CN117660281A - 一种利用枯草芽孢杆菌高效表达蔗糖酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用枯草芽孢杆菌高效表达蔗糖酶的方法，属于基因工程和生物工程领域。本发明的枯草芽孢杆菌重组菌以pBHSS4为载体骨架，以来源于解单端孢菌素微杆菌的蔗糖酶基因为目的基因，以枯草芽孢杆菌WB600为表达宿主，成功实现了InvDz13蔗糖酶的表达，并通过筛选得到最佳信号肽SPYomL、共表达伴侣蛋白复合物GrpE‑DnaK‑DnaJ以及共表达分泌途径元件SppA，进一步提高了蔗糖酶的表达水平。利用本发明枯草芽孢杆菌重组菌可高效表达蔗糖酶，以其为生产菌株，摇瓶发酵上清中蔗糖酶的酶活最高达到61.14U/mL，加快了蔗糖酶InvDz13工业化生产及应用的进程。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用枯草芽孢杆菌高效表达蔗糖酶的方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。
背景技术
蔗糖酶(invertase，EC3,2,1,26)又称β-D-呋喃果糖苷水解酶，特异地催化非还原糖中的β-D-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种能够高效分泌蛋白的菌株，被广泛应用于工业酶制剂的生产中，具有如下优势：(1)非致病性，不会产生内毒素等物质；(2)蛋白质分泌功能强；(3)没有明显的密码子偏好性，产物不易形成包涵体；(4)培养简单快速。枯草芽孢杆菌WB600(Bacillus subtilis WB600)利用基因突变的方法失活枯草168菌株基因组中的六种蛋白酶后，其蛋白酶活性为野生型菌株的0.32％，更有利于表达外源蛋白。然而，不同蛋白在枯草芽孢杆菌中的重组表达水平差异明显。
枯草芽孢杆菌中存在四种经典的蛋白分泌途径。为提高目的蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达水平，目前优化蛋白分泌表达的策略主要集中于分泌途径中的某个特定环节。例如增强启动子的转录活性、筛选最适的信号肽、过表达分子伴侣等。然而目的蛋白在枯草芽孢杆菌中进行胞外分泌时需要分泌途径中的各个环节协同发挥作用时才能获得最高胞外表达量。其中，信号肽是辅助前体蛋白折叠以及引导前体蛋白跨膜易位的重要元件，是影响异源蛋白分泌效率以及产量的限制性因素。
一种来源于解单端孢菌素微杆菌(Microbacterium trichothecenolyticum)的蔗糖酶InvDz13是目前报道的对棉子糖特异活性最高的转化酶，其可在温和条件下将棉子糖水解成豆浆中的蜜糖二糖，以改善豆浆的益生元特性，在大豆加工行业中具有重要应用价值。然而，蔗糖酶InvDz13同源表达量低，限制了蔗糖酶的工业化生产及应用。因此，将蔗糖酶InvDz13在枯草芽孢杆菌中进行高效胞外表达具有重要意义。
发明内容
为解决InvDz13蔗糖酶同源表达水平低的问题，本发明通过以pBHSS4为载体骨架，以枯草芽孢杆菌WB600(Bacillus subtilis WB600)为表达宿主，成功表达了解单端孢菌素微杆菌(Microbacterium trichothecenolyticum)来源的蔗糖酶InvDz13。并通过筛选得到最佳信号肽SPYomL、共表达伴侣蛋白复合物GrpE-DnaK-DnaJ以及共表达分泌途径元件SppA，进一步提高了蔗糖酶的表达水平。利用本发明中的枯草芽孢杆菌重组菌可高效表达蔗糖酶，以其为生产菌株，摇瓶发酵上清中蔗糖酶的酶活最高达到61.14U/mL。
本发明提供了一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌进行了信号肽筛选，共表达了分子伴侣以及共表达了分泌途径元件。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌表达了解单端孢菌素微杆菌(Microbacterium trichothecenolyticum)来源的蔗糖酶，并进行如下(a)～(c)中的一种或多种改造：
(a)采用SPYomL信号肽、SPYncM信号肽或SPYddT信号肽表达所述蔗糖酶；
(b)共表达了分子伴侣蛋白PrsA、GroESL、DnaK中的一种或多种；或表达了伴侣蛋白复合物grpE-dnaK-dnaJ；
(c)共表达了分泌途径蛋白secA、sipS、sipT、sppA或tepA。
在本发明的一种实施方式中，所述SPYomL信号肽、SPYncM信号肽、SPYddT信号肽的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2～4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述分子伴侣蛋白PrsA、GroESL、DnaK的GENE ID分别为：939294(prsA)、938006(groES)、938045(groEL)、QKJ78448.1(DnaK)。
在本发明的一种实施方式中，所述grpE-dnaK-dnaJ核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述分泌途径蛋白secA、sipS、sipT、tepA的GENE ID分别为：936711(secA)、938944(sipS)、938763(sipT)、936370(tepA)，编码所述分泌途径蛋白sppA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述蔗糖酶InvDz13的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌WB600为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌表达了蔗糖酶，并具有以下(a)～(c)至少两种改进：
(a)用信号肽SPYomL促进目的蛋白的分泌；
(b)通过共表达伴侣蛋白复合物GrpE-DnaK-DnaJ提高目的蛋白的表达水平；
(c)通过共表达分泌途径元件SppA提高目的蛋白的表达水平。
在本发明的一种实施方式中，所述信号肽基因插入在目的基因的上游。
本发明还提供了一种提高枯草芽孢杆菌表达蔗糖酶的表达量的方法，所述重组枯草芽孢杆菌表达了解单端孢菌素微杆菌(Microbacterium trichothecenolyticum)来源的蔗糖酶，并进行如下(a)～(c)中的一种或多种改造：
(a)采用SPYomL信号肽、SPYncM信号肽或SPYddT信号肽表达所述蔗糖酶；
(b)共表达了分子伴侣蛋白PrsA、GroESL、DnaK中的一种或多种；或表达了伴侣蛋白复合物grpE-dnaK-dnaJ；
(c)共表达了分泌途径蛋白secA、sipS、sipT、sppA或tepA。
在本发明的一种实施方式中，所述SPYomL信号肽、SPYncM信号肽、SPYddT信号肽的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2～4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述分子伴侣蛋白PrsA、GroESL、DnaK的GENE ID分别为：939294(prsA)、938006(groES)、938045(groEL)、QKJ78448.1(DnaK)。
在本发明的一种实施方式中，所述grpE-dnaK-dnaJ核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一种实施方式中，所述分泌途径蛋白secA、sipS、sipT、tepA的GENE ID分别为：936711(secA)、938944(sipS)、938763(sipT)、936370(tepA)，编码所述分泌途径蛋白sppA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述蔗糖酶InvDz13的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌WB600为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌表达了蔗糖酶，并具有以下(a)～(c)至少两种改进：
(a)用信号肽SPYomL促进目的蛋白的分泌；
(b)通过共表达伴侣蛋白复合物GrpE-DnaK-DnaJ提高目的蛋白的表达水平；
(c)通过共表达分泌途径元件SppA提高目的蛋白的表达水平。
在本发明的一种实施方式中，所述信号肽基因插入在目的基因的上游。
本发明还提供了一种蔗糖酶的生产方法，所述方法为，采用所述重组枯草芽孢杆菌发酵制备得到。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将所述枯草芽孢杆菌工程菌先接种于种子培养基中，于35～38℃、180～220rpm下培养8-12h，得到种子液；然后将所述种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到含有蔗糖酶的发酵液。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基包含8～12g/L的蛋白胨、4～6g/L的酵母粉以及8～12g/L的氯化钠。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养为摇瓶发酵培养，将所述种子液按照1％～3％的接种量，接种至摇瓶发酵培养基中，于30～37℃、180～220rpm下培养45～50h；所述摇瓶发酵培养基包含：酵母粉8～12g/L、蛋白胨14～18g/L、4～6g/L的氯化钠、CaCl2 8～12mM、卡那霉素20～40mg/L的所述发酵培养基的初始pH为6～8。
本发明还提供了上述重组枯草芽孢杆菌工程菌在制备含有蔗糖酶的食品、洗涤、造纸、纺织、酒精和医药中的应用。
有益效果
(1)本发明实现了在枯草芽孢杆菌中重组胞外表达蔗糖酶InvDz13。采用本发明的技术方案，以枯草芽孢杆菌WB600(Bacillus subtilis WB600)为表达宿主，以pBHSS4为载体骨架，构建得到枯草芽孢杆菌重组菌Bacillus subtilis WB600/pBHSS4-SPYpuA-InvDz13，经过摇瓶发酵48h，摇瓶发酵上清中蔗糖酶酶活为10.89U/mL。
(2)在本发明构建得到的枯草芽孢杆菌重组菌Bacillus subtilis WB600/pBHSS4-SPYpuA-InvDz13基础上，并通过筛选得到最佳信号肽SPYomL、共表达伴侣蛋白复合物GrpE-DnaK-DnaJ以及共表达分泌途径元件SppA，摇瓶发酵上清中蔗糖酶的酶活最高达到61.14U/mL，极大的提高了蔗糖酶的酶活，在工业生产中具有极大的应用前景。
(3)本发明涉及的一种利用枯草芽孢杆菌高效表达蔗糖酶的方法，为后续枯草芽孢杆菌表达其它重组蛋白提供了一个策略参考，也促进了枯草芽孢杆菌蛋白表达系统的发展。
附图说明
图1为本发明pBHSS4-SPYpuA-InvDz13载体构建逻辑示意图。
图2为本发明伴侣蛋白表达原件在载体中的位置示意图。
图3为本发明含有不同信号肽的枯草芽孢杆菌重组菌的摇瓶发酵蔗糖酶活性；其中A为菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYpuA-InvDz13；B为菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYvcE-InvDz13；C为菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYbdG-InvDz13；D为菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYddT-InvDz13；E为菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13；F为菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYoaW-InvDz13；G为菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPPel-InvDz13；H为菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYncM-InvDz13；I为菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYhcR-InvDz13；J为菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYdjM-InvDz13；K为菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPFliZ-InvDz13。
图4为本发明共表达不同分子伴侣的枯草芽孢杆菌重组菌的摇瓶发酵蔗糖酶活性；其中E为对照菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13；PS为菌株B.subtilisWB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-prsA； DS为菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-dnaK；GS为菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-groESL；DJ为菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-grpE-dnaK-dnaJ；DP为菌株B.subtilisWB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-dnaK-prsA；GP为菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-groESL-prsA。
图5为本发明共表达不同分泌途径元件的枯草芽孢杆菌重组菌的摇瓶发酵蔗糖酶活性；其中，E为对照菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13；SA为菌株B.subtilisWB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-secA； ST为菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-sipT； PA为菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-sppA； TA为菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-tepA； SS为菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-sipS。
具体实施方式
下列实施例中的实施方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
蔗糖酶酶活检测方法：
将120μL的1M的蔗糖溶液和430μL的50mM、pH 6.5的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液充分混匀，在35℃预热10min，加入50μL粗酶液，振荡混匀，反应10min后加入0.3mL DNS，振荡，煮沸15min后迅速冷却，540nm下测析光度(以灭活的酶液为对照)。
在上述条件下，定义单位时间内水解1μmol蔗糖所需要的酶量为1U。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
种子培养基：10g/L的蛋白胨、5g/L的酵母粉以及10g/L的氯化钠。
摇瓶发酵培养基：酵母粉10g/L、蛋白胨16g/L、5g/L的氯化钠、CaCl2 10mM、卡那霉素30mg/L的所述发酵培养基的初始pH为7.0。
LB固体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L的酵母浸粉、10g/L的NaCl、0.2g/L的琼脂粉。
LB液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L的酵母浸粉、10g/L的NaCl。
盐溶液(T-base)：2g/L的(NH4)2SO4、18.3g/L的K2HPO4 3H2O、6g/L的KH2PO4、1g/L的柠檬酸钠·2H2O。
GMI培养基：盐溶液(T base)20mL、50％(w/v)葡萄糖0.2mL、2％(w/v)MgSO40.2mL、10％(w/v)酵母浸粉0.2mL、1％(w/v)酪蛋白水解物0.4mL、2mg/mL色氨酸溶液0.5mL。
GMII培养基：盐溶液(T base)10mL、50％(w/v)葡萄糖0.1mL、2％(w/v)MgSO40.1mL、10％(w/v)酵母浸粉0.04mL、1％(w/v)酪蛋白水解物0.02mL、6％(w/v)CaCl20.01mL、10％(w/v)MgCl2 0.05mL、2mg/mL色氨酸溶液0.25mL。
注：GMI和GMII培养基的各成分中，除了盐溶液外，其余溶液都要单独灭菌，色氨酸滤灭，在使用前将所有组分混合。
实施例1：枯草芽孢杆菌重组菌的构建及其摇瓶发酵
具体步骤如下：
(1)载体骨架的获得
载体骨架pBHSS4-SPYpuA片段是使用引物P1/P2从pBHSS4Y中通过PCR扩增获得的。其中，SPYpuA的GENE ID为：CP053102.1，所述pBHSS4Y载体的构建方法公开于He Li,etal.Enhanced extracellular raw starch-degradingα-amylase production inBacillus subtilis through signal peptide and translation efficiencyoptimization.Biochemical Engineering Journal.2022,189:108718.
其中，引物P1/P2序列信息见表1。
表1：引物序列
| 引物 | 序列(5′-3′) |
| P1 | TCTAGAGTCGACGTCCCCGGGGCAG |
| P2 | GGATCCGGCATCCGCGAGACTGACCTTC |
PCR扩增程序如下：94℃预变性，5min；94℃变性，10s，60℃退火，10s，72℃延伸，4min，30个循环；72℃，10min。
(2)InvDz13蔗糖酶基因的获得
InvDz13蔗糖酶基因片段是使用引物P3/P4以解单端孢菌素微杆菌(Microbacterium trichothecenolyticum)菌落为模板通过PCR扩增获得的。其中引物P3/P4序列信息见表2，InvDz13蔗糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
表2：引物序列
| 引物 | 序列(5′-3′) |
| P3 | AGTCTCGCGGATGCCGGATCCGCACCGGTTGCCCCGGCTGC |
| P4 | CCGGGGACGTCGACTCTAGATCACGGCAGCGGGGTAACTT |
PCR扩增程序如下：94℃预变性，5min；94℃变性，10s，55℃退火，10s，72℃延伸，20s，30个循环；72℃，10min。
(3)含有InvDz13蔗糖酶基因的重组载体的构建
采用POE-PCR的方法将步骤(1)得到的载体骨架pBHSS4-SPYpuA片段与步骤(2)得到的蔗糖酶基因片段进行连接，制备得到重组载体pBHSS4-SPYpuA-InvDz13。
POE-PCR反应见表3。
表3：POE-PCR反应体系
PCR扩增程序如下：94℃预变性，5min；94℃变性，10s，55℃退火，10s，72℃延伸，15min，30个循环；72℃，20min。
(4)含有InvDz13蔗糖酶基因的枯草芽孢杆菌重组菌的构建
将POE-PCR的PCR产物重组载体pBHSS4-SPYpuA-InvDz13转化到枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中，获得重组转化子即为含有InvDz13蔗糖酶基因的枯草芽孢杆菌重组菌WB600/pBHSS4-SPYpuA-InvDz13。
其中，枯草芽孢杆菌转化的具体步骤如下：
将枯草芽孢杆菌WB600在含30mg/L卡那霉素的LB固体平板上划线，37℃过夜培养；用接种环挑取一个单克隆接于5mL GMI溶液中，37℃，200rpm振荡培养10-12h。次日取2mL新鲜培养液转接到18mL GMI溶液中，37℃，200rpm振荡培养4.5h；然后从中取10mL上述培养液转接到90mL GMII中，37℃，200rpm振荡培养1.5h后即为感受态细胞。将感受态细胞分装成500μL到2mL灭菌的离心管中待用，感受态细胞最好现做现用；转化时，在500μL感受态细胞中加入适量DNA(～1μg)。于37℃缓慢振荡120rpm)孵育2.5h后涂布到含有30mg/L卡那霉素的平板，37℃过夜培养；次日挑取单菌落到5mL的LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养12h，抽取质粒送测序，序列分析正确的即是含有InvDz13蔗糖酶基因的重组枯草芽孢杆菌WB600/pBHSS4-SPYpuA-InvDz13。
(5)含有InvDz13蔗糖酶基因的枯草芽孢杆菌重组菌的摇瓶发酵
将步骤(4)获得的枯草芽孢杆菌重组菌WB600/pBHSS4-SPYpuA-InvDz13先接种于种子培养基中，于37℃、200rpm下培养12h获得种子液，将种子液按照2％(v/v)的接种量接种至摇瓶发酵培养基中，于30℃、200rpm下培养48h获得发酵液。
将获得的枯草芽孢杆菌重组菌的发酵液于4℃、8000rpm、离心10min，离心后的上清即为发酵所得的粗酶液。对获得的粗酶液进行蔗糖酶酶活性检测得到酶活数据为10.89U/mL。
实施例2：含有不同信号肽的枯草芽孢杆菌重组菌的构建及摇瓶发酵
(1)信号肽初筛质粒的构建
用于筛选信号肽的质粒pBE-SPaprE-InvDz13按以下方式构建。通过用BamHⅠ与HindⅢ酶切质粒pBE-S(来源于Takara公司的B.subtilis Secretory Protein ExpressionSystem试剂盒)获得pBE-SPaprE片段，酶切体系见表4。InvDz13片段是使用引物P5/P6以pBE-SPaprE-InvDz13为模板通过PCR扩增获得的，用BamHⅠ与HindⅢ进行双酶切，将所获得的pBE-SPaprE片段与InvDz13片段进行T4连接，连接体系见表5，转化E.coli JM109，最后获得pBE-SPaprE-InvDz13。其中，引物P5/P6序列信息见表6。
表4：酶切反应体系
| 酶切组分 | 用量 |
| 质粒或片段 | 2μg |
| QuickCutTM BamH I | 2.5μL |
| QuickCutTM HindⅢ | 2.5μL |
| 10×QuickCut Buffer | 5μL |
| ddH2O | 补齐50μL |
反应条件：37℃反应1h。
表5：T4连接体系
| 组分 | 用量 |
| 基因片段 | 3.5μL |
| 质粒片段 | 0.5μL |
| T4连接酶 | 0.5μL |
| 10×T4 Buffer | 0.5μL |
反应条件：反应条件：22℃反应2h。
使用P7/P8进行扩增pBE-SPaprE-InvDz13获得pBE-InvDz13片段(去掉了信号肽SPaprE)，并使用ClonExpress IIOne Step Cloning Kit(购自Vazyme)将其与173种不同的B.subtilis信号肽混合物(来源于Takara公司的B.subtilis Secretory ProteinExpression System试剂盒)连接(信号肽连接至InvDz13基因的5′端)，然后将连接体系直接转化E.coli JM109后涂布至相应抗性平板中，过夜培养。然后，采用ddH2O将平板菌落冲洗下来并收集到EP管中提取质粒，即获得含有不同信号肽(SPn)的重组质粒pBE-SPn-InvDz13。其中，引物P7/P8序列信息见表6。
表6：引物序列
| 引物 | 序列(5′-3′) |
| P5 | cgcggatccgcaccggttgcc |
| P6 | cccaagctttcacggcagcgg |
| P7 | cgcgtccctctccttttgcttaagttcagagtag |
| P8 | ggccggtgcacatatggcaccggttgccccggct |
(2)信号肽文库的构建及高通量筛选
将步骤(1)获得的含有不同信号肽的重组质粒pBE-SPn-InvDz13转化到枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中，枯草芽孢杆菌转化的具体步骤如实施例1的步骤(4)所述。
高通量筛选具体步骤如下：
在含有30μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上37℃过夜培养后，将含有不同信号肽的重组菌落接种到含有30μg/mL卡那霉素的LB培养基中，并在96孔板中37℃和800rpm培养10h。然后，将60μL上述菌液转移到新的含有600μL LB培养基的96孔板中，添加30μg/mL卡那霉素，在30℃ 800rpm下培养48h，剩余菌液添加甘油保存，待用。培养结束后，96孔板进行1000rpm振荡离心15min，测量上清液中的InvDz13蔗糖酶酶活，酶活较高的菌株进行信号肽测序。一共筛选了约1920个菌，得到了10个酶活较高的菌落，同时以其他菌落为对照菌落；分别制备得到重组质粒：
pBE-SPYvcE-InvDz13、pBE-SPYbdG-InvDz13、pBE-SPYddT-InvDz13、pBE-SPYomL-InvDz13、pBE-SPYoaW-InvDz13、pBE-SPPel-InvDz13、pBE-SPYncM-InvDz13、pBE-SPYhcR-InvDz13、pBE-SPYdjM-InvDz13和pBE-SPFliZ-InvDz13。其中，信号肽SPYvcE、SPYbdG、SPYoaW、SPPel、SPYhcR、SPYdjM和SPFliZ序列信息见表7，SPYddT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，SPYomL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，SPYncM基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
表7：信号肽序列
(3)含有不同信号肽的重组菌的构建
片段pBHSS4-InvDz13是使用引物P9/P10以pBHSS4-SPYpuA-InvDz13为模板通过PCR扩增获得的。
根据步骤(2)的测序结果得到了不同的信号肽序列片段。片段SPYvcE、SPYbdG、SPYddT、SPYomL、SPYoaW、SPPel、SPYncM、SPYhcR、SPYdjM和SPFliZ是分别使用引物P11/P12、P13/P14、P15/P16、P17/P18、P19/P20、P21/P22、P23/P24、P25/P26、P27/P28和P29/P30分别以pBE-SPYvcE-InvDz13、pBE-SPYbdG-InvDz13、pBE-SPYddT-InvDz13、pBE-SPYomL-InvDz13、pBE-SPYoaW-InvDz13、pBE-SPPel-InvDz13、pBE-SPYncM-InvDz13、pBE-SPYhcR-InvDz13、pBE-SPYdjM-InvDz13和pBE-SPFliZ-InvDz13为模板通过PCR扩增获得的。其中，引物P9/P10、P11/P12、P13/P14、P15/P16、P17/P18、P19/P20、P21/P22、P23/P24、P25/P26、P27/P28和P29/P30序列信息见表8。
表8：引物序列
| 引物 | 序列(5′-3′) |
| P9 | ggatccgcaccggttgcc |
| P10 | tgatccttcctcctttaattggg |
| P11 | aattaaaggaggaaggatcaatgagaaagagtttaattacacttggttt |
| P12 | ggggcaaccggtgcggatcccgccgatgcagttttacttgt |
| P13 | aattaaaggaggaaggatcaatgaaaacattatggaaagtcctcaa |
| P14 | ggggcaaccggtgcggatcccgagacggatacaagcaaaacc |
| P15 | aattaaaggaggaaggatcaatgagaaagaaaagagttattacttgtgtta |
| P16 | ggggcaaccggtgcggatcctgcagaagcgtaacctgcagg |
| P17 | aattaaaggaggaaggatcaatgagaaagaaaagagttattacttgtgtta |
| P18 | ggggcaaccggtgcggatcctgcagtagcgtaacctgcagg |
| P19 | aattaaaggaggaaggatcaatgaaaaagatgttgatgttagctttt |
| P20 | ggggcaaccggtgcggatccagccgaagcttcccctacat |
| P21 | aattaaaggaggaaggatcaatgaaaaaagtgatgttagctacggc |
| P22 | ggggcaaccggtgcggatcctgcgttcgcgccagctgg |
| P23 | aattaaaggaggaaggatcaatggcgaaaccactatcaaaagg |
| P24 | ggggcaaccggtgcggatccagcgtctgccgcgggtaa |
| P25 | aattaaaggaggaaggatcaatgctgtctgtcgaaatgataagc |
| P26 | ggggcaaccggtgcggatccagcttcgaacgtgtacattacattta |
| P27 | aattaaaggaggaaggatcaatgttgaagaaagtcattttagccg |
| P28 | ggggcaaccggtgcggatcccgcactggcatctgatgaaa |
| P29 | aattaaaggaggaaggatcaatgaaaaagagtcaatattttattgttttta |
| P30 | ggggcaaccggtgcggatcctgccgcggcagcagcaat |
使用POE-PCR将SPYvcE、SPYbdG、SPYddT、SPYomL、SPYoaW、SPPel、SPYncM、SPYhcR、SPYdjM和SPFliZ片段分别与pBHSS4-InvDz13片段连接，然后转化到枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中，挑取阳性克隆，得到含有不同信号肽的重组菌B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYvcE-InvDz13、B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYbdG-InvDz13、B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYddT-InvDz13、B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13、B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYoaW-InvDz13、B.subtilis WB600/pBHSS4-SPPel-InvDz13、B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYncM-InvDz13、B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYhcR-InvDz13、B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYdjM-InvDz13、B.subtilis WB600/pBHSS4-SPFliZ-InvDz13。
(4)含有不同信号肽的重组菌的摇瓶发酵
分别将步骤(3)获得的枯草芽孢杆菌重组菌及实施例1制备得到的重组菌株WB600/pBHSS4-SPYpuA-InvDz13先接种于种子培养基中，于37℃、200rpm下培养12h获得种子液，将种子液按照2％(v/v)的接种量接种至摇瓶发酵培养基中，于30℃、200rpm下培养48h获得发酵液。
将获得的枯草芽孢杆菌重组菌的发酵液于4℃、8000rpm、离心10min，离心后的上清即为发酵所得的粗酶液。分别检测发酵上清的粗酶液酶活，结果如表9所示。
表9：不同重组菌的摇瓶发酵酶活
| 菌株 | 蔗糖酶活性/(U/mL) |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYpuA-InvDz13 | 11.23 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYvcE-InvDz13 | 22.70 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYbdG-InvDz13 | 9.73 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYddT-InvDz13 | 30.82 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13 | 40.42 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYoaW-InvDz13 | 22.75 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPPel-InvDz13 | 29.55 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYncM-InvDz13 | 31.48 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYhcR-InvDz13 | 9.68 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYdjM-InvDz13 | 17.09 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPFliZ-InvDz13 | 12.98 |
从图3及表9中可以看出，通过筛选得到了最佳信号肽SPYomL、SPYncM和SPYddT，其中信号肽SPYomL介导的枯草芽孢杆菌重组菌B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13的摇瓶发酵蔗糖酶酶活最高，为40.42U/mL，是对照菌株B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYpuA-InvDz13摇瓶发酵蔗糖酶酶活的3.6倍。
实施例3：共表达分子伴侣枯的草芽孢杆菌重组菌的构建及摇瓶发酵
(1)共表达单分子伴侣载体的构建
为了提高InvDz13在B.subtilis中的胞外表达量，改善蛋白的折叠环境，尝试对表达载体进行优化。选择共表达分子伴侣蛋白PrsA(Gene ID为：939294)、GroESL(groES的GENE ID为：938006、groEL的GENE ID为：938045)和DnaK(GENE ID为：QKJ78448.1)。
启动子PaprE片段是使用引物P31/P32以pBHSSD2载体为模板通过PCR扩增获得的：
actagtgttcttttctgtatgaaaatagttatttcgagtctctacggaaatagcgagagatgatatacctaaatagagataaaatcatctcaaaa aaatgggtctactaaaatattattccatctattacaataaattcacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaacttaagcaaaaggagagggacg cgt。
终止子Ter-1片段是使用引物P33/P34以pBHSSD2载体为模板通过PCR扩增获得的：Tgcggtagtttatcacagttaaattgctaacgcagtcaggcaccgtgtatgaaatctaacaatgcgctcatcgtcatcctcggcaccgtcaccctg gatgctgtaggcataggcttggttatgccggtactgccgggcctatttcactttttgcattctacaaactgcataactattatgtaaatcgctccttttta ggtggcacaaatgtgaggcattttcgctctttccggcaaccacttccaagtaa。
分子伴侣片段prsA、groESL、dnaK是分别使用引物P35/P36、P37/P38和P39/P40以B.subtilis WB600基因组为模板通过PCR扩增获得的。通过Overlap-PCR分别依次连接启动子PaprE、分子伴侣片段以及终止子Ter-1，构成串联片段。所述pBHSSD2载体的构建方法公开于应静茹.高效转化大豆低聚糖的果聚糖蔗糖酶的挖掘、应用及表达[D].安徽大学,2023。
线性化载体片段是使用引物P41/P42以质粒pBHSS4-SPYomL-InvDz13为模板通过PCR扩增获得的。
最后，使用POE-PCR连接各个串联片段和线性化载体片段，生成PCR产物，分别命名为：pBHSS4B1(pBHSS4-SPYomL-InvDz13-PaprE-prsA-Ter-1)、pBHSS4B2(pBHSS4-SPYomL-InvDz13-PaprE-dnaK-Ter-1)、pBHSS4B3(pBHSS4-SPYomL-InvDz13-PaprE-groESL-Ter-1)。具体结构示意图参考图2。其中，引物P31/P32、P33/P34、P35/P36、P37/P38、P39/P40和P41/P42序列信息见表10。
表10引物序列
| 引物 | 序列(5′-3′) |
| P31 | actagtgttcttttctgtatgaaaatagttatttcg |
| P32 | acgcgtccctctccttttgcttaagttc |
| P33 | tgcggtagtttatcacagttaaattgc |
| P34 | cacttcaacgcacctttcagcttacttggaagtggttgccg |
| P35 | cttaagcaaaaggagagggacgcgtatgaagaaaatcgcaatagcag |
| P36 | gcaatttaactgtgataaactaccgcattatttagaattgcttgaagatgaagaag |
| P37 | cttaagcaaaaggagagggacgcgtatgttaaagccattaggtgatcgcgttg |
| P38 | gcaatttaactgtgataaactaccgcattacatcattccacccataccgcccatg |
| P39 | cttaagcaaaaggagagggacgcgtatgagtaaagttatcggaatcgac |
| P40 | gcaatttaactgtgataaactaccgcattattttttgttttggtcgtcg |
| P41 | ttccggcaaccacttccaagtaagctgaaaggtgcgttgaagtgttg |
| P42 | ttcatacagaaaagaacactagtccttccaccctttcgatcaattc |
(2)共表达双分子伴侣载体的构建
为进一步提高胞外蛋白表达量，在过表达单个伴侣蛋白DnaK、PrsA、GroESL优化InvDz13蔗糖酶枯草表达体系的基础上，联合过表达双伴侣分子DnaK和PrsA、GroESL和PrsA以及伴侣蛋白复合物GrpE-DnaK-DnaJ，具体结构示意图参考图2。在过表达双伴侣分子时使用两套启动子和终止子：
1)启动子PaprE片段是使用引物P31/P32以pBHSSD2载体为模板通过PCR扩增获得的，终止子Ter-1片段是使用引物P33/P34以pBHSSD2载体为模板通过PCR扩增获得的。伴侣蛋白复合物基因grpE-dnaK-dnaJ(SEQ ID NO.5)是使用引物P43/P44以B.subtilis WB600基因组为模板通过PCR扩增获得的。线性化载体片段是使用引物P41/P42以质粒pBHSS4-SPYomL-InvDz13为模板通过PCR扩增获得的。最后，使用POE-PCR连接串联片段和线性化载体片段，生成PCR产物pBHSS4D1(pBHSS4-SPYomL-InvDz13-PaprE-grpE-dnaK-dnaJ-Ter-1)。具体结构示意图参考图2。
2)P43启动子是使用引物P45/P46以载体pBHSSD2为模板通过PCR扩增获得的：
Tgataggtggtatgttttcgcttgaacttttaaatacagccattgaacatacggttgatttaataactgacaaacatcaccctcttgctaaagcggccaaggacgctgccgccggggctgtttgcgtttttgccgtgatttcgtgtatcattggtttacttatttttttgccaaagctgtaatggctgaaaattcttacatttattttacatttttagaaatgggcgtgaaaaaaagcgcgcgattatgtaaaatataaagtgatagcggtaccattataggtaagagaggaatgtacac；
终止子Ter-2是使用引物P48/P49以载体pBHSSD2为模板通过PCR扩增获得的：Ctgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgacca aaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctg；
PrsA片段是使用引物P50/P51以质粒pBHSS4B1为模板通过PCR扩增获得的。然后通过Overlap-PCR分别连接启动子P43、目的片段PrsA以及终止子Ter-2这三个片段，构成串联片段P43-PrsA-2-Ter-2。线性化载体片段是使用引物P52/P53以质粒pBHSS4为模板通过PCR扩增获得的。最后，用POE-PCR连接串联片段和载体片段，构建PCR产物pBHSS4D4(pBHSS4-SPYomL-InvDz13-P43-prsA-Ter-2)。具体结构示意图参考图2。
3)串联片段PaprE-dnaK-Ter-1及PaprE-groESL-Ter-1是使用引物P31/P34分别以质粒pBHSS4B2及pBHSS4B3为模板通过PCR扩增获得的。串联片段P43-prsA-Ter-2是使用引物P47/P49以质粒pBHSS4D4为模板通过PCR扩增获得的。线性化载体片段是使用引物P52/P42以质粒pBHSS4B3为模板通过PCR扩增获得的(去除了原有的伴侣分子表达盒)。最后，使用POE-PCR连接串联片段和线性化载体片段，生成PCR产物分别命名为：pBHSS4D2(pBHSS4-SPYomL-InvDz13-PaprE-dnaK-Ter-1-P43-prsA-Ter-2) 及pBHSS4D3(pBHSS4-SPYomL-InvDz13-PaprE-groESL-Ter-1-P43-prsA-Ter-2)。 载体pBHSS4-SPYomL-InvDz13-PaprE-dnaK-Ter-1-P43-prsA-Ter-2实现了目的基因InvDz13同时与伴侣蛋白dnaK和prsA的共表达，载体pBHSS4-SPYomL-InvDz13-PaprE-groESL-Ter-1-P43-prsA-Ter-2实现了目的基因InvDz13同时与伴侣蛋白groESL和prsA的共表达。具体结构示意图参考图2。其中，引物P43/P44、P45/P46、P47、P48/P49、P50/P51和P52/P53序列信息见表11。
表11引物序列
| 引物 | 序列(5′-3′) |
| P43 | cttaagcaaaaggagagggacgcgtatgtcagaagaaaaacaaaccgttg |
| P44 | gcaatttaactgtgataaactaccgcattaatcgcctttaaacgcgcgttttac |
| P45 | tgataggtggtatgttttcgcttgaacttttaaat |
| P46 | gtgtacattcctctcttacctataatggtaccgcta |
| P47 | tctttccggcaaccacttccaagtaatgataggtggtatgttttcgcttgaac |
| P48 | ctgtcagaccaagtttactcatatatactttagattg |
| P49 | accaacacttcaacgcacctttcagccagattacgcgcagaaaaaaaggatct |
| P50 | cattataggtaagagaggaatgtacacatgaagaaaatcgcaatagca |
| P51 | tgagtaaacttggtctgacagttatttagaattgcttgaagatg |
| P52 | agatcctttttttctgcgcgtaatctggctgaaaggtgcgttgaagtgttggt |
| P53 | caagcgaaaacataccacctatcaccttccaccctttcgatcaattcca |
(3)共表达分子伴侣的枯草芽孢杆菌重组菌的构建
将POE-PCR的PCR产物pBHSS4B1(pBHSS4-SPYomL-InvDz13-PaprE-prsA-Ter-1)、pBHSS4B2 (pBHSS4-SPYomL-InvDz13-PaprE-dnaK-Ter-1)、 pBHSS4B3( pBHSS4-SPYomL-InvDz13-PaprE-groESL-Ter-1 ) 、 pBHSS4D1( pBHSS4-SPYomL-InvDz13-PaprE-grpE-dnaK-dnaJ-Ter-1 ) 、 pBHSS4D2(pBHSS4-SPYomL-InvDz13-PaprE-dnaK-Ter-1-P43-prsA-Ter-2)及pBHSS4D3(pBHSS4-SPYomL-InvDz13-PaprE-groESL-Ter-1-P43-prsA-Ter-2)分别转化到枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中，获得重组转化子即分别为共表达分子伴侣的枯草芽孢杆菌重组菌B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-prsA、B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-dnaK、B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-groESL、B.subtilisWB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-grpE-dnaK-dnaJ、B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-dnaK-prsA和B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-groESL-prsA。
(4)共表达分子伴侣枯草芽孢杆菌重组菌的摇瓶发酵
将步骤(3)获得的枯草芽孢杆菌重组菌先接种于种子培养基中，于37℃、200rpm下培养12h获得种子液，将种子液按照2％(v/v)的接种量接种至摇瓶发酵培养基中，于30℃、200rpm下培养48h获得发酵液。
将获得的枯草芽孢杆菌重组菌的发酵液于4℃、8000rpm、离心10min，离心后的上清即为发酵所得的粗酶液。分别检测发酵上清的粗酶液酶活，结果如表12所示。
表12：不同重组菌的摇瓶发酵酶活
| 菌株 | 蔗糖酶活性/(U/mL) |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13 | 41.15 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-prsA | 39.49 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-dnaK | 29.31 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-groESL | 16.31 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-grpE-dnaK-dnaJ | 56.25 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-dnaK-prsA | 19.96 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-groESL-prsA | 27.22 |
从图4及表12中可以看出，枯草芽孢杆菌重组菌B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-grpE-dnaK-dnaJ的发酵上清中蔗糖酶活性达56.25U/mL，是重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13的1.37倍。
实施例4：共表达分泌元件蛋白枯草芽孢杆菌重组菌的构建及摇瓶发酵
(1)共表达分泌途径元件载体的构建
pBHSS4-SPYomL-InvDz13载体是使用引物P54/P55以实施例3制备得到的pBHSS4-SPYomL-InvDz13-prsA为模板通过PCR扩增获得的，secA(GENE ID为：936711)、sipS(GENE ID为：938944)、sipT(GENE ID为：938763)、sppA(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)和tepA(GENE ID为：936370)片段是分别使用引物P56/P57、P58/P59、P60/P61、P62/P63和P64/P65以B.subtilis WB600基因组为模板通过PCR扩增获得的，最后，使用POE-PCR连接串联片段和线性化载体片段，生成PCR产物，分别命名为：pBHSS4F1( pBHSS4-SPYomL-InvDz13-PaprE-secA-Ter-1 ) 、 pBHSS4F2( pBHSS4-SPYomL-InvDz13-PaprE-sipS-Ter-1 ) 、 pBHSS4F3(pBHSS4-SPYomL-InvDz13-PaprE-sipT-Ter-1 ) 、 pBHSS4F4( pBHSS4-SPYomL-InvDz13-PaprE-sppA-Ter-1 ) 和 pBHSS4F5(pBHSS4-SPYomL-InvDz13-PaprE-tepA-Ter-1)。这些元件连接在载体的具体位置结构示意图参考图2。其中，引物P54/P55、P56/P57、P58/P59、P60/P61、P62/P63和P64/P65序列信息见表13。
表13引物序列
| 引物 | 序列(5′-3′) |
| P54 | tgcggtagtttatcacagttaaattg |
| P55 | acgcgtccctctccttttg |
| P56 | gcaaaaggagagggacgcgtatgcttggaattttaaataaaatgtttg |
| P57 | aactgtgataaactaccgcactattcagtacggccgcagc |
| P58 | gcaaaaggagagggacgcgtttgaaatcagaaaatgtttcgaaga |
| P59 | aactgtgataaactaccgcactaatttgttttgcgcatttcg |
| P60 | gcaaaaggagagggacgcgtttgaccgaggaaaaaaatacgaa |
| P61 | aactgtgataaactaccgcattattttgtttgacgcatttcgtt |
| P62 | gcaaaaggagagggacgcgtatgaatgcaaaaagatggattgc |
| P63 | aactgtgataaactaccgcactacttcgcatagagatacatcattctc |
| P64 | gcaaaaggagagggacgcgtatggatcatcgtatggaaaacaca |
| P65 | aactgtgataaactaccgcatcattgaatcatccgtccttctt |
(2)共表达分泌途径元件的枯草芽孢杆菌重组菌的构建
将POE-PCR的PCR产物pBHSS4F1、pBHSS4F2、pBHSS4F3、pBHSS4F4和pBHSS4F5分别转化到枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞中，获得重组转化子即为共表达分泌途径元件的枯草芽孢杆菌重组菌B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-secA、B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-sipS、B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-sipT、B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-sppA、B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-tepA。
(3)共表达分泌途径元件枯草芽孢杆菌重组菌的摇瓶发酵
将步骤(2)获得的枯草芽孢杆菌重组菌先接种于种子培养基中，于37℃、200rpm下培养12h获得种子液，将种子液按照2％(v/v)的接种量接种至摇瓶发酵培养基中，于30℃、200rpm下培养48h获得发酵液。
将获得的枯草芽孢杆菌重组菌的发酵液于4℃、8000rpm、离心10min，离心后的上清即为发酵所得的粗酶液。分别检测发酵上清的粗酶液酶活，结果如表14所示。
表14：不同重组菌的摇瓶发酵酶活
| 菌株 | 蔗糖酶活性/(U/mL) |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13 | 41.55 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-secA | 39.01 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-sipT | 52.90 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-sppA | 61.14 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-tepA | 47.57 |
| B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-sipS | 36.58 |
从图5及表14中可以看出，枯草芽孢杆菌重组菌B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13-sppA的发酵上清中蔗糖酶活性达61.14U/mL，是重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600/pBHSS4-SPYomL-InvDz13的1.47倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌表达了解单端孢菌素微杆菌(Microbacterium trichothecenolyticum)来源的蔗糖酶，并进行如下(a)～(c)中的一种或多种改造：
(a)采用SPYomL信号肽、SPYncM信号肽或SPYddT信号肽表达所述蔗糖酶；
(b)共表达了分子伴侣蛋白PrsA、GroESL、DnaK中的一种或多种；或表达了伴侣蛋白复合物grpE-dnaK-dnaJ；
(c)共表达了分泌途径蛋白secA、sipS、sipT、sppA或tepA。
2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述SPYomL信号肽、SPYncM信号肽、SPYddT信号肽的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2～4所示；所述分子伴侣蛋白PrsA、GroESL、DnaK的GENE ID分别为：939294(prsA)、938006(groES)、938045(groEL)、QKJ78448.1(DnaK)；所述grpE-dnaK-dnaJ核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述分泌途径蛋白secA、sipS、sipT、tepA的GENE ID分别为：936711(secA)、938944(sipS)、938763(sipT)、936370(tepA)；编码所述分泌途径蛋白sppA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，编码所述蔗糖酶InvDz13的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1～3任一所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌WB600为表达宿主。
5.一种提高枯草芽孢杆菌表达蔗糖酶的表达量的方法，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌表达了解单端孢菌素微杆菌来源的蔗糖酶，并进行如下(a)～(c)中的一种或多种改造：
(a)采用SPYomL信号肽、SPYncM信号肽或SPYddT信号肽表达所述蔗糖酶；
(b)共表达了分子伴侣蛋白PrsA、GroESL、DnaK中的一种或多种；或表达了伴侣蛋白复合物grpE-dnaK-dnaJ；
(c)共表达了分泌途径蛋白secA、sipS、sipT、sppA或tepA。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述SPYomL信号肽、SPYncM信号肽、SPYddT信号肽的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2～4所示；所述分子伴侣蛋白PrsA、GroESL、DnaK的GENEID分别为：939294(prsA)、938006(groES)、938045(groEL)、QKJ78448.1(DnaK)；所述grpE-dnaK-dnaJ核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述分泌途径蛋白secA、sipS、sipT、tepA的GENE ID分别为：936711(secA)、938944(sipS)、938763(sipT)、936370(tepA)；编码所述分泌途径蛋白sppA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，编码所述蔗糖酶InvDz13的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；优选的，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌WB600为表达宿主。
8.一种蔗糖酶的制备方法，其特征在于，所述方法为，采用权利要求1～4任一所述的重组枯草芽孢杆菌发酵制备得到的。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法为，将所述重组枯草芽孢杆菌先接种于种子培养基中，于35～38℃、180～220rpm下培养8～12h，得到种子液；将种子液按1％～3％的接种量，接种至发酵培养基中，于30～37℃、180～220rpm下培养45～50h，得到含有蔗糖酶的发酵液。
10.权利要求1～4任一所述的重组枯草芽孢杆菌在制备蔗糖酶或含有蔗糖酶的食品、洗涤用品、造纸用品、纺织用品、酒精用品和医药品中的应用。
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311648356.1A Pending CN117660281A (zh) | 2023-11-29 | 2023-11-29 | 一种利用枯草芽孢杆菌高效表达蔗糖酶的方法 |
Country Status (1)
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| CN (1) | CN117660281A (zh) |
-
2023
- 2023-11-29 CN CN202311648356.1A patent/CN117660281A/zh active Pending
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