CN117679395B

CN117679395B - 一种多肽包覆槲皮素的分子胶囊及其制备方法

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Publication number: CN117679395B
Application number: CN202311714300.1A
Authority: CN
Inventors: 梅鹤祥; 任传鹏; 高颖
Original assignee: Shanghai Beisili Industrial Co ltd
Current assignee: Shanghai Beisili Industrial Co ltd
Priority date: 2023-12-13
Filing date: 2023-12-13
Publication date: 2024-05-17
Anticipated expiration: 2043-12-13
Also published as: CN117679395A

Abstract

本发明属于分子技术领域，尤其涉及一种多肽包覆槲皮素的分子胶囊及其制备方法。所述方法包括：(1)将氨基酸A、槲皮素与水按照比例混合，超声酶解，制备前驱体；(2)将前驱体与氨基酸B按照比例混合，制备分子胶囊前驱体；(3)将分子胶囊前驱体加入结晶器中，进行外层结构重晶化，过滤高压烘干，制备多肽包覆槲皮素分子胶囊。本发明通过优化药物晶体的粉体学特性，可以有效提高所构建的分子胶囊中槲皮素的生物利用率，并且通过特异性的球径实现可控缓释，以更好地控制槲皮素的释放速率和释放量。

Description

一种多肽包覆槲皮素的分子胶囊及其制备方法

技术领域

本发明属于分子技术领域，尤其涉及一种多肽包覆槲皮素的分子胶囊及其制备方法。

背景技术

檞皮素(Quercetin)，也称作五羟黄酮、檞黄酮，又称栎精，是一种植物性黄酮醇，属于多酚中的黄酮类化合物，存在于水果、蔬菜和谷物等植物中。就目前而言，槲皮素尚未有明确的研究表明其具有治疗疾病的作用，但在C L T J H A B,A L G P L P,C S A B,etal.Senolytics decrease senescent cells in humans∶Preliminary report from aclinical trial of Dasatinib plus Quercetin in individuals with diabetickidney disease[J].一文中，其展示了槲皮素在临床医学中的潜在价值以及潜在的效用，这使得对于槲皮素的研究和利用进一步得到了重视。

在近年来，Stewart L K,Soileau J L,Ribnicky D,et al.Quercetintransiently increases energy expenditure but persistently decreasescirculating markers of inflammation in C57BL/6J mice fed a high-fat diet.[J].等文章也表明了其在体表使用上具有巨大的使用前景，能够实现消炎和促进代谢等作用。

但就目前的研究而言，却也发现了槲皮素存在着较大的使用缺陷。其主要在于槲皮素的释放率高但释放深度小，导致其实际的有效利用率不高。

而对此，目前主流的研究方向即是构建用于包裹槲皮素的容器分子，形成分子胶囊。特别是通过氢键、静电作用、卤键、疏水作用及金属配位键等非共价相互作用构筑的可逆的超分子胶囊。但现有技术方案制备包被槲皮素的分子胶囊会出现载药量低，生物利用率较差，药物刺激性较强，药物有效时间释放过于缓慢等技术不足。

发明内容

为解决现有的槲皮素使用缺陷，以及现有的槲皮素分子胶囊所存在的载药量低、生物利用率较差、刺激性强以及释放可控性差等问题，本发明提供了一种多肽包覆槲皮素的分子胶囊，以及该分子胶囊的制备方法。

本发明的主要目的在于：

一、能够提高槲皮素分子胶囊的生物安全性，降低刺激性；

二、能够提高槲皮素分子胶囊的载药量；

三、实现可控释放，以提高槲皮素胶囊的实际利用效果。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种多肽包覆槲皮素的分子胶囊的制备方法，

所述方法包括：

(1)将氨基酸A、槲皮素与水按照比例混合，超声酶解，制备前驱体；

(2)将前驱体与氨基酸B按照比例混合，制备分子胶囊前驱体；

(3)将分子胶囊前驱体加入结晶器中，进行外层结构重晶化，过滤高压烘干，制备多肽包覆槲皮素分子胶囊。

作为优选，

步骤(1)所述氨基酸A为L-组氨酸；

步骤(1)所述氨基酸A、槲皮素和水以质量比0.9～1.2)：1：(3～5)的比例混合。

作为优选，

步骤(1)所述超声酶解过程采用活力为2000～3000U/g干基的中性蛋白酶；

所述中性蛋白酶的用量为槲皮素的8～12wt％。

作为优选，

步骤(2)所述氨基酸B为β-丙氨酸(D型)和L-组氨酸混合物；

所述氨基酸B中L-组氨酸的含量为28～32wt％，余量为β-丙氨酸(D型)。

作为优选，

步骤(2)所述制备分子胶囊前驱体的过程中，控制反应温度为45～50℃，并调节反应体系pH值至6.8～7.2，反应过程中加入活力为600U/mL的蛋白酶K(液体)，蛋白酶K(液体)的添加量为氨基酸B的4～6wt％。

作为优选，

步骤(3)所述重晶化过程于30～35℃条件下进行，重晶化过程控制结晶器转速为300～400rpm，重晶化持续进行1～2h。

作为优选，

所述高压烘干于24～26℃、4～6MPa条件下进行4～5h。

一种多肽包覆槲皮素的分子胶囊。

槲皮素通过邻二酚羟基的单电子转移方式，直接与超氧阴离子和羟自由基反应，作为一个供氢体，在此过程中，槲皮素形成更稳定的分子内氢键，阻止不饱和脂肪酸、花生四烯酸的过氧化，减少对生物膜的破坏；槲皮素能够通过作用于自由基相关的酶，导致蛋白质沉淀，阻止氧自由基的合成；槲皮素还能够与细胞体内金属离子螯合，抑制羟自由基的产生。

纳米载药系统是一种利用纳米粒子搭载药物(本发明中如无特殊说明，药物均特指槲皮素)的特殊剂型，可以改善药物使用中存在的各种问题，其中以生物膜为基础的纳米载药系统作为一种仿生药物载体具有更加优秀的性能。

生物膜外层是磷脂双分子层构成的膜，内部是一个空腔可以负载大分子、小分子和核酸类物质，具有良好的生物传递性以及缓释作用。但是使用过程中发现生物膜与药物的相容性问题以及药物本身不稳定的问题，导致药物包载率不高，包载不均匀，稳定性较差。

而对此，本发明使用L-肌肽为基材利用包埋络合法制备分子胶囊，L-肌肽作为生物活性多肽，在医药、化妆品、保健品、食品等领域具有广泛的应用前景，同时分子胶囊技术可以将芯材与周围环境隔开，减少了外界环境(水、光、氧气、温度等)对芯材的破坏，从而改善和提高芯材物质的表观和性质，有益于这些营养物质的贮藏、运输和食用，壁膜还具有缓释功能，可控制具有生物功能活性成分芯材的释放速度，对人体充分发挥作用。此外，起遮蔽效果的壁材，可以掩盖芯材的不良色泽、气味、苦味等。因此，该技术在食品、医药、生物等方面有着广泛的应用。

在本发明技术方案中分子胶囊是两个或者两个以上的分子通过可逆的分子间非共价相互作用连接在一起形成具有特殊三维立体空腔的特殊结构，在控制药物释放、催化、分离、材料科学和生物医药等领域具有潜在的应用价值，本发明还通过超声酶解处理氨基酸和槲皮素分子，促进氨基酸分子展开速度，从而加快水解速度，超声酶解不仅能够提高前驱体的溶解度，提高ACE抑制肽的活性，还能生成大量具有提高抗氧化活性的前驱体，超声处理后的前驱体可直接制备低过敏性生物活性肽。

在上述的构建过程中，由于肌肽本身与槲皮素具有双端结合的特性，肌肽是一种二肽，其单体分别为L-组氨酸和β-丙氨酸(D型)，而L-组氨酸和β-丙氨酸(D型)与槲皮素均能够产生分子间结合，因而若直接采用肌肽结合槲皮素，由于两个单体所产生的体积效应不同，导致肌肽的实际结合方式较为混乱，最终导致一定程度上减少载药量，并且由于外端成分和活性基团分布不均，导致渗透性减弱，并且在实际使用过程中载药量减少、药物释放能力可控性差。而本发明通过以单体首先实现L-组氨酸实现与槲皮素的初步结合构成前驱体，而后再加入β-丙氨酸(D型)实现肌肽的反应构建，能够有效确保肌肽于槲皮素的结合形式，以确保最终产品性状和效果的稳定性。

所构成的分子胶囊中，一方面分子胶囊的壁材对效果起决定性作用，影响包埋后产品的流动性、渗透性、溶解性和缓释性能，理想壁材需与芯材兼容、稳定性好、吸湿性和溶解性好、化学性质稳定、来源广泛且价格低廉；另一方面以肌肽为基材的分子胶囊具有一定空腔的骨架和能够可逆相互作用的键合单元，肌肽分子由于具有上宽下窄、内有“杯状”空穴的结构特点，易于衍生化引入特定功能基团，成为构筑超分子胶囊的理想骨架。

在本发明技术方案中进行外层结构重晶化，经过改性，得到的产品呈现球形，但是其聚结痕迹并不杂乱，而是一个呈放射状有序排列的多晶聚结体，该聚结体起初形成丝状纤维，随后从纤维状的两端开始分叉生长，形成中间窄两头粗的“麦束状”晶体，最终，通过持续的小角度分叉，形成具有球形形态的球晶。利用球形结晶技术，将小粒度的针状槲皮素转化为紧密的球形晶体，这种转化过程提高了产品的球形度和粒度，同时降低了晶体间的静电作用和摩擦力，因此，这种方法显著改善了原料药的流动性、可压缩性、以及堆密度等粉体学特性，通过球形结晶技术，制备用肌肽为载体包裹槲皮素的球形微粒，能够达到槲皮素的缓控释放。在本发明技术方案中，研究人员成功制备了一种具有特异性能的球晶。该球晶的熵值显著偏低，这有利于维持其高度有序的结构，从而能够更好地保持其形状和尺寸。此外，它的熔点极高，意味着它能够在高温环境中保持稳定的性能，展现出色的热稳定性。该球晶的溶解度及溶出速率都明显偏低，这使得它能在体内以较慢的速度释放，从而能够更好地发挥其药效。这种缓慢的释放速度不仅提高了药物的生物利用度，还有效减少了副作用，使药物更为安全和有效。综上所述，本发明技术方案所制备的球晶，凭借其低熵值、高熔点、低溶解度及溶出速率、高生物利用度等诸多优点，成为一种理想的生物药物制剂形式，具有广阔的应用前景。

本发明有益之处在于：

本发明通过优化药物晶体的粉体学特性，可以有效提高所构建的分子胶囊中槲皮素的生物利用率，并且通过特异性的球径实现可控缓释，以更好地控制槲皮素的释放速率和释放量。

附图说明

图1为保湿乳液皮肤内的渗透情况；

图2为修护眼霜的皮肤内的渗透情况；

图3为精华的皮肤内的渗透情况；

图4为保湿乳液对照组4h后细胞对药物的摄取情况；

图5为保湿乳液实验组4h后细胞对药物的摄取情况；

图6为修护眼霜对照组4h后细胞对药物的摄取情况；

图7为修护眼霜实验组4h后细胞对药物的摄取情况；

图8为精华对照组4h后细胞对药物的摄取情况；

图9为精华实验组4h后细胞对药物的摄取情况。

具体实施方式

以下结合具体实施例和说明书附图对本发明作出进一步清楚详细的描述说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例所用原料均为市售或本领域技术人员可获得的原料；如无特殊说明，本发明实施例所用方法均为本领域技术人员所掌握的方法。

实施例1

一种多肽包覆槲皮素的分子胶囊的制备方法

(1)将L-组氨酸、槲皮素与蒸馏水按照0.9：1：3的质量比混合均匀，使用槲皮素质量的8wt％的2000U/g(干基)的中性蛋白酶，在温度为43℃、pH为6.8、超声频率170W的条件下酶解3h，进行超声酶解，制备前驱体；

(2)将前驱体与氨基酸B按照1：0.8的质量比混合均匀，在温度为45℃、pH为6.8的条件下反应3h，制备分子胶囊前驱体，过程中还需添加氨基酸B质量的4wt％的600U/mL的蛋白酶K，所述氨基酸B为β-丙氨酸(D型)和L-组氨酸混合物，其中L-组氨酸组分占比为28wt％、余量为β-丙氨酸(D型)；

(3)将分子胶囊前驱体加入结晶器中，在温度为30℃、转速为300rpm的条件下进行外层结构重晶化1h，过滤保留固相，在温度为24℃、压力为6MPa的条件下烘干4h，制备多肽包覆槲皮素分子胶囊。

对所制得的多肽包覆槲皮素分子胶囊进行如下性能检测，具体表征结果如下。

抗氧化活性检测：

超氧阴离子(O^2-)自由基清除率：0.1mol/L的HCl配置0.05mol/L pH为8.2的Tris-HCl溶液，取4.5mL Tris-HCl溶液加入4.2mL分子胶囊水溶液中，混合均匀后于25℃恒温水浴20min反应。25℃恒温水浴预加热3mmol/L邻苯三酚，在加热后的反应液中加入0.3mL邻苯三酚后立即测定其在300nm处吸光度，每隔30s测定一次吸光度，取4min内吸光度的斜率计算超氧阴离子自由基清除率，具体公示如下。

式中：

K₀——蒸馏水对照表；

K——样品。

还原力的检测：配置浓度0.2mol/L pH为6.6磷酸盐缓冲液，在1mL分子胶囊待测液中加入2.5mL磷酸盐缓冲液和2.5mL铁氰化钾(1％)，混合均匀后50℃恒温水浴20min使其发生反应，最后加入2.5mL三氯乙酸(10％)终止反应。5000rpm离心10min后取2.5mL上清液，与2.5mL蒸馏水、0.5mL FeCl₃混合后静置10min。300nm处测定吸光度，样品吸光度数值即为其还原力。

羟自由基(OH·)清除率的检测：按照如下表征配置检测样a、b、c。各取1mL检测样、6mmol/L硫酸亚铁与6mmol/L水杨酸-乙醇溶液，将其混合均匀，之后加入1mL饱和H₂O₂启动反应，37℃恒温水浴30min后再510nm处测定反应液的吸光度值，计算羟自由基(OH·)清除率，具体公示如下。

ACE抑制率的测定：0.3mol/L氯化钠配置0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液，并调整缓冲液pH 8.3。然后用缓冲液制备5mmol/L HHL溶液，待测各试剂添加量如下表征。反应结束后需加入0.4mL乙酸乙酯提取反应液中的马脲酸，震荡均匀后于4000rpm离心10min，取0.3mL上清液于干净离心管中，加热烘干离心管中液体，冷却至室温后加入0.6mL超纯水，提取出管壁附着的样品后，228nm处测定吸光度，并计算ACE抑制率，具体公示如下。

式中：

A_I——样品组；

A_II——对照组；

A_III——提前终止反应组。

	分子胶囊水溶液(mL)	饱和盐酸(mL)	HHL(mL)	ACE(mL)	蒸馏水(mL)
						I	5	0	15	0	0
II	0	0	15	0	5
						III	5	50	15	5	0

上述检测结果如下表所示。

除以上效用检测外，还对实施例所制备的多肽包覆槲皮素分子胶囊进行体外释放检测、透皮释放检测和体外皮肤渗透实验。

体外释放检测使用RYJ-12透皮扩散仪，检测分别设置对照组和检测组，每组设置三个平行检测，所述对照组为未经包覆的槲皮素与肌肽混合物(槲皮素和肌肽质量比为1：1.2)，检测组为本例所制得的肌肽包覆槲皮素分子胶囊，扩散池、接收池使用体积比为4：1的PBS-无水乙醇混合溶液，所述扩散池为使用丙二醇稀释对照组和检测组稀释至2mg/mL，本检测使用人工半透膜模拟体外释放平台，将人工半透膜放置于透皮仪中每间隔1h吸取接受池溶液1mL，然后补加相应体积的等渗溶液，各个时间取点完成后，将溶液置于紫外分光光度计中检测相应吸光度，对照槲皮素-肌肽标准曲线，计算体外释放率。

时间，h	0	4	8	12	16	20	24	28	32	36
											对照组，％	0	23	32	45	59	71	80	83	84	86
检测组，％	0	11	23	33	42	50	56	60	63	65

透皮释放检测实验条件为37℃、介质使用80％pH＝7.4等渗磷酸缓冲液与20％无水乙醇混合液、实验仪器采用RYJ-12透皮扩散仪，实验分别设置检测组和对照组，所述对照组为未经包覆的槲皮素与肌肽混合物(槲皮素和肌肽质量比为1：1.2)，检测组为本例所制得的肌肽包覆槲皮素分子胶囊，每组设置三个平行；所用皮肤脱毛后的6周龄Wistar大鼠腹部皮肤，大鼠呼吸麻醉后，去毛，处死，解剖，取皮去脂肪层，清水反复冲洗干净，分割成合适大小，置于生理盐水，4℃保存备用；扩散池所用药物用丙二醇稀释，浓度为2mg/mL，添加量1mL，接收池80％pH＝7.4等渗磷酸缓冲液与20％无水乙醇混合液，将皮肤置于二者之间，夹紧放置于透皮仪中；每隔相应的时间，吸取接收池溶液1mL，然后补加相应体积的介质溶液；各个时间取点完毕后，将溶液置于紫外分光光度计中检测吸光度，对照槲皮素标准曲线，计算浓度，计算透过率，绘制图表。

时间，h	0	4	8	12	16	20	24	28	32	36
											对照组，％	0	21	38	43	49	53	55	56	56	58
检测组，％	0	29	53	69	77	83	86	89	91	92

体外皮肤渗透实验使用三个月龄小香猪腹部新鲜皮肤，脱毛后用刮刀刮去脂肪层和部分真皮层，将皮肤裁剪成约3.14cm²圆形大小，角质层朝上固定于渗透装置上。实验荧光素采用FITC-HA，将槲皮素与荧光素交联后，利用本例包裹技术进行载药，用pH＝7.4PBS缓冲液分别将检测组和对照组药物稀释至50μg/mL(以FITC-HA计)，所述对照组为未经包覆的槲皮素与肌肽混合物(槲皮素和肌肽质量比为1：1.2)，检测组为本例所制得的肌肽包覆槲皮素分子胶囊，向渗透装置中各加入上述稀释液0.5mL，避光放置30min，结束后取下皮肤，用清水反复冲洗至表层荧光无脱色现象，用吸水纸沾干表面水分，避光放置10min略微晾干后，切片，置于荧光显微镜下观察荧光在皮肤内的渗透情况。

对照组渗透深度

239±56μm

检测组渗透深度(μm)

552±21μm

从上述体外表征结果可以明显看出，本发明分子胶囊在体外释放具有明显的缓释特点，并且在36h内能够保持相对稳定缓慢的释放，而对照组样本则会在约前24h内快速集中地释放，说明其释放可控性差，而本发明通过稳定缓释的特点能够使得本发明多肽包覆槲皮素的分子胶囊用于体外长效释放成分，以稳定地提供槲皮素。而另一方面，本发明分子胶囊具有极高的透皮释放率和极高的释放深度。这主要是基于多肽壳层，使得整体分子胶囊具有非常优秀的皮肤渗透能力，因而本发明分子胶囊在用于护肤品以及常见化妆品添加剂使用时，能够起到稳定释放且释放后快速渗透吸收的作用，从而使得槲皮素本身的抗炎等能力得到有效的发挥。

实施例2

一种多肽包覆槲皮素的分子胶囊的制备方法

(1)将L-组氨酸、槲皮素与蒸馏水按照1：1：4的质量比混合均匀，使用槲皮素质量的10wt％的2500U/g(干基)的中性蛋白酶，在温度为45℃、pH为7、超声频率150W的条件下酶解2.5h，进行超声酶解，制备前驱体；

(2)将前驱体与氨基酸B按照1：1的质量比混合均匀，在温度为47℃、pH为7的条件下反应2.5h，制备分子胶囊前驱体，过程中还需添加氨基酸B质量的5wt％的600U/mL的蛋白酶K，所述氨基酸B为β-丙氨酸(D型)和L-组氨酸混合物，其中L-组氨酸组分占比为30wt％、余量为β-丙氨酸(D型)；

(3)将分子胶囊前驱体加入结晶器中，在温度为33℃、转速为350rpm的条件下进行外层结构重晶化1.5h，过滤保留固相，在温度为25℃、压力为5MPa的条件下烘干4.5h，制备多肽包覆槲皮素分子胶囊。

对本例所制得的分子胶囊进行与实施例1相同的体外释放检测、透皮释放检测和体外皮肤渗透实验。

检测结果如下表所示。

实施例3

一种多肽包覆槲皮素的分子胶囊的制备方法

(1)将L-组氨酸、槲皮素与蒸馏水按照1.2：1：5的质量比混合均匀，使用槲皮素质量的12wt％的3000U/g(干基)的中性蛋白酶，在温度为47℃、pH为7.2、超声频率130W的条件下酶解2h，进行超声酶解，制备前驱体；

(2)将前驱体与氨基酸B按照1：1.2的质量比混合均匀，在温度为50℃、pH为7.2的条件下反应2h，制备分子胶囊前驱体，过程中还需添加氨基酸B质量的6wt％的600U/mL的蛋白酶K，所述氨基酸B为β-丙氨酸(D型)和L-组氨酸混合物，其中L-组氨酸组分占比为32wt％、余量为β-丙氨酸(D型)；

(3)将分子胶囊前驱体加入结晶器中，在温度为35℃、转速为400rpm的条件下进行外层结构重晶化1h，过滤保留固相，在温度为26℃、压力为4MPa的条件下烘干5h，制备多肽包覆槲皮素分子胶囊。

检测结果如下表所示。

对比例1

一种多肽包覆槲皮素的分子胶囊的制备方法，其具体制备方法同实施例2，仅对本发明多肽包覆方式进行改变，进行多肽包覆槲皮素的分子胶囊的制备，具体操作如下：

一种多肽包覆槲皮素的分子胶囊的制备方法

(1)将β-丙氨酸(D型)和L-组氨酸按照1∶1的质量比混合均匀，使用氨基酸混合物质量两倍的蒸馏水溶解氨基酸，添加氨基酸质量5wt％的2500U/g(干基)中性蛋白酶，在温度为45℃、pH为7、超声频率150W的条件下进行超声酶解2.5h，制备包覆前驱体；

(2)将包覆前驱体与槲皮素按4.5∶1的质量比混合均匀，在温度为45℃、pH为7、氮气气氛下反应2h，制备分子胶囊前驱体；

检测结果如下表所示。

从上表可以明显看出，本发明实际是直接以肌肽对槲皮素进行包裹，包裹后与实施例2所制得的分子胶囊相比，可以看出其体外释放率产生了明显的下降，并且产生了释放波动，并不能有效平稳地进行体外释放。而透皮释放率和体外皮肤渗透深度也产生了非常显著的下降，使得其实际的使用效果产生了明显的下降，槲皮素的实际使用吸收率降低。

对比例2

一种多肽包覆槲皮素的分子胶囊的制备方法，其具体制备方法同实施例2，仅对本发明多肽包覆顺序进行改变，进行多肽包覆槲皮素的分子胶囊的制备，具体操作如下：

一种多肽包覆槲皮素的分子胶囊的制备方法

(1)β-丙氨酸(D型)、L-组氨酸、槲皮素和蒸馏水按照1：1.5：0.6：4的质量比混合均匀，在温度为45℃、pH为7、氮气气氛下、超声频率150W的条件下反应4h，过程中添加氨基酸质量5wt％的600U/mL的蛋白酶K、氨基酸质量5wt％的2500U/g(干基)的中性蛋白酶，制备分子胶囊前驱体；

(2)将分子胶囊前驱体加入结晶器中，在温度为33℃、转速为350rpm的条件下进行外层结构重晶化1.5h，过滤保留固相，在温度为25℃、压力为5MPa的条件下烘干4.5h，制备多肽包覆槲皮素分子胶囊。

检测结果如下表所示。

从上表可以明显看出，在构建肌肽的同时实现对槲皮素的包覆，其实际效果与对比例1效果十分接近，与实施例2所制得的分子胶囊相比，可以看出其体外释放率产生了下降和波动，并不能有效平稳地进行体外释放，且同样的透皮释放率和体外皮肤渗透深度也产生了非常显著的下降，使得其实际的使用效果产生了明显的下降，槲皮素的实际使用吸收率降低。

对比例3

某市售环糊精包合槲皮素纳米粒与实施例1相同的体外释放检测、透皮释放检测和体外皮肤渗透实验。

检测结果如下表所示。

从上表可以明显看出，通过环糊精包合槲皮素的纳米胶囊的体外释放具有4～12h间超高效释放的特点，但是其在早期的释放率和晚期的释放率过程都十分平缓，实际并不具备长效平稳缓释的特点，可见该纳米胶囊的包合效果较差。而另一方面，从透皮释放率来看，其释放率始终保持较低，甚至低于本发明对照组的释放率，说明环糊精并不具备有效促进槲皮素透皮吸收的能力，同样的体外皮肤渗透试验结果也表明，其渗透深度远远低于本发明技术方案所构建的分子胶囊，这也与包覆物肌肽和环糊精的差异性存在关联。

应用实施例

将实施例2所制备的多肽包覆槲皮素分子胶囊用来制备保湿乳液、修护眼霜和精华三种产品，具体制备方式如下。

保湿乳液的制备：

(1)在80～85℃，将A相混合、搅拌均匀；

(2)将B相在80-85℃加热混合溶解，然后将B相加入A相，搅拌、均质5～10min；

(3)将C相加入A-B相，搅拌混合均匀，均质5min，低速搅拌降温至40～50℃，加入D相成分，搅拌混合均匀，制成保湿乳液。

修护眼霜的制备：

(1)在80～85℃，将A相混合、搅拌均匀；

(3)将C相加入A-B相，搅拌混合均匀，均质5min，低速搅拌降温至40～50℃，加入D相成分，搅拌混合均匀，制成修护眼霜。

精华的制备：

(1)75～85℃混合A相原料，搅拌、混合均匀至形成均一的溶液；

(2)降温至40～50℃，加入B相成分，混合均匀；

(3)低速搅拌，逐个加入C相成分，搅拌混合均匀，制成精华。

体外皮肤渗透检测：使用三月龄香猪腹部皮肤，脱毛后去除脂肪层和部分真皮层，将皮肤裁剪成直径400mm的圆形，角质层朝上固定于渗透装置上。实验荧光素采用FITC-HA，将槲皮素与荧光素交联后，利用本例包裹技术进行载药，随后加入至上述产品中，用pH＝7.4PBS缓冲液将产品至50μg/mL(以FITC-HA计)，，向渗透装置中各加入上述稀释液0.5mL，避光放置30min，结束后取下皮肤，用清水反复冲洗至表层荧光无脱色现象，用吸水纸沾干表面水分，避光放置10min略微晾干后，切片，置于荧光显微镜下观察荧光在皮肤内的渗透情况。表征结果如图1～3所示。

由图(1～3)可见，将包裹后的槲皮素对皮肤渗透能力较强，荧光条带越宽，代表药物渗透越深；对比三种化妆品对皮肤表层和真皮层的渗透能力、不同皮肤层细胞对槲皮素的摄取能力，通过荧光显微镜观察到包裹后的槲皮素能够透过表皮层，达到真皮层结缔组织处，使得真皮层细胞能够充分接触槲皮素，因此可以看出本发明技术方法对槲皮素的包覆处理能够有效地提高槲皮素在皮肤内的渗透作用。

在上述基础上，进一步进行药物细胞摄取检测：检测选用小鼠成纤维细胞(NCTCclone 929)为目标细胞，选用异硫氰酸荧光素(异构体I)为入胞荧光，选用细胞核染料DAPI进行染核。将槲皮素与荧光素交联后，采用上述实施例的方法对槲皮素进行包覆，制备带荧光效果的分子胶囊，再利用磷酸盐缓冲盐溶液溶解荧光-包裹双处理后的药物处理细胞，经固定、通透、染核后，滴加抗荧光封片剂，利用荧光显微镜拍摄4h后细胞对药物的摄取情况，并与对照组进行对比，对照组中将多肽包覆槲皮素分子胶囊替换为等量的槲皮素和L-肌肽组合物。表征结果如图4～9所示。观察图4～9，图中蓝色荧光为细胞核，绿色荧光为药物的摄取情况，绿色荧光强度越高表明摄取情况越优，此处由于图中难以显色，因而依靠光斑大小可以大致预估判断，当药物被摄取后，光斑增大，胞内积累的药物便越多，即细胞对此药物的摄取能力越好。由图中可以看出，相较于对比组而言，细胞对于本发明多肽包覆槲皮素分子胶囊的摄取率要远高于对于槲皮素原液的摄取率，因而可以看出，多肽包覆对于槲皮素的入胞能力提升非常的显著。

Claims

1.一种多肽包覆槲皮素的分子胶囊的制备方法，其特征在于，

所述方法包括：

(2)将前驱体与氨基酸B按照比例混合，制备分子胶囊前驱体；

(3)将分子胶囊前驱体加入结晶器中，进行外层结构重晶化，过滤高压烘干，制备多肽包覆槲皮素分子胶囊；

步骤(1)所述氨基酸A为L-组氨酸；

步骤(1)所述氨基酸A、槲皮素和水以质量比(0.9～1.2)：1：(3～5)的比例混合；

所述中性蛋白酶的用量为槲皮素的8～12wt％；

步骤(2)所述氨基酸B为D型β-丙氨酸和L-组氨酸混合物；

所述氨基酸B中L-组氨酸的含量为28～32wt％，余量为D型β-丙氨酸；

步骤(2)所述制备分子胶囊前驱体的过程中，控制反应温度为45～50℃，并调节反应体系pH值至6.8～7.2，反应过程中加入活力为600U/mL的蛋白酶K液体，蛋白酶K液体的添加量为氨基酸B的4～6wt％；

2.根据权利要求1所述的一种多肽包覆槲皮素的分子胶囊的制备方法，其特征在于，

所述高压烘干于24～26℃、4～6MPa条件下进行4～5h。

3.一种由权利要求1至2任一方法所制得的多肽包覆槲皮素的分子胶囊。