CN117660630A

CN117660630A - 成肌细胞分化指标在累及肌肉系统遗传性疾病药物筛选中的应用

Info

Publication number: CN117660630A
Application number: CN202311705894.XA
Authority: CN
Inventors: 蒋海山; 张钊涌; 胡亚芳; 李伟
Original assignee: Southern Hospital Southern Medical University
Current assignee: Southern Hospital Southern Medical University
Priority date: 2023-12-13
Filing date: 2023-12-13
Publication date: 2024-03-08

Abstract

本发明涉及成肌细胞分化指标在对累及肌肉系统遗传性疾病药物筛选中的应用。属于医药领域。所述药物筛选方法包括以下步骤：获取人源原代成肌细胞并利用逆转录病毒过表达CDK4及TERT的方式诱导成肌细胞永生化；验证永生化成肌细胞的增殖和分化能力；药物筛选：将上述永生化成肌细胞接种于培养基中，将待测物质加入到成肌细胞的分化培养基中诱导分化；通过检测成肌细胞分化特征性蛋白表达量变化来判断待测物质对细胞分化的促进作用，从而代表待测物质的疗效。本发明所提供的方法操作简单，具有广泛的适用性。

Description

成肌细胞分化指标在累及肌肉系统遗传性疾病药物筛选中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，涉及一种利用成肌细胞分化指标进行药物筛选的方法，用于筛选出对累及肌肉系统遗传性疾病有治疗作用的药物。

背景技术

近年来，基因组学、转录组学和蛋白组学技术的进步使越来越多与肌肉相关的致病基因被我们所发现，这让我们对累及肌肉系统的遗传性疾病的认识得到了极大的发展。然而目前这类疾病缺少逆转甚至治愈疾病的疗法，大多数只有对症治疗方案可供选择，这只能延缓疾病的进展。因此，有许多研究都致力于开发针对此类疾病的特异性药物，如杜氏肌营养不良症和线粒体脑肌病等。但同时，由于患者之间个体差异的存在，同一药物或药物组合所表现出来的疗效存在极大的差异。故个体化治疗方案的制定显得尤为重要。

肌肉活检是累及肌肉系统的遗传性疾病确诊不可或缺的一个辅助项目。活检手术中，需要对所得肌肉组织块边缘进行修整，该过程产生的组织碎块既往被视为医疗废物，其中含有维持骨骼肌再生能力的一群小型的成体干细胞即成肌细胞，该细胞直接来源于患者，可为患者天然存在的基因缺陷提供临床上最为相关的样本。

虽然国际上已有研究用永生化的人类成肌细胞制作模型并进行药物治疗实验，但目前均停留于实验室，缺少真实的患者疗效验证，且其检测指标均局限于一种疾病，缺乏普适性，这使得药物筛选模型只限于一种疾病，无法在累及肌肉系统遗传性疾病这一类疾病中进一步推广。

综上，现在还没有一种具有普适性的药物筛选方法，用于筛选出对累及肌肉系统遗传性疾病有治疗作用的物质。

发明内容

鉴于上述现有方法的不足，本发明的目的在于提供一种药物筛选方法，选取具有普适性的检测指标，作为观察药物疗效的窗口，旨在解决现有技术中没有通用的检测指标以及具有普适性的干预方法，筛选出对累及肌肉系统遗传性疾病有治疗作用的药物的问题。

本发明采用的具体方案为：

第一方面，本发明请求保护一种利用成肌细胞分化指标进行药物筛选的方法，所述方法是将待测物质加入到成肌细胞分化培养基中，检测成肌细胞分化特征性蛋白表达量变化，其恢复水平即代表待测物质的疗效，从而筛选对累及肌肉系统遗传性疾病有治疗作用的物质。

作为对上述方法的进一步优化，上述方法，包括以下步骤：

A、获取人源原代成肌细胞并利用逆转录病毒过表达CDK4及TERT的方式诱导成肌细胞永生化；

B、验证永生化成肌细胞的增殖和分化能力；

C、药物筛选：将永生化成肌细胞接种于培养基中，将待测物质加入到成肌细胞的分化培养基中诱导分化；通过检测成肌细胞分化特征性蛋白表达量变化来判断待测物质对细胞分化的促进作用，从而代表待测物质的疗效。

作为对上述方法的进一步优化，步骤A中，在诱导成肌细胞永生化后，利用差速贴壁的方法纯化永生化成肌细胞。更进一步地，纯化后，对永生化成肌细胞进行细胞检验，所述细胞检验包括：利用流式细胞术检测所得细胞的CD56阳性率，对所得永生化成肌细胞细胞的纯度进行检验；对细胞的DNA提取物进行特定片段的PCR扩增，同时对产物进行测序，验证所得细胞的基因型是否与原代一致。

作为对上述方法的进一步优化，步骤C的具体过程为：设计成肌细胞分化特征性蛋白的特异性引物，包括：MYH2、MYH3、MYH7、MyoD、Pax7；将永生化的成肌细胞按1×10⁴cells/cm²的密度接种于培养皿中，待汇合度达到80%时，换液含浓度梯度待测物质的成肌细胞分化培养基诱导分化，且在分化阶段隔天半换液；诱导分化第四天时，提取细胞总RNA进行实时荧光定量PCR检测待测药物对成肌细胞分化特征性蛋白表达量的影响。

更进一步地，针对MYH2靶点的特异性引物如SEQ ID NO：1~2所示；针对MYH3靶点的特异性引物如SEQ ID NO：3~4所示；针对MYH7靶点的特异性引物如SEQ ID NO：5~6所示；针对MyoD靶点的特异性引物如SEQ ID NO：7~8所示；针对Pax7靶点的特异性引物如SEQ IDNO：9~10所示。

第二方面，本发明请求保护上述方法在累及肌肉系统遗传性疾病药物筛选中的应用。

有益效果：本发明中提供了一种适用于累及肌肉系统遗传性疾病的具有普适性的药物筛选方法，利用成肌细胞分化特征性蛋白的表达量检测待测物质的疗效。此方法操作简单，而且本发明还具有广泛的适用性。本发明中利用病理机制明确，且药物临床疗效显著的患者标本作为切入点，发现了成肌细胞分化特征性蛋白表达量变化与患者个体层面的症状改善相对应，可用于观察待测物质的疗效。因此，可将所述蛋白表达量变化指标用于建立一种具有普适性的药物筛选方法，用于筛选出对累及肌肉系统遗传性疾病有治疗作用的物质。

附图说明

图1为永生化成肌细胞构建的过程。其中A为患者肌肉组织碎块标本置于含有肌肉转移液的离心管中暂存；B为无菌手术刀片将肌肉组织标本切成细碎小块后的状态；C为肌肉组织用肌肉消化液消化1小时后的状态；D为原代成肌细胞扩增培养的显微镜下状态；E为永生化成肌细胞扩增培养的显微镜下状态。

图2为永生化成肌细胞纯度验证，即CD56阳性细胞占比的流式细胞术结果图。A、B、C、D分别对应标本编号为16M、14M、13M、8M的细胞中CD56阳性细胞占比，分别为99.0%、99.8%、98.6%、98.4%，均提示所得成肌细胞纯度较高。其中13M、14M分别为诊断为炎症性肌病、血管炎性周围神经病的患者来源永生化成肌细胞，8M为COX20基因变异线粒体病，16M为系统性原发性肉碱缺乏症。

图3 为细胞DNA提取物进行PCR后产物的测序结果。A、B、C分别为标本编号13M、14M、16M的产物测序结果，其中13M、14M分别为诊断为炎症性肌病、血管炎性周围神经病的患者来源永生化成肌细胞，为免疫系统相关疾病患者来源的细胞，离体培养状态下，可视为正常无疾病表现的永生化成肌细胞；16M为系统性原发性肉碱缺乏症，基因测序提示存在SLC22A5 c.1400C>G（p.S467C）突变位点患者来源永生化成肌细胞。结果提示永生化成肌细胞与原代成肌细胞的基因型一致，符合患者原本的基因突变。

图4为永生化成肌细胞的CCK-8标准曲线。图中橙色、灰色、蓝色线条为分别为标本编号13M、14M、16M的CCK-8标准曲线以及对应的OD值-细胞数量转换公式。

图5为永生化成肌细胞增殖性检验中的CCK-8增殖曲线。A中蓝色、橙色、灰色线条为分别为标本编号13M、14M、16M的CCK-8试剂盒连续三天检测所得OD值变化曲线。B中橙色、蓝色、灰色线条为分别为标本编号13M、14M、16M的根据OD值变化以及各自标准曲线转换所得连续三天细胞数量变化曲线，均提示所得细胞具有较强的增殖性。

图6为永生化成肌细胞分化性检验中诱导分化后显微镜下表现。A、B、C、D分别为标本编号8M、13M、14M、16M的永生化成肌细胞诱导分化后显微镜下观察情况，均可以观察到多个细胞核的巨大长条形细胞即肌纤维。

图7为永生化成肌细胞分化性检验中诱导分化后的细胞免疫荧光结果。A、B、C、D分别为标本编号8M、13M、14M、16M的永生化成肌细胞诱导分化后细胞免疫荧光表现，其中绿色为MYH3标记、红色为Pax7标记、蓝色为细胞核DAPI，四个细胞均可以观察到MYH3阳性、Pax7阴性的多个细胞核的巨大长条形细胞即肌纤维，同时提示细胞表达成肌细胞分化特征性蛋白。

图8为永生化成肌细胞诱导分化后的分化标志物表达情况。A中3个泳道均为标本编号8M的永生化成肌细胞诱导分化后的MYH3蛋白质水平Western blot检测结果。B、C分别为标本编号8M、13M、14M、16M的永生化成肌细胞诱导分化后MYH3、Pax7转录水平qRT-PCR检测结果。均提示细胞表达成肌细胞分化特征性蛋白，且可视为正常对照的14M的MYH3及Pax7表达水平高于疾病组16M（P<0.05），疾病组细胞的成肌细胞分化特征性蛋白表达量与正常对照组存在差异。

图9为永生化成肌细胞诱导分化后的分化标志物表达情况及显微镜下表现。A、B、C、D分别为标本编号14M、16M的永生化成肌细胞诱导分化后MYH2、MYH7、MyoD及Pax7转录水平qRT-PCR检测结果，提示分化第4天时，16M的MYH7的表达量低于14M（P<0.05），分化第2天时，Pax7在16M中的表达量低于14M（P<0.05）。E、F分别为标本编号14M、16M的永生化成肌细胞诱导分化第0、2、4天时的显微镜下表现。这进一步提示疾病组细胞的成肌细胞分化能力以及分化特征性蛋白表达量与正常对照组存在差异。

图10为永生化成肌细胞药物干预后的分化标志物表达情况及显微镜下表现。A、B分别为标本编号14M、16M的永生化成肌细胞在梯度浓度左旋肉碱的干预下，诱导分化后MYH2、MYH7、MyoD及Pax7转录水平qRT-PCR检测结果，提示16M在肉碱浓度20μM干预情况下，MyoD表达水平相较于0μM时提高（P<0.05），而14M无明显改变。C、D分别为标本编号14M、16M的永生化成肌细胞在含有梯度浓度左旋肉碱的成肌细胞分化培养基诱导分化第4天时的显微镜下表现。这提示成肌细胞分化特征性蛋白表达量可用于累及肌肉系统遗传性疾病的药物筛选。

实施方式

本发明提供一种药物筛选方法、用于筛选出对累及肌肉系统遗传性疾病有治疗作用的药物，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明所提供药物筛选方法，主要通过检测成肌细胞分化特征性蛋白的表达量来代表药物的疗效。采用本发明所提供的药物筛选方法，发现成肌细胞分化特征性蛋白表达量变化与患者个体层面的症状改善相对应。

具体地，所述药物筛选方法中，包括以下步骤：

A、原代成肌细胞的分离培养及永生化的诱导：

①获取患者来源的原代成肌细胞：获取患者的知情同意后，取其肌肉活检手术中对标本边缘进行修整所产生的组织碎块标本，按照无菌操作标准，采取机械切割结合胶原酶及中性蛋白酶酶解的方式获取单细胞悬液，培养扩增获得原代成肌细胞；

②诱导原代成肌细胞永生化：获得原代成肌细胞后，利用逆转录病毒感染细胞，使之过表达CDK4及TERT，从而获得永生化成肌细胞；

③纯化永生化成肌细胞：接着利用差速贴壁的方法纯化永生化成肌细胞，选取贴壁次数靠后且状态良好的细胞扩增培养，即可得纯度较高的永生化成肌细胞；

④细胞检验：必要时，可利用流式细胞术检测所得细胞的CD56阳性率，对所得永生化成肌细胞细胞的纯度进行检验。同时，可对细胞的DNA提取物进行特定片段的PCR扩增，同时对产物进行测序，验证所得细胞的基因型是否与原代一致；

B、验证永生化成肌细胞的干性，包括增殖能力和分化能力：

①绘制CCK-8标准曲线：获得永生化成肌细胞后，将细胞按数量梯度接种于96孔板中，孵育3.5小时后，换液含有10% CCK-8的永生化成肌细胞培养基，继续孵育90分钟，检测各待测孔在450nm处的吸光度，从而获得永生化成肌细胞的CCK-8标准曲线；

②绘制CCK-8增殖曲线：将永生化成肌细胞以5×10³cells/孔的细胞量接种于96孔细胞培养板中，分别于接种完细胞后的24小时、48小时、72小时换液含有10% CCK-8的永生化成肌细胞培养基，孵育90分钟后，测定各待测孔在450nm处的吸光度，从而获得永生化成肌细胞的CCK-8增殖曲线，检验所得细胞的增殖能力；

③诱导分化：将永生化成肌细胞按1×10⁴cells/cm²的密度接种于培养板中，待其汇合度达到80%时，换液低有丝分裂原的成肌细胞分化培养基诱导分化，且在分化阶段隔天半换液；

④设计引物：利用pubmed数据库以及primer bank数据库获取成肌细胞分化特征性蛋白的qRT-PCR引物，包括但不限于MYH2、MYH3、MYH7、MyoD、Pax7。接着利用pubmed数据库的primer blast功能对引物的特异性进行验证；

⑤验证分化能力：利用显微镜观察及qRT-PCR的手段检测永生化成肌细胞诱导分化第4天时，成肌细胞分化特征性蛋白的表达量变化。必要时可通过细胞免疫荧光及蛋白质印迹的方式进一步验证。

C、利用成肌细胞分化特征性蛋白的表达量进行药物筛选：参照不同药物的血药浓度配制含有梯度浓度药物的成肌细胞分化培养基。接着将永生化成肌细胞按1×10⁴cells/cm²的密度接种于培养板中，待其汇合度达到80%时，换液含浓度梯度肉碱的成肌细胞分化培养基诱导分化，且在分化阶段隔天半换液。诱导分化第4天时，收取细胞样本提取RNA行qRT-PCR检测成肌细胞分化特征性蛋白表达量的变化，其恢复水平即代表了待测药物的疗效。

下面通过实例对本发明的进一步解释和说明。

实例1：所得永生化成肌细胞纯度较高且携带原代成肌细胞的基因型。

我们收集分别诊断为COX20基因变异线粒体病、炎症性肌病、血管炎性周围神经病、系统性原发性肉碱缺乏症患者肌肉活检过程中产生的组织碎块，分别编码为8M、13M、14M、16M。利用机械切割结合酶解的方式获得原代单细胞悬液，培养扩增后获得原代成肌细胞，利用逆转录病毒过表达CDK4及TERT的方式诱导成肌细胞永生化，接着利用差速贴壁的方式纯化永生化成肌细胞。获得成肌细胞后，利用流式细胞术验证成肌细胞纯度分别为98.4%、98.6%、99.8%、99.0%，所得永生化成肌细胞纯度较高，接着利用PCR扩增后产物测序检测细胞的基因型，最终16M携带与患者相符的SLC22A5c.1400C>G（p.S467C）突变位点，表明所得永生化成肌细胞携带原代成肌细胞的基因型。

实例2：永生化成肌细胞具有较强的增殖能力和分化能力。

我们利用CCK-8试剂盒绘制所得编码为13M、14M、16M永生化成肌细胞的标准曲线以及增殖曲线，表明永生化成肌细胞的增殖能力较强。接着，我们利用有丝分裂原的成肌细胞分化培养基诱导分化，并通过显微镜观察、qRT-PCR、细胞免疫荧光、蛋白质印迹的手段检测永生化成肌细胞的分化，结果表明永生化成肌细胞可以分化为MYH3阳性、Pax7阴性的多个细胞核的巨大长条形细胞即肌纤维，且细胞表达成肌细胞分化特征性蛋白，包括MYH3、Pax7。

实例3：疾病细胞与正常细胞的分化能力存在差异。

为了进一步验证疾病细胞与正常细胞是否存在分化能力的差异，我们选择编号14M和16M的细胞行下一步验证，其中14M来自诊断为血管炎性周围神经病的患者，为免疫系统相关疾病患者来源的细胞，离体培养状态下，可视为正常无疾病表现的细胞；而16M来自诊断为系统性原发性肉碱缺乏症的患者，基因测序提示存在SLC22A5c.1400C>G（p.S467C）突变位点，离体培养状态下，可视为疾病组细胞。我们分别在诱导分化的第0天、第2天、第4天通过qRT-PCR的手段检测成肌细胞分化特征性蛋白的表达量变化，同时显微镜观察细胞状态的变化。结果表明，疾病细胞与正常细胞相比，第4天时成肌细胞分化特征性蛋白的表达量较低，包括MYH2、MYH7、MyoD、Pax7；同时显微镜下观察结果可见疾病细胞与正常细胞相比，第4天时肌纤维占比较少。

实例4：药物干预后永生化成肌细胞分化特征性蛋白的表达水平存在明显变化。

为了进一步验证成肌细胞分化特征性蛋白的表达量变化能否用于药物筛选，我们选择上述编码14M和16M的细胞进行下一步验证。其中，14M可视为正常细胞，16M来自诊断为系统性原发性肉碱缺乏症的患者，其致病机制较为明确，左旋肉碱明确可以用于治疗该疾病。我们根据肉碱在血清里面的浓度，配置0-80μM梯度浓度的左旋肉碱分化培养基，并分别诱导14M及16M的分化，诱导第4天时观察显微镜下表现并检测各自的成肌细胞分化特征性蛋白表达水平。结果表明，随着左旋肉碱浓度的上升，14M在显微镜下所见多核肌纤维的占比以及细胞的粗细、长度无显著变化，而16M在显微镜下所见多核肌纤维的占比以及细胞的粗细、长度有增加趋势。同时，药物干预后成肌细胞分化特征性蛋白的表达水平存在变化，16M的永生化成肌细胞在左旋肉碱浓度为20μM时，分化特征性蛋白MyoD表达量相较于0μM时增加，而14M的永生化成肌细胞在左旋肉碱浓度为20μM时分化特征性蛋白MyoD表达量相较于0μM时无明显变化，而标本编号16M所来源的患者在根据指南及文献调研后给予左旋肉碱治疗，症状得以改善。

本实施例的结果可以看出，药物干预后成肌细胞分化特征性蛋白的表达量增加与患者治疗后的症状改善相符，由此可看出人源成肌细胞分化特征性蛋白表达量可用于累及肌肉系统遗传性疾病的药物筛选。

上述实施例中，PCR所用引物和qRT-PCR所用引物分别如表1和表2所示。

表1 PCR所用引物

引物名称	序列
		Forward引物	TTGGGAGCCTCTGATGGTCA
Reverse引物	ACTGGGACAAGAACCCTTCC

表2 qRT-PCR所用引物

靶点	引物序列	序列号
			MYH2	Forward引物：CTGAGGGAGGAGCGACTCTReverse引物：CTCGGGCTTATACACAGGCA	SEQ ID NO：1SEQ ID NO：2
MYH3	Forward引物：ATTGCTTCGTGGTGGACTCAAReverse引物：GGCCATGTCTTCGATCCTGTC	SEQ ID NO：3SEQ ID NO：4
			MYH7	Forward引物：CTTTGCTGTTATTGCAGCCATTReverse引物：AGATGCCAACTTTCCTGTTGC	SEQ ID NO：5SEQ ID NO：6
MyoD	Forward引物：CGCCATCCGCTATATCGAGGReverse引物：CTGTAGTCCATCATGCCGTCG	SEQ ID NO：7SEQ ID NO：8
			Pax7	Forward引物：TCCAAGATTCTTTGCCGCTACReverse引物：GGTCACAGTGCCCATCCTTC	SEQ ID NO：9SEQ ID NO：10
β-tubulin（TUBB）	Forward引物：TGGACTCTGTTCGCTCAGGTReverse引物：TGCCTCCTTCCGTACCACAT	SEQ ID NO：11SEQ ID NO：12

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种利用成肌细胞分化指标进行药物筛选的方法，其特征在于：所述方法是将待测物质加入到成肌细胞分化培养基中，检测成肌细胞分化特征性蛋白表达量变化，其恢复水平即代表待测物质的疗效，从而筛选对累及肌肉系统遗传性疾病有治疗作用的物质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

B、验证永生化成肌细胞的增殖和分化能力；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤A中，在诱导成肌细胞永生化后，利用差速贴壁的方法纯化永生化成肌细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：纯化后，对永生化成肌细胞进行细胞检验，所述细胞检验包括：利用流式细胞术检测所得细胞的CD56阳性率，对所得永生化成肌细胞细胞的纯度进行检验；对细胞的DNA提取物进行特定片段的PCR扩增，同时对产物进行测序，验证所得细胞的基因型是否与原代一致。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤C的具体过程为：设计成肌细胞分化特征性蛋白的特异性引物，包括：MYH2、MYH3、MYH7、MyoD、Pax7；将永生化的成肌细胞按1×10⁴cells/cm²的密度接种于培养皿中，待汇合度达到80%时，换液含浓度梯度待测物质的成肌细胞分化培养基诱导分化，且在分化阶段隔天半换液；诱导分化第四天时，提取细胞总RNA进行实时荧光定量PCR检测待测药物对成肌细胞分化特征性蛋白表达量的影响。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：针对MYH2靶点的特异性引物如SEQ ID NO：1~2所示；针对MYH3靶点的特异性引物如SEQ ID NO：3~4所示；针对MYH7靶点的特异性引物如SEQ ID NO：5~6所示；针对MyoD靶点的特异性引物如SEQ ID NO：7~8所示；针对Pax7靶点的特异性引物如SEQ ID NO：9~10所示。

7.根据权利要求1-6任意一种所述的方法在累及肌肉系统遗传性疾病药物筛选中的应用。