttgacatt 1320

tatcgtctct cctttggatg ggagggaaga aacggctcct tcgtccccag tttcaaccgt 1380

cttcttgctg acaacacgat atatctgagt aagaacttcc tggaaagcat tctcgacatt 1440

ggttgcttct agtgcagaag tctcc 1465

Claims

1.人参WRKY64-04基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.一种植物超表达载体，它插入了如序列表SEQ ID NO.1所示的基因。

3.人参WRKY64-04基因在提高人参皂苷方面的应用。