CN117660458A

CN117660458A - 靶向PBP2a的非天然核酸适配体获取方法

Info

Publication number: CN117660458A
Application number: CN202311233476.5A
Authority: CN
Inventors: 陈庭坚; 刘巧玲; 彭乐丽; 张瑞敏; 杜宇辉
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2023-09-22
Filing date: 2023-09-22
Publication date: 2024-03-08

Abstract

本发明公开靶向PBP2a的非天然核酸适配体获取方法。该方法为筛选靶向PBP2a非天然核酸适配体的过程中，第二轮以后的转录文库制备方法主要采用5’‑磷酸化扩增引物对筛选到的XNA序列反转录产物做PCR扩增，该引物与模板3’‑端互补40nt，包含与转录产物5’‑端互补的20nt以及转录引物部分。PCR扩增产物用Lambda核酸外切酶降解，通过控制降解时间，能最大效率降解掉磷酸化的序列以获取单链DNA文库，然后再使用SFM4‑6聚合酶转录获取下一轮的XNA文库。在筛选靶向PBP2a非天然核酸适配体的过程中，大多数未结合的XNA文库被除去，随着筛选轮数的增加，与靶标蛋白有结合活性的XNA逐渐富集。

Description

靶向PBP2a的非天然核酸适配体获取方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为利用定向进化后的SFM4-6聚合酶在SELEX每一轮筛选当中转录DNA文库得到2’-全修饰的非天然核酸适配体文库并用该文库筛选靶向PBP2a的2’-全修饰非天然核酸适配体，最终得到一条69nt的靶向PBP2a的2’-全修饰非天然核酸适配体。

背景技术

抗生素是现代医学的基础，以青霉素、头孢类药物为代表的β-内酰胺类抗生素是目前临床抗感染最普遍应用且有效治疗的一类抗生素。抗生素的使用给世界范围内的传染病治疗带来了革命性的变化。研究发现，虽然用于治疗感染的大部分抗生素和人类病原体获得的抗生素耐药性基因都有环境来源，但是大部分归因于这类药物的滥用误用，使病原菌对抗菌药物的耐药性问题日趋严重。

青霉素结合蛋白(PBPs)是细菌细胞壁合成过程中所必需的转肽酶。PBPs是抗生素治疗的有效靶位，各种β-内酰胺类抗生素通过与PBPs结合，抑制它的转肽酶活性，从而阻止正常的转肽反应，使细胞壁不能合成，从而最终导致细菌死亡。

而耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)通过mecA编码产生的特殊蛋白-青霉素结合蛋白2a(PBP2a)对β-内酰胺类抗生素的亲和力低，导致多种抗菌药物不能与之结合，当高亲和力的PBPs被抑制时，PBP2a可以继续执行转肽酶功能，完成细胞壁功能，维持细菌的生长，所以PBP2a对所有的β-内酰胺类抗生素均产生抗药性。由于科学家对PBP2a的分子生物学特性的探索，通过快速准确筛查出PBP2a，将极大的推进MRSA这一难题的攻克。

目前已有报道的PBP2a的核酸适配体，但都是天然核酸适配体，其生物稳定性差，易被核酸酶降解，有一定的局限性，而非天然核酸适配体生物稳定性更好，能很好的改善这个问题，同时为核酸药物的开发提供一个新的选择。

寡核苷酸适配体是具有靶向选择性高亲和特性的单链DNA或RNA，被认为是取代单克隆抗体的核酸基亲和配体。与抗体相比，适配体具有较小的复杂性和免疫原性，适配体除了对多种靶标(蛋白质、细胞或小分子)具有较高的亲和力和特异性外，它们有更大的灵活性，因此，可以附着在内部不可接近的表位上，抗体不容易锁定这些表位。利用适配体与靶标蛋白具有较高的亲和力和特异性的特性可以建立快速检测PBP2a的方法。同时，适配体与靶标蛋白的特异性结合可能会抑制其活性，从而达到杀菌、抑菌的目的。

非天然核酸(XNAs)是通过对核酸分子上的碱基或骨架修饰而获得，它是天然DNA和RNA的合成替代物。与天然的DNA或RNA适配体相比，XNA适配体具有更强的稳定性以及耐核酸酶降解能力，这使得XNA核酸适配体替代天然的DNA或RNA适配体成为可能。

由于聚合酶对底物的特异性，天然的聚合酶无法高效的识别和合成非天然核酸，但是随着科学家对来自不同家族的DNA和RNA聚合酶进化定向进化，使聚合酶识别非天然核苷酸底物变得可能，实验室酶法合成非天然核酸序列变得更加容易。在不改变适配体结合活性的情况下，如何获取2’-全修饰的非天然核酸适配体，并提高其对各种核酸酶的稳定性是一个急需解决的问题。本专利通过使用定向进化的Taq DNA聚合酶Stoffel片段(Stoffelfragment(SF)突变株——SFM4-6转录出糖环2’-C，F-C、U，OMe-A、G的XNA文库，利用SELEX技术对制备得到的文库与固定好的靶标蛋白PBP2a进行孵育结合，通过多轮的洗涤，将未结合的XNA序列除掉，最后用变性条件洗脱得到结合靶标蛋白的XNA，然后再通过反转录，PCR扩增，转录构建下一轮用于筛选的文库，经过多轮筛选，最终得到靶向PBP2a的XNA适配体。最后通过EMSA测试XNA适配体对的PBP2a的结合活性，证明筛选到的XNA适配体具有较高的结合PBP2a的活性，为未来用于MRSA检测和诊断提供一种思路。

发明内容

本发明包括2’-全修饰非天然核酸适配体文库制备方法，其具体操作是采用2’-F修饰的尿嘧啶核苷酸，2’-F修饰的胞嘧啶核苷酸，2’-OMe修饰的腺嘌呤核苷酸以及2’-OMe修饰的鸟嘌呤核苷酸的非天然核苷酸为元件，在SFM4-6聚合酶的作用下，以(N₂₀)-Lib文库为模板，直接转录合成DNA/XNA杂合体产物，经DNase I酶降解后，制备得到2’-全修饰的XNA文库。

本发明包括筛选靶向PBP2a全修饰非天然核酸适配体的技术。筛选靶向PBP2a非天然核酸适配体的过程中，第二轮以后的转录文库制备方法主要采用5’-磷酸化扩增引物对筛选到的XNA序列反转录产物做PCR扩增，该引物与模板3’-端互补40nt，包含与转录产物5’-端互补的20nt以及转录引物部分。PCR扩增产物用Lambda核酸外切酶降解，通过控制降解时间，能最大效率降解掉磷酸化的序列以获取单链DNA文库，然后再使用SFM4-6聚合酶转录获取下一轮的XNA文库(如图1所示为筛选流程)。在筛选靶向PBP2a非天然核酸适配体的过程中，第一轮洗脱次数为10次，大多数未结合的XNA文库被除去，随着筛选轮数的增加，与靶标蛋白有结合活性的XNA逐渐富集。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

相较于固相合成来说，固相合成全修饰XNA难度非常大，通常超过30nt的XNA序列成本就非常高，且成功率低。本发明利用定向进化后的SFM4-6聚合酶转录酶法合成XNA适配体文库，合成效率高，合成的文库序列更长，并且生产成本显著降低。与现今常用的利用T7聚合酶突变株转录得到XNA序列相比定向进化后的SFM4-6聚合酶能够耐高温，通过高温转录得到的文库多样性更大，并且转录效率更高，在适宜的条件下转录得到的全长产物更多，操作流程更加简便。

附图说明

图1为靶向PBP2a的2’-F-C，U，2’-OMe-A，G修饰的非天然核酸适配体的筛选流程图。

图2中a为2’-F-C，U，2’-OMe-A，G修饰的非天然核酸适配体文库的转录图，其中，泳道T：转录模板；泳道1：2’-F-C，U，2’-OMe-A，G非天然核酸适配体的转录。

图2中b为2’-F-C，U，2’-OMe-A，G修饰的非天然核酸适配体的转录后DNase I降解的结果图。其中，泳道T：转录模板；泳道1：2’-F-C，U，2’-OMe-A，G修饰的非天然核酸适配体转录后降解。

图3a～图3d为2’-F-C，U，2’-OMe-A，G修饰的非天然核酸适配体筛选的富集结果图。图3a、3b、3c、3d为2’-F-C，U，2’-OMe-A，G非天然核酸适配体第一、三、五、七轮筛选的qPCR结果。曲线W1-W10：2’-F-C，U，2’-OMe-A，G非天然核酸适配体文库正筛选的洗涤溶液；曲线E：95％甲酰胺95℃加热洗脱的洗脱液纯化产物。图3a、3b、3c可以看出最终洗脱曲线的起峰循环早于第十次洗涤的起峰循环，证明靶向PBP2a的2’-F-C，U，2’-OMe-A，G非天然核酸适配体在第一、三、五轮筛选中存在富集。图3d可以看出95％甲酰胺95℃加热洗脱的洗脱液纯化产物曲线的起峰循环数仅次于未结合曲线的起峰循环，证明靶向PBP2a的2’-F-C，U，2’-OMe-A，G非天然核酸适配体在第七轮筛选中存在大量富集。

图4为靶向PBP2a的2’-F-C，U，2’-OMe-A，G修饰的非天然核酸适配体序列的二级结构预测图。

图5为69nt的2’-F-C，U，2’-OMe-A，G修饰的非天然核酸适配体与PBP2a的亲和性结合测试结果。泳道M为marker。泳道1为适配体序列，泳道2为适配体序列加PBP2a。

图6为69nt的2’-F-C，U，2’-OMe-A，G修饰的非天然核酸适配体分别与PBP2a以及BSA的特异性结合验证。泳道1为适配体序列，泳道2为适配体序列加PBP2a，泳道3为适配体序列加3％ BSA。

图7是比较69nt XNA适配体与69nt DNA在DNase I酶中的稳定性结果。图7中a图为DNA在DNase I酶中稳定性结果图，图7中b图为XNA适配体在DNase I酶中稳定性结果图。泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9分别为DNA或XNA在DNase I酶中0、5min、2h、6h、12h、24h、36h、48h、72h的稳定性结果图。图7中c图为DNA和XNA在DNase I酶中稳定性的曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若无特别说明的过程，均认为是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

实施例1：2’-全修饰的非天然核酸适配体的制备。

本实施例中的靶向PBP2a的2’-全修饰的非天然适配体的制备方法，步骤为：利用定向进化后的SFM4-6聚合酶转录得到2’全修饰的非天然核酸适配体文库并用该文库筛选靶向PBP2a的2’-全修饰非天然核酸适配体，最终得到一条69nt的靶向PBP2a的2’-全修饰的非天然核酸适配体。

所述全修饰的非天然核酸适配体文库制备方法为采用一种组合的非天然核苷酸为元件，在SFM4-6聚合酶的作用下，以(N₂₀)-Lib文库为模板，直接转录合成DNA/XNA杂合体产物，经DNase I降解后，制备得到2’-全修饰的XNA文库。

所述2’-全修饰的XNA是指2’-F修饰的尿嘧啶核苷酸，2’-F修饰的胞嘧啶核苷酸，2’-OMe修饰的腺嘌呤核苷酸以及2’-OMe修饰的鸟嘌呤核苷酸。

具体方法为：利用固相合成的随机并且5’-端和3’-端不对称的DNA文库，设计与其互补的转录引物部分以及降解后补齐原始文库序列的扩增引物部分，使得整个筛选流程简单化，无需做额外的末端标记。

所述靶向PBP2a的2’-F-C，U，2’-OMe-A，G修饰的XNA适配体的序列为：

PBP2a-XApt-Seq1

UGCUAGACUACUGACUACGAGCACCCAAUAGGGAGUCGACAUUCACACGGCCCUAAUAGUGAGUCGUAU

实施例2：高容量单链寡核苷酸文库和引物的设计与合成

构建了长度为80nt的单链寡核苷酸文库，5’端和3’端分别为20nt和40nt的固定序列区(结合引物所必需的序列)组成，中间为20nt的随机序列。

(N₂₀)-Lib：5’ATACGACTCACTATTAGGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCGTA GTCAGTAGTCTAGCACCCTAATAGTGAGTCGTATT 3’

Lib-R：5’AATACGACTCACTATTAGGG3’

Lib-F：5’ATACGACTCACTATTAGGGC3’

Lib-R-40：5’AATACGACTCACTATTAGGGTGCTAGACTACTGACTACGA3’

实施例3：2’-全修饰非天然单链寡核苷酸文库的构建

分别制备40管全修饰的文库，转录体系如表1所示，将模板与引物、聚合酶缓冲溶液、MgCl₂以及ddH₂O混合后，于95℃处理10min后，缓慢降至室温，冰上放置10min后加入2’-F-CTP，2’-F-UTP，2’-OMe-ATP，2’-OMe-GTP混合液，MnCl₂，SFM4-6聚合酶，反应条件为50℃2h，70℃20min，6个循环，50℃2h。

表1转录体系

将上述转录产物用Zymo试剂盒纯化后，通过DNase I降解除去体系中的模板和引物DNA(如表2)，反应于37℃孵育24h。将上述降解产物用Zymo试剂盒纯化后得到产物大小为60nt的2’-F-C，U，2’-OMe-A，G修饰的XNA文库。如图2中b图所示：泳道1得到产物大小为60nt的2’-F-C，U，2’-OMe-A，G修饰的XNA文库；泳道1中无明显模板和引物条带，说明模板和引物已经基本完全降解了。

表2DNase I降解DNA体系

实施例4：靶向PBP2a适配体的筛选流程

PBP2a的筛选流程如图1所示。向2’-F-C，U，2’-OMe-A，G修饰的XNA文库中加入结合缓冲溶液(38mM Tris-HCl pH7.4，100mM NaCl，5mM KCl，2mM MgCl₂)至终体积为100μL，95℃加热10min后缓慢冷却至37℃左右，再冰上放置10min使折叠形成具有特定的空间结构，由此形成候选适配体文库。

为排除与酶标板结合的适配体，先将候选适配体文库加入空白的酶标板中37℃孵育2h，后再将未与酶标板结合的适配体文库转移到4℃过夜孵育上PBP2a的酶标板中，37℃孵育2h后，用200μL结合缓冲溶液清洗孔10次，保留未结合的候选适配体、以及10次清洗的结合缓冲溶液。

用95℃预热的95％甲酰胺洗脱酶标板3次，每次100μL，保留含有竞争性结合的候选适配体文库的洗脱液溶液。

将未结合XNA、洗涤溶液和洗脱纯化产物按比例取样，将其扩增模板进行qPCR扩增，体系如表3所示，反应条件为94℃2min，45个循环：94℃30s，55℃30s，68℃1min，68℃10min。从图3a、3b、3c、3d可以看出，曲线W1-W10：2’-F-C，U，2’-OMe-A，G修饰的非天然核酸适配体文库正筛选的洗涤溶液；曲线E：95％甲酰胺95℃加热洗脱的洗脱液纯化产物。可以看出最终洗脱曲线的起峰循环早于第十次洗涤的起峰循环，证明靶向PBP2a的2’-F-C，U，2’-OMe-A，G非天然核酸适配体在每轮筛选中存在富集。特别是第七轮的qPCR结果(图3d)可以看出95％甲酰胺95℃加热洗脱的洗脱液纯化产物曲线的起峰循环数仅次于未结合曲线的起峰循环，证明靶向PBP2a的2’-F-C，U，2’-OMe-A，G非天然核酸适配体在第七轮筛选中存在大量富集。

表3qPCR体系

取洗脱纯化产物进行反转录得到相对应的cDNA链，体系如表4所示，将上述样品与反转录引物Lib-F、反转录酶缓冲液、ddH₂O混合均匀后，于95℃处理10min后，缓慢降至室温，冰上放置10min后加入MnCl₂、dNTPs、DTT、ProtoScript II反转录酶，反应条件为42℃50min，50℃12h。

表4 2’-F-C，U，OMe-A，G修饰的XNA文库反转录体系

实施例5：PCR制备下一轮转录模板

以结合的核酸适配体反转录合成的cDNA为模板，扩增得到下一轮转录的模板(如表5)，为了得到下一轮转录的单链模板，体系所用的是5’磷酸化修饰的扩增产物，反应条件为94℃2min，31个循环：94℃30s，55℃30s，68℃1min，68℃10min。反应条件为94℃ 2min。取3uL上样于6％ PAGE，观察条带是否正确。如果条带正确，大批量PCR 20-30管。将上述扩增产物用Zymo试剂盒纯化后，用Lambda核酸外切酶于37℃降解3-4h，体系如表6所示，降解产物用Zymo试剂盒纯化除去未降解完全的双链得到下一轮转录的单链模板。

表5PCR扩增体系

表6Lambda核酸外切酶降解体系

实施例6：高通量测序

最后一轮与PBP2a结合的候选适配体文库对应的cDNA文库为模板，用于测序的引物扩增，使文库一端带上预设的碱基序列。(如表7所示)。反应条件为94℃2min，31个循环：94℃30s，55℃30s，68℃1min，68℃10min。将扩增产物用大量DNA纯化试剂盒纯化后，跑变性胶，切下相对应的目标条带，去掉扩增中非特异性产生的其他dsDNA。用聚丙烯酰胺DNA回收试剂盒纯化得到高纯度的文库，将最终得到的文库送到上海生工生物科技有限公司进行扩增子测序，测序平台为Illumina HiSeq250，运行模式为PE150。

比对测序结果，将所有序列按照出现的频率进行由高到低的排序。重复出现频率最高的几条序列即为可能靶向PBP2a的候选适配体序列，我们将重复率排名最高的序列的互补序列合成回来，用建库的转录方法进行转录得到富集后的2’-F-C，U，2’-OMe-A，G修饰XNA适配体序列，并进行进一步的活性表征实验。

表7 2’-F-C，U，2’-OMe-A，G文库测序扩增体系

实施例7：适配体结合活性验证

根据测序的结果，合成富集频率最高的序列的互补序列，运用Lib-R为引物转录2’-F-C，U，2’-OMe-A，G修饰的XNA序列，并将转录产物跑变性胶，切下相对应的目标条带后降解得到的XNA序列在反应缓冲液中进行95℃10min处理，并缓慢降至室温，然后在冰上放置10min使其折叠成二级结构，然后与PBP2a在基础缓冲液中孵育2h，然后通过跑PAGE胶验证XNA适配体与PBP2a的结合情况，结合实验数据见图5。

实施例8：适配体与靶标蛋白PBP2a特异性结合活性验证

根据测序的结果，合成富集频率最高的序列的互补序列，运用5’-NH₂修饰的XNA引物转录2’-F-C，U，2’-OMe-A，G修饰的XNA序列，并将转录降解得到的5’-NH₂修饰的XNA序列与羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(NHS-FAM)于37℃反应过夜(如表8所示)，将上述反应产物用Zymo试剂盒纯化后得到5’-FAM修饰的XNA适配体，将其在反应缓冲液中进行95℃10min处理，并缓慢降至室温，然后在冰上放置10min使其折叠成二级结构，然后分别与PBP2a以及3％BSA在基础缓冲液中孵育3h，然后通过跑PAGE胶验证XNA适配体对PBP2a的特异性结合情况，特异性结合实验数据见图6。图6是未染色的结果，泳道1为XNA适配体，泳道2为XNA适配体加PBP2a，泳道3为XNA适配体加3％BSA。

本实施例中，用于制备XNA适配体的XNA引物序列为：5’NH₂-UGCUAGACUACUGACUACGA 3’。

表8 5’-NH₂-XNA适配体与NHS-FAM偶联

实施例9：69nt XNA适配体与69nt DNA的稳定性测试

根据测序的结果，合成富集频率最高的序列的互补序列，运用5’-NH₂修饰的XNA引物转录2’-F-C，U，2’-OMe-A，G修饰的XNA序列，并将转录降解得到的69nt XNA序列与69ntDNA序列中加入DNase I酶，于37℃中孵育，在0min，5min，10min，2h，6h，12h，24h，36h，48h，72h分别取样，比较69nt XNA与69nt DNA在DNase I酶中的稳定性。

Claims

1.靶向PBP2a的非天然核酸适配体获取方法，其特征在于，筛选靶向PBP2a非天然核酸适配体的过程中，第二轮以后的转录文库制备方法主要采用5’-磷酸化扩增引物和反转录引物对筛选到的XNA序列反转录产物做PCR扩增，该引物与模板3’-端互补40nt，包含与转录产物5’-端互补的20nt以及转录引物5’-AATACGACTCACTATTAGGG-3’部分；PCR扩增产物用Lambda核酸外切酶降解，通过控制降解时间，能最大效率降解掉磷酸化的序列以获取单链DNA文库，然后再使用SFM4-6聚合酶转录获取下一轮的XNA文库；在筛选靶向PBP2a非天然核酸适配体的过程中，第一轮洗脱次数为10次，大多数未结合的XNA文库被除去，随着筛选轮数的增加，与靶标蛋白有结合活性的XNA逐渐富集。

2.根据权利要求1所述靶向PBP2a的非天然核酸适配体获取方法，其特征在于，所述XNA文库的制备方法为：采用一种组合的非天然核苷酸为元件在SFM4-6聚合酶的作用下，以(N20)-Lib文库为模板，用转录引物直接转录合成DNA/XNA杂合体产物，经DNase I酶降解后，制备得到2’-全修饰的XNA文库。

3.根据权利要求2所述靶向PBP2a的非天然核酸适配体获取方法，其特征在于，所述采用一种组合的非天然核苷酸为元件具体为：采用2’-F修饰的尿嘧啶核苷酸，2’-F修饰的胞嘧啶核苷酸，2’-OMe修饰的腺嘌呤核苷酸以及2’-OMe修饰的鸟嘌呤核苷酸的非天然核苷酸为元件。

4.根据权利要求2所述靶向PBP2a的非天然核酸适配体获取方法，其特征在于，用于高通量测序引物Seq-F和Seq-R进行测序，最终得到适配体序列，其特征在于，靶向PBP2a的2’-F-C，U，2’-OMe-A，G修饰的XNA适配体的序列为：

PBP2a-XApt-Seq1

5’-UGCUAGACUACUGACUACGAGCACCCAAUAGGGAGUCGACAUUCACACGGCCCUAAUAGUGAGUCGUAU-3’。

5.根据权利要求1所述靶向PBP2a的非天然核酸适配体获取方法，其特征在于，所述5’-磷酸化扩增引物的序列为：

5’P-AATACGACTCACTATTAGGGTGCTAGACTACTGACTACGA-3’。

6.根据权利要求1所述靶向PBP2a的非天然核酸适配体获取方法，其特征在于，所述反转录引物序列为：5’-ATACGACTCACTATTAGGGC-3’。

7.根据权利要求2所述靶向PBP2a的非天然核酸适配体获取方法，其特征在于，所述(N20)-Lib文库序列为：

5’-ATACGACTCACTATTAGGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCGTAGTCAGTAGTCTAGCACCCTAATAGTGAGTCGTATT-3’；

所述转录引物的序列为：5’-AATACGACTCACTATTAGGG-3’。

8.根据权利要求2所述靶向PBP2a的非天然核酸适配体获取方法，其特征在于，所述2’-全修饰的XNA文库的序列为：

5’-UGCUAGACUACUGACUACGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGCCCUAAUAGUGA GUCGUAU-3’。

9.根据权利要求4所述靶向PBP2a的非天然核酸适配体获取方法，其特征在于，所述用于高通量测序引物Seq-F的序列为：

5’-TAATACGACTCACTATAGGATTATACGACTCACTATTAGGGC-3’。

10.根据权利要求4所述靶向PBP2a的非天然核酸适配体获取方法，其特征在于，Seq-R的序列为：5’-CTAGCATAACCCCTTGGGGCAATACGACTCACTATTAGGG-3’。