CN116355996A - 一种基于荧光点亮型rna适配体的双信号无标记放大策略的rna剪接变异体检测方法 - Google Patents

一种基于荧光点亮型rna适配体的双信号无标记放大策略的rna剪接变异体检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法，能够高特异性地识别目标RNA剪接位点，经过退火及在T4DNA连接酶的作用下将两探针连接起来，并与靶标结合形成完整双链结构；加入引物后可启动PCR反应，扩增出双链转录模板，实现信号的一次放大；进而转录出荧光RNA适配体Broccoli，加入可与之特异性结合的染料，从而实现信号的二次放大及荧光信号的点亮；最后可通过酶标仪荧光检测系统对目标RNA剪接变异体进行检测定量。本发明简便可控，具有特异性强、灵敏度高、序列无需标记及背景信号低等优点，能够定量检测临床样本中的低丰度RNA剪接变异体，具有广阔的应用前景。

Description

一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的 RNA剪接变异体检测方法
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，具体为一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法。
背景技术
RNA剪接是真核生物基因表达过程中非常关键的环节，它影响着基因的选择和组成，并直接指导蛋白质的合成，因此也间接决定了生物体的生长发育性状和功能。据统计，95％的人类基因都存在mRNA选择性剪接过程，异常的剪接会引起很多疾病的发生，如癌症、神经退役性疾病、自身免疫性疾病等。由于RNA剪接发生在基因表达的早期并且不会改变基因组，因此成为疾病治疗有利的干预点。要想正确解码人类基因组和其他哺乳动物基因组所包含的生命活动信息以及相关的疾病机制，全面和深入的了解RNA剪接过程极为重要。因此，实现对低表达和序列同源性较高的RNA剪接变异体的定量检测是一项重要挑战。
凝胶电泳分析技术是体外判断RNA剪接效率的金标准。尽管凝胶电泳在生物实验中广泛应用，但是其相对荧光检测技术通量较低，并且需要放射性同位素标记，不仅耗时费力，同时在操作方面也存在安全隐患。微阵列技术具有高通量、高扩增能力等优点，但所需设备和材料昂贵，操作相对复杂，从而限制了大范围的应用。除此之外，传统的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)通常需要设计外显子拼接位置序列为杂交的引物，这种引物5’端或3’端与另一种剪接体亚型部分匹配可能会导致错误的扩增，且RT-PCR的方法不能识别特定序列(Exon-Exon序列)，这使得同种型RNA剪接变异体的检测具有较大挑战性。
针对上述问题，开发一种可以定量检测RNA剪接变异体的低成本、高灵敏分析方法对于后续研究具有重要意义。荧光RNA适配体是经体外筛选得到的RNA序列，可以高特异性的与其同源荧光染料结合并显著激活其荧光，具有检测灵敏、背景信号低及荧光开启率高等优点，荧光RNA适体的出现为RNA检测提供了有利的工具。除此之外，荧光RNA适配体的分子质量相对较小，易于修饰，成本较低，在RNA检测领域展现出不凡的应用前景。本发明将荧光点亮型RNA适配体与连接依赖性识别及PCR扩增技术相结合，利用荧光RNA适配体低背景信号、高灵敏检测，连接识别的高特异性和PCR高效扩增的优势，期望实现对目标RNA剪接变异体的精准靶向及灵敏检测。
发明内容
为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法。本方法针对靶标MyD88L，设计了两条可精准靶向RNA剪接变异体序列的探针，称为探针A和探针B，经过退火及在T4 DNA连接酶的作用下将靶标与探针连接成完整双链结构，加入所需引物启动PCR扩增反应，实现信号一次放大的同时形成转录模板，进而在T7启动子的驱使下转录出荧光RNA适配体Broccoli，加入可与之特异性结合的染料DFHBI-1T，从而实现信号的二次放大，最后可通过酶标仪荧光检测系统对靶标序列进行检测及定量。该策略具有特异性强、灵敏度高、序列无需标记及背景信号低等特点，能够定量检测临床样本中的低丰度RNA剪接变异体，在疾病的精确诊断和辅助临床监测等方面具有广阔的应用前景。
一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法，具体方案如下：
(1)设计可特异性结合目标RNA剪接变异体的探针A和探针B，及可触发PCR反应的正、反引物；
(2)加入T4多聚核苷酸激酶、ATP、T4多聚核苷酸激酶缓冲液，将探针A进行5’端磷酸化，便于和探针B连接形成长链；
(3)探针A和探针B与靶标进行退火，在T4 DNA连接酶的作用下，探针A、B被连接成长链，并与目标RNA剪接变异体形成完整双链结构；
(4)加入Taq DNA聚合酶及扩增所需引物，通过PCR反应实现信号的一次放大，同时扩增出双链转录模版；
(5)加入T7 RNA聚合酶、rNTPs，触发RNA转录过程，产生荧光RNA适配体Broccoli，实现信号的二次放大；
(6)将转录得到的荧光RNA适配体Broccoli与特定染料DFHBI-1T结合，进而开启荧光信号；
(7)通过酶标仪荧光检测系统对靶标序列进行检测，实现目标RNA剪接变异体的定量分析。
以下内容是对上述方案中技术路线的补充：
1.本发明针对的靶标是MyD88L，序列(5’-3’)为：CCAGC ATTGA GGAGG ATTGCCAAAA GTATA，设计的探针A和探针B可以特异性靶向目标RNA剪接变异体的拼接位点，探针A序列(5’-3’)为：CCTCC TCAAT GCTGG TTTTT TTAAC TATAC AACAT ACTAC CTCA，探针B序列(5’-3’)为：GATAC AGAGC CCACA CTCTA CTCGA CAGAT ACGAA TATCT GGACC CGACC GTCTCTGTAT CCCTA TAGTG AGTCG TATTA TATAC TTTTG GCAAT，设计的正引物和反引物可辅助PCR扩增反应的进行，正引物序列(5’-3’)为：TGACC TAGTA TGTCG TGTAG TC，反引物序列(5’-3’)为：GATAC AGAGC CCACA CTCTA CT。
2.探针A磷酸化的条件为：在200μL离心管中，加入4μL浓度为10μM的探针A溶液、10U T4多聚核苷酸激酶、1～2μL浓度为10mM的ATP溶液、2μL T4多聚核苷酸激酶缓冲液及11μL DEPC水，37℃反应1小时，65℃反应20分钟。
3.探针与靶标退火的条件为：加入1μL浓度为200nM的目标RNA剪接变异体溶液、1～1.5μL浓度为2μM的探针A溶液、1～1.5μL浓度为2μM的探针B溶液、0.5μL T4 DNA连接缓冲液及0.5～1μL DEPC水，95℃反应3分钟，温度梯度降温至4℃。
4.探针与目标RNA剪接变异体连接的条件为：加入5U T4 DNA连接酶、1μL浓度为10mM的ATP溶液、2～3μL DEPC水，25℃反应1小时，65℃反应10分钟。
5.PCR反应的条件为：加入5U Taq聚合酶、2μL KCl缓冲液、1～1.5μL浓度为25mM的MgCl2溶液、2～3μL浓度为2mM的dNTPs溶液、1μL浓度为1μM的正引物溶液、1μL浓度为1μM的反引物溶液及10μL DEPC水，95℃反应3分钟，60℃反应15秒，循环30次，72℃反应10分钟。
6.转录反应的条件为：加入20U T7 RNA转录酶、6μL T7 RNA转录酶缓冲液、4～5μL浓度为10mM的rNTPs溶液、20U RNA酶抑制剂，37℃反应2～8小时，70℃反应10分钟。
7.荧光信号开启的条件为：加入3～4μL浓度为100μM的染料DFHBI-1T，与荧光RNA适配体Broccoli特异性结合，室温孵育1～30分钟。
8.荧光信号检测的条件为：使用酶标仪荧光检测系统，设置激发波长468nm，发射波长范围为480～600nm，扫描步长为5nm。
9.荧光信号检测的结果为：可通过荧光信号的强度差异来有效区分不同浓度的目标RNA剪接变异体。
一种基于荧光点亮RNA适配体的双信号无标放大策略检测RNA剪接变异体的方法的技术原理如下：本发明设计的探针A和探针B能够高特异性地识别目标RNA剪接位点，经过退火及在T4 DNA连接酶的辅助作用下可将两探针连接起来并与靶标结合形成完整双链结构；加入所需引物探针启动PCR反应，扩增出双链转录模版，实现信号的一次放大，进而在T7启动子的驱使下转录出荧光RNA适配体Broccoli，加入可与之特异性结合的染料DFHBI-1T，从而实现信号的二次放大及荧光信号的点亮，最后可通过酶标仪荧光检测系统对目标RNA剪接变异体进行检测定量。
一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法与现有技术相比，其有益效果是：
(1)荧光信号的双重放大。PCR反应可扩增出双链转录模版，实现信号一次放大，进而在T7启动子的驱使下进行转录，得到荧光RNA适配体Broccoli，通过加入可与之特异性结合的染料DFHBI-1T，从而实现信号的二次放大及荧光信号的点亮。
(2)靶标RNA剪接变异体的高强特异性识别。探针A和探针B能够高特异性地识别靶标RNA剪接位点，经过退火及在T4 DNA连接酶的辅助作用下可将两探针连接起来并与靶标结合形成完整双链结构，基于连接识别的方法可实现目标RNA剪接变异体的精准靶向，从而提高检测特异性。
(3)高灵敏度低背景荧光RNA适配体的选择。荧光RNA适配体可与特定染料特异性结合，荧光背景与检测信号相比极低，具有特异性强、灵敏度高等优点，基于荧光点亮型的RNA适配体的选择能够有效提高检测结果的准确性和灵敏度。
附图说明
图1为本发明整体原理示意图。
图2为本发明中初步验证该方法具有可行性的荧光信号强度图
图3为琼脂糖凝胶电泳图。
图4为靶标与探针比例的优化图。
图5为RNA转录时间的优化图
图6a为PCR反应温度的优化图之一。
图6b为PCR反应温度的优化图之二。
图7为本发明中通过检测不同浓度的目标RNA剪接变异体反映方法灵敏度的结果图。
图8为本发明中通过设计实验条件缺失验证方法特异性的结果图之一。
图9为本发明中通过设计实验条件缺失验证方法特异性的结果图之二。
图10为本发明中根据不同浓度目标RNA剪接变异体的荧光信号拟合的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案做进一步的详细说明：
下述实施例为便于更好地理解本发明，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，不能理解为对本发明保护范围的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除特殊说明，实施例中各实验材料、试剂及设备均可通过常规购买渠道所得。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1：基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法的构建
1.序列设计
本发明针对的目标RNA剪接变异体是MyD88L，设计的探针A和探针B可特异性的靶向目标RNA剪接变异体的拼接位点，设计的正引物和反引物可辅助PCR反应的进行。目标RNA剪接变异体序列、探针A、B序列、正、反引物序列如下表所示。
表1方法构建过程中使用的序列
Figure BDA0004108723130000051
Figure BDA0004108723130000061
2.实验步骤
一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法原理如图1所示，包括以下步骤。
(1)5’端磷酸化探针A的制备：在200μL离心管中，加入4μL浓度为10μM的探针A溶液、10U T4多聚核苷酸激酶、2μL浓度为10mM的ATP溶液、2μL T4多聚核苷酸激酶缓冲液及11μL DEPC水，37℃反应1小时，65℃反应20分钟；
(2)探针与靶标退火：加入1μL浓度为200nM的目标RNA剪接变异体溶液、1.5μL浓度为2μM的探针A溶液、1.5μL浓度为2μM的探针B溶液、0.5μL T4 DNA连接缓冲液及0.5μL DEPC水，95℃反应3分钟，温度梯度降温至4℃；
(3)探针与目标RNA剪接变异体连接：加入5U T4 DNA连接酶、1μL浓度为10mM的ATP溶液、3μL DEPC水，25℃反应1小时，65℃反应10分钟；
(4)PCR扩增反应：加入1μL浓度为1μM的正引物溶液、1μL浓度为1μM的反引物溶液、5U Taq聚合酶、2μL KCl缓冲液、1.5μL浓度为25mM的MgCl2溶液、2μL浓度为2mM的dNTPs溶液及10μL DEPC水，95℃反应3分钟，60℃反应15秒，循环30次，72℃反应10分钟；
(5)转录反应：加入20U T7 RNA转录酶、6μL T7 RNA转录酶缓冲液、5μL浓度为10mM的rNTPs溶液、20U RNA酶抑制剂，37℃反应6小时，70℃反应10分钟；
(6)荧光RNA适配体与染料结合：加入3.5μL浓度为100μM的染料DFHBI-1T，与荧光RNA适配体Broccoli特异性结合，室温孵育1～30分钟；
(7)荧光信号的检测：将上述反应产物转移到384孔板，使用酶标仪荧光检测系统，设置激发波长为468nm，发射波长范围为480～600nm，扫描步长为5nm。通过荧光信号的强度可有效检测目标RNA剪接变异体。
实施例2：基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略对目标MyD88L的检测应用实验
1.方法的初步验证
采用实施例1中的构建方法，不同的地方为步骤(2)，具体为其中加入的两个平行实验的靶标分别为1nM及对照组(不加靶标序列)，通过荧光信号的强度可以看出，1nM靶标序列的荧光信号较强，对照组几乎无信号。实验结果初步验证了一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法具有可行性，如图2所示。
琼脂糖凝胶电泳的实验结果可对以上平行实验的转录产物进行分析，电泳结果表明，产物条带在100bp以下，符合转录产物分子量大小，而对照组几乎无条带，说明无转录产物。琼脂糖凝胶电泳实验结果可以证明实验组转录成功，该方法具有可行性，如图3所示。
2.实验条件的优化
(1)靶标与探针比例的优化
采用实施例1中的构建方法，不同的地方为步骤(2)，具体为其中目标RNA剪接变异体与探针A、B的比例分别为：1:1、1:5、1:10、1:15、1:25、1:50，通过荧光信号的强度可以看出，当靶标与探针的比例为1:15时，信噪比最高，结果如图4所示。
(2)转录时间的优化
采用实施例1中的构建方法，不同的地方为步骤(4)，具体为其中转录的时间分别为2小时、4小时、6小时、8小时，通过荧光信号的强度可以看出，转录反应的时间为6小时，信噪比最高，结果如图5所示。
(3)PCR反应温度的优化
采用实施例1中的构建方法，不同的地方为步骤(3)，具体为其中的PCR反应温度分别为55℃、55.7℃、56.9℃、58.8℃、61.1℃、63℃、64.3℃，通过荧光信号的强度可以看出，PCR反应温度在60℃左右时，信噪比最高，结果如图6a、6b所示。
3.灵敏度检测
(1)取目标MyD88L序列，配制终浓度分别为1nM、100pM、10pM、1pM、100fM、10fM、1fM的样品溶液；
(2)采用实施例1中的构建方法，不同的地方为步骤(2)，具体为其中待测靶标RNA剪接变异体分别为上述步骤制得的样品溶液，通过荧光信号的强度可以看出，随靶标RNA浓度降低，荧光信号逐渐减弱，且当靶标MyD88L终浓度为1fM时，仍能通过荧光信号的强度进行检测，说明该方法灵敏度较高，结果如图7所示。
实施例3：基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大方法对目标RNA剪接变异体MyD88L的特异性测试
1.实验过程中反应条件缺少
(1)准备6组平行实验，靶标MyD88L均配制终浓度为1nM样品溶液，编号①②③④⑤⑥，其中①全加，②不加T4 DNA连接酶，③不加Taq DNA聚合酶，④不加dNTPs，⑤不加T7 RNA聚合酶，⑥不加rNTPs。
(2)采用实施例1中的构建方法，不同的地方为：按照上述条件缺少在各自步骤用DEPC水补齐，通过荧光信号的强度可以看出，当反应条件缺少时，荧光信号较弱，说明反应条件缺一不可，结果如图8所示。
2.PCR扩增过程中正反引物缺失
(1)准备3组平行实验，靶标MyD88L均配制终浓度为1nM样品溶液，编号①②③，其中①全加，②PCR反应不加正引物，③PCR反应不加反引物。
(2)采用实施例1中的构建方法，不同的地方为步骤(3)，具体为按照上述序列缺失在PCR反应过程中，用DEPC水补齐，通过荧光信号的强度可以看出，当正引物或反引物探针缺失时，荧光信号较弱，说明在PCR反应过程中，引物探针缺一不可，结果如图9所示。
实施例4：RNA剪接变异体浓度与RNA适配体荧光强度关系的标准曲线的建立
(1)配制靶标MyD88L序列的标准溶液，终浓度分别为1nM、100pM、10pM、1pM、100fM、10fM、1fM；
(2)采用实施例1中的构建方法，不同的地方为步骤(2)，具体为其中待测靶标MyD88L序列分别为上述配制的标准溶液，通过对荧光信号的检测及对数据进行分析，进而拟合出合理的标准曲线：Y＝217.84102X+153.71739，R2＝0.95366，结果如图10所示。

Claims (9)

1.一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：
(1)设计可特异性识别目标RNA拼接位点的探针A和探针B，以及可触发PCR反应的正引物和反引物；
(2)加入T4多聚核苷酸激酶、ATP、T4多聚核苷酸激酶缓冲液将探针A进行5’端磷酸化，便于和探针B连接形成长链；
(3)探针与目标RNA剪接变异体进行退火，在T4 DNA连接酶的作用下，探针A、B被连接成长链，并与靶标形成完整双链结构；
(4)加入Taq DNA聚合酶及扩增所需引物，通过PCR反应实现信号的一次放大，同时扩增出双链转录模版；
(5)加入T7 RNA聚合酶、rNTPs，触发RNA转录过程，产生荧光RNA适配体Broccoli，实现信号的二次放大；
(6)将转录得到的荧光RNA适配体Broccoli与特定染料结合，进而开启荧光信号；
(7)通过酶标仪荧光检测系统对靶标序列进行检测，从而实现RNA剪接变异体的定量分析。
2.根据权利要求1所述的一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法，其特征在于，步骤(1)中，针对的靶标是MyD88L，序列(5’-3’)为：CCAGC ATTGA GGAGG ATTGC CAAAA GTATA，设计的探针A和探针B是可以特异性结合目标RNA剪接变异体的寡核苷酸序列，包含靶向序列MyD88L的核酸靶向区，探针A序列(5’-3’)为：CCTCC TCAAT GCTGG TTTTT TTAAC TATAC AACAT ACTAC CTCA，探针B序列(5’-3’)为：GATACAGAGC CCACA CTCTA CTCGA CAGAT ACGAA TATCT GGACC CGACC GTCTC TGTAT CCCTA TAGTGAGTCG TATTA TATAC TTTTG GCAAT，设计的正引物和反引物可以辅助PCR扩增反应的进行，正引物序列(5’-3’)为：TGACC TAGTA TGTCG TGTAG TC，反引物(5’-3’)为：GATAC AGAGCCCACA CTCTA CT。
3.根据权利要求1所述的一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法，其特征在于：步骤(2)中，探针A磷酸化的条件为：在200μL离心管中，加入4μL浓度为10μM的探针A溶液、10U T4多聚核苷酸激酶、1～2μL浓度为10mM的ATP溶液、2μL T4多聚核苷酸激酶缓冲液及11μL DEPC水，37℃反应1小时，65℃反应20分钟。
4.根据权利要求1所述的一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法，其特征在于，步骤(3)中，探针与靶标退火的条件为：加入1μL浓度为200nM的目标RNA剪接变异体溶液、1～1.5μL浓度为2μM的探针A溶液、1～1.5μL浓度为2μM的探针B溶液、0.5μL T4 DNA连接缓冲液及0.5～1μL DEPC水，95℃反应3分钟，温度梯度降温至4℃。
5.根据权利要求1所述的一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法，其特征在于，步骤(3)中，探针与目标RNA剪接变异体连接的条件为：加入5U T4 DNA连接酶、1μL浓度为10mM的ATP溶液、2～3μL DEPC水，25℃反应1小时，65℃反应10分钟。
6.根据权利要求1所述的一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法，其特征在于，步骤(4)中，PCR反应的条件为：加入5U Taq聚合酶、2μL KCl缓冲液、1～1.5μL浓度为25mM的MgCl2溶液、2～3μL浓度为2mM的dNTPs溶液、1μL浓度为1μM的正引物溶液、1μL浓度为1μM的反引物溶液及10μL DEPC水，95℃反应3分钟，60℃反应15秒，循环30次，72℃反应10分钟。
7.根据权利要求1所述的一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法，其特征在于，步骤(5)中，转录反应的条件为：加入20U T7RNA转录酶、6μL T7 RNA转录酶缓冲液、4～5μL浓度为10mM的rNTPs溶液、20U RNA酶抑制剂，37℃反应2～8小时，70℃反应10分钟。
8.根据权利要求1所述的一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法，其特征在于，步骤(6)中，荧光信号开启的条件为：加入3～4μL浓度为100μM的染料DFHBI-1T，与荧光RNA适配体Broccoli特异性结合，室温孵育1～30分钟。
9.根据权利要求1所述的一种基于荧光点亮型RNA适配体的双信号无标记放大策略的RNA剪接变异体检测方法，其特征在于，步骤(7)中，荧光信号检测的条件为：使用酶标仪荧光检测系统，设置激发波长468nm，发射波长范围为480～600nm，扫描步长为5nm；荧光信号检测的结果为：通过荧光信号的强度差异可有效区分不同浓度的目标RNA剪接变异体。
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