CN117625757A - 一种检测末端转移酶活性的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测末端转移酶活性的方法及试剂盒,涉及分子生物学技术领域。本发明提供的检测方法可以真实准确的检测逆转录酶的末端转移酶活性,进而更为真实准确地反映逆转录反应的模板转换效率,进而为细胞mRNA被捕获的效率提供科学准确的评价。本发明提供的方法适用于逆转录体系的调试,操作步骤简单、成本低、且检测周期短,可以满足大规模检测的需求。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,具体而言,涉及一种检测末端转移酶活性的方法及试剂盒。
背景技术
RNA逆转录反应的模板转换效应是指整个逆转录过程中,逆转录酶先以RNA为模板进行延伸,随后利用其末端脱氧核糖核苷酸转移酶(Tdt)活性将以RNA为模板的延伸切换至以DNA为模板的延伸。这个过程主要是利用逆转录酶的三大活性:(1)以RNA为模板的DNA聚合活性;(2)末端脱氧核糖核苷酸转移酶(Tdt)活性;(3)以DNA为模板的DNA聚合活性。其中Tdt活性是影响模板转换效应最关键的因素。Tdt活性是指无需模板即可在合成产物的3′末端添加几个核苷酸的能力。在特定的条件下,逆转录酶可以展现出Tdt活性,如M-MLV逆转录酶会优先在扩增子的3′末端添加胞嘧啶。而逆转录反应中,逆转录酶产生模板转换效应的原理是:逆转录酶先以mRNA为模板,延伸其5′末端之后,利用逆转录酶的Tdt活性在延伸产物的3′末端添加几个胞苷酸,这几个胞苷酸便可以和3′末端带有对应数量鸟苷酸的模板转换寡核苷酸(template-switching oligo,TSO)进行退火,从而延伸产物便能以TSO分子作为新的DNA模板实现继续延伸。
目前许多单细胞转录组测序(Single cell RNA-Seq,ScRNA-seq)的方案大多采用cDNA末端的快速扩增(RACE)技术进行cDNA样本的构建,而RACE实现的关键步骤便是依赖于模板转换效应的逆转录反应。基于模板转换效应的RACE,其应用于ScRNA-seq具有以下优点:(1)它能快速构建并扩增cDNA。这里的快速是指它并不需要使用随机引物,或者oligodT引物,而是使用一条特异性引物GSP就能扩增的目的mRNA的一链cDNA。此时这条一链cDNA就会因为模板转换效应,使之3′端带有TSO结合的区域,同时5′端又具有GSP引物结合的区域。这样便能以这两个区域设计引物进行cDNA的快速扩增;(2)TSO区域能引入独特的分子或细胞标签(UMI、Cell barcode),这能使每一个细胞甚至每一条mRNA都能因此带上独特的标签,方便测序后对每一条read进行校正及来源的追溯。这种方法使得每个细胞都能带上独特的身份标签,这方便了对每个细胞的测序信息进行追溯,因此基于模板转换效应的RACE有助于在高通量测序的基础上降低分析难度。
由此可以看出,实现RACE并应用于ScRNA-seq的关键是逆转录反应中的模板转换效应。而影响模板转换效应的主要因素是逆转录酶的Tdt活性。Tdt活性高则逆转录的模板转录效率高,因此模板转换成功的一链cDNA(成功带上TSO)的浓度越高,这意味着细胞mRNA被捕获的效率就越高,测序后得到的丰度及准确性就越大。反之,如果Tdt活性低,细胞mRNA被捕获的数量就低,那么最终得到的测序的结果对细胞样本序列信息的恢复程度就低。因此逆转录反应的模板转换效率进行精准、简便地测定是保证ScRNA-seq成功进行乃至将这项测序技术应用于产业化生产的关键点。
目前几乎所有的模板转换效率的测定方法是根据产物-模板转换成功的cDNA(成功带上TSO)来表征的。但是这些技术不能直接对模板转换成功的cDNA的浓度进行测定。这是因为即使逆转录酶的Tdt活性再高,模板转换效率也不能完全达到100%,因此逆转录产物中既有模板转换成功的cDNA,又有模板转换失败的cDNA(没有带上TSO),而直接测浓度只能测定总cDNA的浓度而无法准确测出模板转换成功的cDNA的浓度。所以很多关于逆转酶Tdt活性测定的方法是利用能够反映模板转换成功的cDNA的指标来表征。现有的逆转酶Tdt活性测定方法有质谱联立毛细血管电泳法、基于荧光染料的qPCR法和测序法等。
其中,质谱联立毛细血管电泳法是利用待检的逆转录酶和带有荧光标记(FAM)的引物进行特定长度RNA的RACE,再利用质谱和毛细血管电泳对所得到的cDNA产物进行分析,最终根据板转换成功的cDNA的出峰面积来表征模板转换效率。而基于荧光染料的qPCR法是先使用普通PCR仪进行逆转录和模板转换,再以cDNA产物为模板进行基于荧光染料法的qPCR反应,最终以Ct值来表征模板转换成功cDNA。而测序法是采用一代测序或二代测序的方法,通过对cDNA样本进行序列分析及统计从而得出逆转录的模板转换效率。然而这些技术或多或少存在一些缺陷与不足,这很可能会阻碍该检测方法应用产业化生产。
上述提及的目前逆转录反应模板转换效率的测定方法存在一个最主要的问题:现有技术仅是通过反映模板转换成功的cDNA的指标来表征模板转换效率。然而逆转录反应的模板转换效率并不能完全达到100%,这就意味着逆转录产物中会存在有模板转换失败的cDNA,因此如果仅通过测定模板转换成功的cDNA的相关指标来表征模板转换效率并不完全真实准确。
此外影响模板转换效率的因素有很多,如逆转录酶的种类、buffer组分、模板及引物的输入量等,因此如果仅以模板转换成功的cDNA作为检测指标,无法满足体系调试的要求。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测末端转移酶活性的方法及试剂盒以真实准确的检测逆转录酶的末端转移酶活性,进而更为真实准确地反映逆转录反应模板转换效率,进而为细胞mRNA被捕获的效率提供科学准确的评价。本发明的提出有助于ScRNA-seq成功进行,也有助于将这项测序技术应用于产业化生产。本发明提供的方法适用于逆转录体系的调试,操作步骤简单、成本低、且检测周期短,可以满足大规模检测的需求。
本发明是这样实现的:
本发明提供了一种检测末端转移酶活性的方法,其包括如下步骤:
(a)将逆转录引物与RNA模板进行退火,产生逆转录引物-RNA的杂交链。
(b)使用逆转录酶进行依赖于RNA模板的DNA延伸,得到带有黏性末端的RNA-cDNA中间体。
(c)将TSO上的3’区域退火至RNA-cDNA中间体的黏性末端;并以TSO为模板延伸所述RNA-cDNA中间体的cDNA链的3’末端以得到模板转换反应后的cDNA;
(d)在逆转录引物区域设置反向引物,在RNA模板内设置正向内引物,在TSO内设置正向外引物,以上述步骤(c)的产物为模板,通过qPCR反应得到所述正向内引物与所述反向引物扩增产物的Ct1值,通过qPCR反应得到所述正向外引物与所述反向引物扩增产物的Ct2值,计算Ct1值和Ct2值的差值ΔCt以得到末端转移酶的活性;qPCR反应采用同一个探针。发明人发现,利用逆转录引物(RT primer)、逆转录酶进行基于模板转换效应的逆转录。逆转录产物经稀释以后可以直接用于qPCR反应。qPCR反应包括两种反应体系,正向内引物和反向引物组成的内反应体系(Inner引物体系),正向外引物和反向引物组成的内反应体系(Outer引物体系),正向内引物仅与cDNA的RNA模板区域进行退火并扩增,正向外引物仅与cDNA的TSO的区域退火并扩增。
所得到的Inner体系Ct值可表征逆转录产物中总cDNA的量,而Outer体系Ct值用于表征模板转换成功的cDNA的量。故Outer体系Ct值和Inner体系Ct值的差值(ΔCt)能够精确反映模板转换效率。差值(ΔCt)越小,表明模板转换成功的cDNA的量较高,也即模板转换成功的一链cDNA(成功带上TSO)的浓度越高,表征Tdt活性高则逆转录的模板转录效率高。在应用于ScRNA-seq时,这意味着细胞mRNA被捕获的效率就越高,测序后得到的丰度及准确性就越大。
反之,差值(ΔCt)越大,表明模板转换成功的cDNA的量较低,也即模板转换成功的一链cDNA(成功带上TSO)的浓度越低,表征Tdt活性低,逆转录的模板转录效率低。在应用于ScRNA-seq时,这意味着细胞mRNA被捕获的数量就低,测序后最终得到的测序的结果对细胞样本序列信息的恢复程度就低。
因此,Outer体系Ct值和Inner体系Ct值的差值(ΔCt)能够精确反映模板转换效率。外引物的位置对Ct值的大小具有一定的影响。理论上,若以ΔCt表征模板的转换效率,则外引物和内引物的扩增效率应尽可能接近。故外引物和内引物彼此间的距离越近越好。
本发明涉及的探针应该靠近反向引物,但是内引物和外引物与探针的距离没有太大影响。
此外,上述提及的背景技术在测定模板转换效率之前需要预先降解RNA模板并将cDNA产物纯化出来,否则会影响模板转换效率测定的精度,然而现有技术所使用的RNA模板仅有20-30nt,因此逆转录得到的cDNA长度较短,这会增加cDNA的纯化难度。并且降解RNA模板及纯化cDNA的步骤较为繁琐,这限制了背景技术应用于大规模的产业化检测。
而本发明提供的检测方法在逆转录反应后无需RNA模板的降解和cDNA产物的纯化,大大简化了整个操作过程。更适用于模板转换效应的逆转录体系调试以及大规模的产业化检测。
现有的质谱联立毛细血管电泳法和测序法的检测步骤繁琐并且成本较高。特别是测序法,测序前需要逆转录产物进行文库构建或质粒构建等一系列繁琐的操作,并且测序的周期相对较长。因此这些检测技术并不能在短时间内得到检测结果。难以应用于大规模检测及逆转录体系的调试。
而本发明提供的检测方法具有成本低,检测周期短等优点。故本发明适用于模板转换效应的逆转录体系调试以及大规模的产业化检测。
这两个扩增均采用同一条反向引物,同时使用一条Taqman探针,避免了由于探针不同,反向引物位置或序列的差异带来扩增效率的差异,这样有利于更为准确的表征模板转换效率。
在一种可选的实施方式中,也可根据需要对正向内(或外)引物、反向引物进行适当稀释后进行后续的qPCR反应。
步骤(a)中逆转录引物为茎环逆转录引物或Poly T逆转录引物。Poly T逆转录引物可以选自通用的Poly T逆转录引物。如SEQ ID NO:8所示:
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCATTTTTTTTTTTCAAGCT。
步骤(b)中的带有黏性末端的RNA-cDNA中间体,其通过逆转录酶自身的末端转移酶活性在RNA-cDNA中间体的cDNA链的3’末端加上多个相同的脱氧核苷酸的方法得到。
步骤(a)-(c)中使用逆转录酶、dNTPs、RNA酶抑制剂、模板转换寡核苷酸(template-switching oligo,TSO)、及缓冲液进行依赖于RNA模板的DNA延伸。逆转录产物经稀释以后可以直接用于qPCR反应。
上述步骤(b)中逆转录酶缓冲液中含有MnCl2,MnCl2的终浓度为4-16mM;发明人发现,逆转录体系中,MnCl2的浓度稀释至上述浓度后,具有更优的模板转换效率。例如8-16mM,4-8mM,4-6mM。
在一种可选的实施方式中,MnCl2的终浓度为4-8mM。
在本发明应用较佳的实施方式中,步骤(b)中末端添加的多个脱氧核苷酸为多个胞嘧啶脱氧核苷酸(C)。
在一种可选的实施方式中,步骤(b)中末端添加有3个胞嘧啶脱氧核苷酸(C)。
在一种可选的实施方式中,TSO上的3’退火区域包含三个核糖核苷酸残基。
在一种可选的实施方式中,3’退火区域包含三个核鸟嘌呤(rG)核糖核苷酸。
在某些实施方式中,TSO的5’端区域进一步包括以下的一个或多个:条形码序列、唯一分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、捕获引物序列、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰等。
上述步骤(c)得到的cDNA产物需要稀释10-100倍以用于步骤(d)的qPCR反应。在上述稀释倍数下,再利用Taqman-qPCR技术就能得到模板转换效率的准确结果。这避免了降解RNA模板和纯化cDNA产物的繁琐步骤。
在一种可选的实施方式中,步骤(c)得到的cDNA产物的稀释倍数为50倍。
由于影响模板转换效率的因素有很多,如逆转录酶的种类、buffer组分、模板及引物的输入量等,发明人还对逆转录体系中逆转录引物和TSO的浓度进行了筛选,具体如下:
在本发明应用较佳的实施方式中,逆转录反应体系中,以10nM的miRNA为模板时,TSO的浓度为2-100μM,逆转录引物的浓度为2-100μM。
发明人发现在逆转录反应体系调试后,逆转录反应所用TSO和逆转录引物的用量进行优化后,可以获得更为准确的模板转换效率结果。进一步在可选的实施方式中,也可配合Taqman-qPCR技术能得到模板转换效率的准确结果。这避免了降解RNA模板和纯化cDNA产物的繁琐步骤。
在一种可选的实施方式中,TSO浓度为20-100μM,茎环引物的浓度为20-100μM。在上述引物浓度配合下,可以获得更为准确的模板转换效率结果。
在一种可选的实施方式中,TSO浓度为20-100μM,茎环引物的浓度为20-100μM。例如:TSO浓度为20-50μM,茎环引物的浓度为20-50μM。
在一种可选的实施方式中,在qPCR反应过程中,正向外引物的终浓度为0.3-0.5μM,正向内引物的终浓度为0.3-0.5μM,反向引物的终浓度为0.3-0.5μM,探针的终浓度为0.1-0.3μM。
在一种可选的实施方式中,正向外引物的终浓度为0.3μM,正向内引物的终浓度为0.3μM,反向引物的终浓度为0.3μM,探针的终浓度为0.1μM。
在本发明应用较佳的实施方式中,RNA模板选自:mRNA、非编码RNA、miRNA、siRNA、piRNA、lncRNA或核糖体RNA。
在一种可选的实施方式中,RNA模板选自:miRNA。
优选地,逆转录酶为降低或去除了RNase活性的M-MLV逆转录酶、HIV-1逆转录酶、AMV逆转录酶或端粒酶逆转录酶。不同的逆转录酶对于模板转换效率具有一定的影响,在检测时应尽可能选择同一种逆转录酶以降低不同逆转录酶对于末端转移酶活性检测的影响。
在本发明应用较佳的实施方式中,末端转移酶的活性的高低判断方法如下:
ΔCt值越小,末端转移酶的活性越高;或
ΔCt值越大,末端转移酶的活性越低。
在本发明应用较佳的实施方式中,步骤(a)中的退火步骤采用梯度退火的方式。通过梯度退火有助于提高结合效率。
步骤(a)中梯度退火的起始退火温度为65℃,每秒下降0.1℃,直至4℃,退火时间为15-20min;
在一种可选的实施方式中,退火时间为16min。
在本发明应用较佳的实施方式中,步骤(b)和步骤(c)的反应温度条件为根据逆转录酶的最适反应温度来决定,反应时间为90-180min;
在一种可选的实施方式中,步骤(c)的反应时间为120min。
在本发明应用较佳的实施方式中,步骤(d)中的qPCR反应还包括探针;
在一种可选的实施方式中,探针为Taqman探针。由于Taqman-qPCR技术相对其它技术来说反应灵敏度较高,因此,发明人在对引物用的量及逆转录产物的稀释倍数(例如10-100倍)做出优化以后,再利用Taqman-qPCR技术就能得到模板转换效率的准确结果。这避免了降解RNA模板和纯化cDNA产物的繁琐步骤。
本发明还提供一种试剂盒,其包括:qPCR聚合酶、反向引物、正向内引物、正向外引物、探针、逆转录引物、RNA模板、TSO,所述反向引物、正向内引物、正向外引物、RNA模板、TSO、探针的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1-3以及SEQ ID NO:5-7所示,所述逆转录引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8所示。
在一种可选的实施方式中,上述试剂盒还包括逆转录反应buffer、dNTPs、qPCRbuffer以及水等物质。
本发明具有以下有益效果:
相较于现有背景技术中仅根据模板转换成功的cDNA相关指标表征模板转换效率存在不够客观准确的问题。本发明提供的检测方法:将逆转录产物分成两部分,一部分通过qPCR得到正向内引物与反向引物扩增产物的Ct1值,另一部分通过qPCR得到正向外引物与反向引物扩增产物的Ct2值,其中Ct1值可表征逆转录产物中总cDNA的量,而Ct2值用于表征模板转换成功的cDNA的量。故Ct1值和Ct2值的差值ΔCt能够很精准地反映模板转换效率。
这两个扩增均采用同一条反向引物,同时使用一条Taqman探针,避免了由于探针不同,反向引物位置或序列的差异带来逆转录效率的差异,这样有利于更为准确的表征模板转换效率。
此外,本发明提供的检测方法在逆转录反应后无需进行RNA模板的降解和cDNA产物的纯化,大大简化了整个操作过程。更适用于模板转换效应的逆转录体系调试以及大规模的产业化检测。
而本发明提供的检测方法具有成本低,检测周期短等优点。故本发明适用于模板转换效应的逆转录体系调试以及大规模的产业化检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1提供的检测方法的步骤(a)-(c)的检测原理图;
图2为本发明实施例1提供的检测方法的步骤(d)的检测原理图;
图3为实验例1中不同逆转录酶在不同引物浓度下的ΔCt值;
图4为实验例1中不同逆转录酶在更高的引物浓度下的ΔCt值;
图5为实验例2中不同逆转录酶在不同MnCl2浓度下的ΔCt值;
图6为直链引物的检测原理图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
除非另外指明,否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术,所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术,如《分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,第二版(Sambrook等人,1989);《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编,1984);《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编,1987);《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.);《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编);《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987);《当代分子生物学方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编,1987);《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编,1994);以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编,1991),所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种检测逆转录酶的末端转移酶活性的方法,具体包括如下步骤。
(a)以一段miRNA为RNA模板,将其与茎环逆转录引物(Stem-loop primer)进行梯度退火。各组分用量及反应条件如下表所示。
在其他实施方式中,也可采用图6所示的Poly T逆转录引物进行梯度退火,原理参照图6所示。
(b)将待检的逆转录酶、缓冲液、模板转换寡核苷酸(TSO)、RNA酶制剂、MnCl2等组分按下表进行配制以进行依赖于RNA的DNA延伸。当延伸至cDNA的3′末端,逆转录酶便发挥其末端转移酶活性添加了几个胞嘧啶脱氧核苷酸(C)。反应温度根据待检逆转录酶的种类进行设置。
(c)添加上去的胞嘧啶脱氧核苷酸(C)会与TSO上的鸟嘌呤核苷酸(rG)互补配对,从而实现模板从RNA到DNA的切换(模板转换),再利用逆转录酶的依赖于DNA的DNA聚合酶活性以TSO为DNA模板继续延伸,最终扩增出一段带有Stem-loop primer、miRNA以及TSO区域的cDNA,模板转换成功的cDNA。
然而如果转换转换失败,则会产生一段仅带Stem-loop primer和miRNA区域的cDNA,参照图1。因此基于模板转换的逆转录反应产生的cDNA中,既有模板转换成功的cDNA,又有模板转换失败的cDNA。其中模板转换成功的cDNA占总cDNA的比例越高,说明模板转换效率越高,参照图1所示。
(d)将逆转录产物作50倍稀释,稀释后作为模板进行TaqMan probes的qPCR技术以测定逆转录酶的末端转移酶活性(模板转换效率)。qPCR反应包括两种反应体系,正向内引物(Inner PCR-primer)和反向引物组成的内反应体系(Inner引物体系),正向外引物(Outer PCR-primer)和反向引物组成的内反应体系(Outer引物体系),正向内引物仅与cDNA的RNA模板区域进行退火并扩增,正向外引物仅与cDNA的TSO的区域退火并扩增。qPCR的组分配制及反应条件见下表:
所得到的Inner体系Ct值可表征逆转录产物中总cDNA的量,而Outer体系Ct值用于表征模板转换成功的cDNA的量。故Outer体系Ct值和Inner体系Ct值的差值(ΔCt)能够精确反映模板转换效率,即逆转录酶的末端转移酶活性。
需要说明的是,模板转换成功的cDNA产物均可以与正向外引物和正向内引物进行退火扩增,而模板转换失败的cDNA仅能与正向内引物进行退火扩增。这两个扩增均采用同一条反向引物,同时使用同一条Taqman探针。在以反向引物进行的延伸时,利用Taq酶的5′→3′核酸外切酶的活性,便可以切割下探针,产生荧光信号被仪器捕捉,从而产生对应的Ct值。参照图2所示。
本发明提供的检测方法,在逆转录反应后无需降解RNA模板和纯化cDNA产物,大大简化了整个操作过程,并且还具有成本低,检测周期短等优点。故本发明适用于模板转换效应的逆转录体系调试以及大规模的产业化检测。
本发明涉及的模板、引物、探针等序列信息见下表:
实验例1
本实验例探究了逆转录反应体系下,不同浓度的茎环逆转录引物和TSO对模板转换效率的影响。
分别设置茎环逆转录引物和TSO的浓度为:26nM、0.1μM、0.2μM、2μM、10μM和20μM,按照实施例1的检测方法进行逆转录反应,并采用两种不同的逆转录酶参与反应以测定它们的末端转移酶活性(Tdt活性)。所使用逆转录酶均为MMLV酶,它们名称分别为MM02逆转录酶和SDmmlv逆转录酶。miRNA模板和其它引物的浓度若无特别指出,则是按照实施例1的标准执行。
参照图3所示,结果显示,茎环逆转录引物的浓度为20μM,TSO的浓度为20μM时,ΔCt值最小,也即表明模板转换成功的cDNA的量较高,也即模板转换成功的一链cDNA(成功带上TSO)的浓度越高,则该引物浓度下逆转录反应的模板转换效率最高。且MM02逆转录酶的Tdt活性高于SDmmlv。
进一步地,采用10μM、20μM、50μM和100μM的茎环逆转录引物和TSO按照实施例1的检测方法进行逆转录反应,并采用不同的逆转录酶参与反应。逆转录酶分别为MM02逆转录酶和SDmmlv逆转录酶。
参照图4所示,结果显示,茎环逆转录引物的浓度为100μM,TSO的引物浓度为100μM时,ΔCt值最小,则该浓度下逆转录反应的模板转换效率最高。但是茎环逆转录引物和TSO的浓度从20μM提升至100μM时,ΔCt降低的不是很明显,即模板转换效率提升得不明显。因此从成本的角度考虑,茎环逆转录引物和TSO的浓度的最佳浓度为20μM。同时结果表明MM02逆转录酶的Tdt活性要高于SDmmlv。
实验例2
本实验例探究了逆转录反应体系下,不同的MnCl2浓度对模板转换效率的影响。
分别采用0mM、4mM、8mM、16mM和23.25mM的MnCl2浓度按照实施例1的检测方法进行逆转录反应以探究MnCl2对模板转换效率的影响,并采用不同的逆转录酶参与反应。逆转录酶分别为MM02逆转录酶和SDmmlv逆转录酶。miRNA模板和相关引物的浓度若无特别指出,则是按照实施例1的标准执行。
参照图5所示,结果显示,MnCl2浓度为8mM且逆转录酶为MM02时,ΔCt值最小,也即表明模板转换成功的cDNA的量较高,也即模板转换成功的一链cDNA(成功带上TSO)的浓度越高,表征逆转录酶的Tdt活性高则逆转录的模板转录效率高。且MnCl2浓度为8mM时,MM02逆转录酶的Tdt活性要高于SDmmlv逆转录酶。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测末端转移酶活性的方法,其中,所述方法包括如下步骤:
(a)将逆转录引物与RNA模板进行退火,产生逆转录引物-RNA的杂交链;
(b)使用逆转录酶进行依赖于RNA模板的DNA延伸,得到带有黏性末端的RNA-cDNA中间体;
(c)将模板转换寡核苷酸(TSO)上的3’区域退火至所述RNA-cDNA中间体的黏性末端;并以TSO为模板延伸所述RNA-cDNA中间体的cDNA链的3’末端以得到模板转换反应后的cDNA;
(d)在逆转录引物区域设置反向引物,在RNA模板内设置正向内引物,在TSO内设置正向外引物,以上述步骤(c)的产物为模板,通过qPCR反应得到所述正向内引物与所述反向引物扩增产物的Ct1值,通过qPCR反应得到所述正向外引物与所述反向引物扩增产物的Ct2值,计算Ct1值和Ct2值的差值ΔCt以得到末端转移酶的活性;qPCR反应采用同一个探针。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述步骤(a)中逆转录引物为茎环逆转录引物或Poly T逆转录引物;
所述步骤(b)中的所述带有黏性末端的RNA-cDNA中间体,其通过逆转录酶自身的末端转移酶活性在RNA-cDNA中间体的cDNA链的3’末端加上多个相同的脱氧核苷酸的方法得到;
所述步骤(a)-(c)中使用逆转录酶、dNTPs、RNA酶抑制剂、模板转换寡核苷酸(TSO)、及缓冲液进行依赖于RNA模板的DNA延伸;
优选地,所述步骤(b)中末端添加的多个脱氧核苷酸为多个胞嘧啶脱氧核苷酸(C);
优选地,TSO上的3’退火区域包含三个核糖核苷酸残基;
优选地,所述3’退火区域包含三个核鸟嘌呤(rG)核糖核苷酸;
优选地,所述步骤(a)-(c)中所述逆转录酶缓冲液中含有MnCl2,所述MnCl2的终浓度为4-16mM;
更优选地,所述MnCl2的终浓度为4-8mM;
优选地,所述RNA模板选自:mRNA、非编码RNA、miRNA、siRNA、piRNA、lncRNA或核糖体RNA;
更优选地,所述RNA模板为miRNA;
优选地,以10nM的miRNA为模板时,TSO的浓度为2-100μM,逆转录引物的浓度为2-100μM;
更优选地,以10nM的miRNA为模板时,TSO浓度为20-100μM,逆转录茎环引物的浓度为20-100μM。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,所述步骤(c)得到的cDNA产物需要稀释10-100倍以用于所述步骤(d)的qPCR反应;
更优选地,所述步骤(c)得到的cDNA产物的稀释倍数为50倍。
4.根据权利要求1所述的方法,其中,所述qPCR反应过程中,所述正向外引物的终浓度为0.3-0.5μM,所述正向内引物的终浓度为0.3-0.5μM,所述反向引物的终浓度为0.3-0.5μM,所述探针的终浓度为0.1-0.3μM;
优选地,所述正向外引物的终浓度为0.3μM,所述正向内引物的终浓度为0.3μM,所述反向引物的终浓度为0.3μM,所述探针的终浓度为0.1μM。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述逆转录酶为降低或去除了RNase活性的M-MLV逆转录酶、HIV-1逆转录酶、AMV逆转录酶或端粒酶逆转录酶。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法,其中,所述末端转移酶的活性的高低的判断方法如下:
ΔCt值越小,末端转移酶的活性越高;或
ΔCt值越大,末端转移酶的活性越低。
7.根据权利要求1所述的方法,其中,所述步骤(a)中的退火步骤采用梯度退火的方式;
优选地,所述步骤(a)中梯度退火的起始退火温度为65℃,每秒下降0.1℃,直至4℃,退火时间为15-20min;
更优选地,所述退火时间为16min。
8.根据权利要求1所述的方法,其中,所述步骤(b)和步骤(c)的反应温度根据逆转录酶的最适反应温度来决定,反应时间为90-180min;
优选地,所述步骤(c)的反应时间为120min。
9.根据权利要求1所述的方法,其中,所述步骤(d)中的探针为Taqman探针。
10.一种试剂盒,其中,所述试剂盒包括:qPCR聚合酶、反向引物、正向内引物、正向外引物、探针、逆转录引物、RNA模板和TSO,
其中,所述反向引物、正向内引物、正向外引物、RNA模板、TSO、探针的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1-3以及SEQ ID NO:5-7所示,所述逆转录引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8所示。
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