CN117624332A - 一种索马鲁肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽合成技术领域，具体涉及一种索马鲁肽的制备方法。该方法将索马鲁肽分成大小相近的两片段，每一片段的氨基酸数目均在20个以内，通过构建C端酰肼片段与N端Cys片段，实现在水相体系中两片段的选择性连接，最后经过脱硫处理获得索马鲁肽。该方法既充分利用了固相多肽合成的优势，又保证了每一段多肽合成的产率，解决了全保护肽片段的溶解性问题，实现了在水相体系中的两片段高效连接。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，具体地，本发明涉及一种索马鲁肽的制备方法。
背景技术
由于生活水平的提高，饮食结构和生活方式的改变等诸多因素，全球糖尿病发病率逐年增高，糖尿病已成为继肿瘤和心血管之后的第三大严重危害人类健康的疾病。尽管I型和Ⅱ型糖尿病发病机理不同，但是他们都以持续的高血糖作为基本的生化特征。Ⅱ型糖尿病人虽然自身能够产生胰岛素，但是由于胰岛素的抵抗使得自身对胰岛素的利用效果大打折扣，导致血糖升高。针对Ⅱ型糖尿病的降糖药物包括二甲双胍类药物、磺酰脲类药物以及胰高血糖样肽-1(GLP-1)的受体激动素类药物等，其中GLP-1相关药物是近年来的研究热点。
索马鲁肽(Semaglutide)是由诺和诺德公司研发的一种新的长效GLP-1类似物，被用于改善Ⅱ型糖尿病患者的血糖控制。通过每周皮下注射一次，可以实现患者血糖水平的大幅改善。除了在降血糖方面的有益功效，索马鲁肽在诱导减肥和减少患者重大心血管事件风险方面也有较好的临床效果。其中索马鲁肽的序列为:H-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(AEEA-AEEA-γ-Glu-Otc)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH，分子式为C187H291N45O59，相对分子质量为4113.58，CAS号为910463-68-2。
目前索马鲁肽的合成主要存在三种常规策略，包括：
策略一：通过基因重组技术，表达获得索马鲁肽主链第3-31或5-31片段，然后再分步连接上N端1-2或1-4片段和Lys20位侧链长效修饰基团。原研厂家诺和诺德早期即采用该策略获得目标索马鲁肽产品。在该策略下，由于存在多个活性位点，使得此工艺会产生较多的杂质，并且工艺操作过于复杂，不利于低成本的大规模化生产。
策略二：采用全固相多肽合成技术。固相多肽合成存在的巨大优势便是操作简便，可机械化流程化，更利于规模化生产。例如专利US8129343、US8536122、CN108059666、CN103848910、CN108203462、CN108359006、CN108676087、CN109021092、CN109311961、CN108059666、CN109180801、CN111217901、CN101133082、CN106478806、CN106928343、CN104356224所涉及的内容。由于固相合成的特有优势，原研厂家也在该领域进行了专利布局(CN101133082)。尽管固相合成优势巨大，然而仍存在一些固有问题，包括：树脂替代值的限制、物料及溶剂的浪费和大量废液的产生。所有的这些问题，在工业化生产中都归结为成本较为高昂。
为了有效降低成本以及发挥固相合成优势，片段连接的方式成为可供选择的第三种策略。专利WO2016046753报道了多片段的固相合成及肽片段液相缩合来获取索马鲁肽主链的方法；专利CN106749613报道了三片段固液相结合策略来获取索马鲁肽的方法；专利CN109456401报道了液相合成六个主链片段，然后在固相上依次将6片段缩合上去获得索马鲁肽的方法；专利CN109627317和CN106749613分别报道了三片段[(1-12)+(13-24)+(25-31)]和[(1-16)+(17-22)+(23-31)]固液相结合获取索马鲁肽的方法。然而，三片段或更多片段的合成方法，需要制备更多的肽片段使得操作更为繁琐。
因此，亟需提供一种工艺简易、成本更低、产率高的索马鲁肽的制备方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提供一种索马鲁肽的制备方法。通过对索马鲁肽结构分析，将索马鲁肽分成大小相近的两片段，每一片段的氨基酸数目均在20个以内。这样既充分利用了固相多肽合成的优势，又保证了每一段多肽合成的产率。
为此，本发明第一方面提供一种索马鲁肽的制备方法，所述制备方法包括：
(1)固相合成获得全保护第一肽段和全保护第二片段，其中，
所述全保护第一肽段的氨基酸序列为NH2-His(R1)-Aib-Glu(R2)-Gly-Thr(R3)-Phe-Thr(R3)-Ser(R3)-Asp(R2)-Val-Ser(R3)-Ser(R3)-Tyr(R3)-Leu-Glu(R2)-Gly-Gln(R1)-Ala-CONHNH2；
所述全保护第二肽段的氨基酸序列为NH2-Cys(R1)-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(R2)-Otc(R2)]-Glu(R2)-Phe-Ile-Ala-Trp(R4)-Leu-Val-Arg(R5)-Gly-Arg(R5)-Gly-COOH；
其中，R1选自Trt、Mtt中的任意一种；
R2选自OtBu、pNB、Dmab、Allyl中的任意一种；
R3选自tBu、Trt、Dmab中的任意一种；
R4选自Boc、Mts、Alloc中的任意一种；
R5选自Pbf、bis-Boc、tfa、Alloc中的任意一种；
(2)切割所述全保护第一肽段和全保护第二肽段获得第一肽段和第二肽段，其中，
所述第一肽段的氨基酸序列为：
NH2-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-CONHNH2；
所述第二肽段的氨基酸序列为：
NH2-Cys-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu-Otc]-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH；
(3)将所述第一肽段、所述第二肽段混合，发生缩合反应，以便获得索马鲁肽中间体；
(4)对所述索马鲁肽中间体进行脱硫反应，得到脱硫液，获得索马鲁肽粗品；
(5)纯化索马鲁肽粗品，获得索马鲁肽纯品。
固相多肽合成具有操作简便，可机械化流程化的优势，而液相合成具有成本低，可规模化的优势。将固相合成和液相合成结合，发挥其各自的优势，在工业化生产中具有重要的意义。目前已报道的使用固液相策略的专利中，多采用全保护的三片段或更多片段的方法。全保护片段由于溶解性较差，使得难于操作，影响连接产率。
本发明提供了一种索马鲁肽的制备方法，该方法将索马鲁肽分成大小相近的两个片段，每一片段的氨基酸数目均在20个以内，对两个肽片段进行缩合反应，以制备索马鲁肽。这样既充分利用了固相多肽合成的优势，又保证了每一段多肽合成的产率。其中第一肽段构建了C端酰肼片段，第二肽段构建了N端Cys片段，实现在水相体系中，两片段的选择性连接，最后经过脱硫处理，获得索马鲁肽。该方法解决了全保护肽片段的溶解性问题，实现了在水相体系中的两片段高效连接，既保证了产物的纯度、产率，又节省操作步骤，降低了成本。
根据本发明的实施例，步骤(1)进一步包括将保护基CONHNH2预先构建于固相合成所述第一肽段时所使用的树脂中。其中所述保护基的后续活化过程及肽段的连接过程均不受侧链基团的任何影响，具有极好的正交性和后续多肽C端硫酯的高效获得性。
根据本发明的实施例，所述树脂包括选自2-Cl-Trityl resin、wang resin或SASRIN resin。
根据本发明的实施例，步骤(1)进一步包括利用偶联试剂将氨基酸偶联到固相合成目标肽段时所使用的树脂。
根据本发明的实施例，所述偶联试剂独立地选自DIC、EDCI、HATU、HCTU、PyAOP、PyBOP中的至少一种。
根据本发明的实施例，步骤(2)进一步包括利用切割试剂切割所述全保护第一肽段和全保护第二肽段，所述切割试剂包括TFA、EDT、TIPS和水。
根据本发明的实施例，所述切割试剂中TFA、EDT、H2O和TIPS的体积比为(85-97):(1-5):(1-5):(1-5)。由此保证切割效果。
根据本发明的实施例，步骤(3)进一步包括在所述第一肽段、所述第二肽段混合前，对所述第一肽段的C端进行活化处理。由此进一步提升缩合效率。
根据本发明的实施例，所述活化处理包括分别利用活化试剂和巯基试剂A对所述第一肽段的C端进行活化处理。
根据本发明的实施例，所述活化试剂包括亚硝酸盐。具体可选择亚硝酸钠、亚硝酸钾等亚硝酸盐，其可将C端酰肼基团转化为酰基叠氮基团。
根据本发明的实施例，所述利用活化试剂对所述第一肽段的C端进行活化处理的时间为5-60min。
根据本发明的实施例，所述巯基试剂A包括选自MPAA、MESNa中的至少一种。其可所述巯基试剂A可使酰基叠氮基团转化为酰基硫酯。
根据本发明的实施例，所述利用巯基试剂A对所述第一肽段的C端进行活化处理的时间为5-60min。
根据本发明的实施例，步骤(3)中所述第一肽段和第二肽段的摩尔比为1:(1-2)。
根据本发明的实施例，所述缩合反应的时间为0.5-12h。
根据本发明的实施例，步骤(4)进一步包括利用脱硫试剂对所述索马鲁肽中间体进行脱硫反应。
根据本发明的实施例，所述脱硫试剂包括引发剂、还原试剂和巯基试剂B。
根据本发明的实施例，所述引发剂包括选自VA044或四乙基硼酸钠。
根据本发明的实施例，所述还原试剂包括选自TCEP或DTT。
根据本发明的实施例，所述巯基试剂B包括选自MESNa、tBuSH和MTG中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述索马鲁肽中间体、所述还原试剂、所述巯基试剂B与所述引发剂的摩尔比为1:(100-250):(10-100):(5-50)。
根据本发明的实施例，步骤(5)进一步包括利用高效液相色谱法对所述索马鲁肽粗品进行纯化。
本发明相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)将固相合成和液相合成结合，既充分利用了两种合成方式的优势，又保证了每一段多肽合成的产率；
(2)通过构建C端酰肼片段与N端Cys片段，实现在水相体系中，两片段的选择性连接，最后经过脱硫处理，获得索马鲁肽；
(3)该方法解决了全保护肽片段的溶解性问题，实现了在水相体系中的两片段高效连接，且产物纯度较高，仅通过一次纯化就可得到99％以上纯度。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了本发明实施例1中索马鲁肽第一肽段粗品的色谱图；
图2显示了本发明实施例2中索马鲁肽第二肽段粗品的色谱图；
图3显示了本发明实施例3中索马鲁肽中间体的色谱图；
图4显示了本发明实施例3中索马鲁肽中间体的质谱图；
图5显示了本发明实施例4中索马鲁肽中间体进行脱硫反应的色谱图；
图6显示了本发明实施例4中索马鲁肽纯品的色谱图；
图7显示了本发明实施例4中索马鲁肽纯品的质谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
根据本发明的实施例，本发明提供一种索马鲁肽的制备方法，所述制备方法包括：
(1)固相合成获得全保护第一肽段和全保护第二片段，其中，
所述全保护第一肽段的氨基酸序列为NH2-His(R1)-Aib-Glu(R2)-Gly-Thr(R3)-Phe-Thr(R3)-Ser(R3)-Asp(R2)-Val-Ser(R3)-Ser(R3)-Tyr(R3)-Leu-Glu(R2)-Gly-Gln(R1)-Ala-CONHNH2；
所述全保护第二肽段的氨基酸序列为NH2-Cys(R1)-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(R2)-Otc(R2)]-Glu(R2)-Phe-Ile-Ala-Trp(R4)-Leu-Val-Arg(R5)-Gly-Arg(R5)-Gly-COOH；
其中，R1选自Trt、Mtt中的任意一种；
R2选自OtBu、pNB、Dmab、Allyl中的任意一种；
R3选自tBu、Trt、Dmab中的任意一种；
R4选自Boc、Mts、Alloc中的任意一种；
R5选自Pbf、bis-Boc、tfa、Alloc中的任意一种；
(2)切割所述全保护第一肽段和全保护第二肽段获得第一肽段和第二肽段，其中，
所述第一肽段的氨基酸序列为：
NH2-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-CONHNH2；
所述第二肽段的氨基酸序列为：
NH2-Cys-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu-Otc]-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH；
(3)将所述第一肽段、所述第二肽段混合，发生缩合反应，以便获得索马鲁肽中间体；
(4)对所述索马鲁肽中间体进行脱硫反应，得到脱硫液，获得索马鲁肽粗品；
(5)纯化索马鲁肽粗品，获得索马鲁肽纯品。
本发明将索马鲁肽分成大小相近的两个片段，每一片段的氨基酸数目均在20个以内，并分别构建C端酰肼片段与N端Cys片段，后通过缩合反应以及脱硫反应，得到索马鲁肽。其将固相合成和液相合成结合，既发挥其各自的优势，又解决了全保护肽片段的溶解性问题，实现了在水相体系中的两片段高效连接，既保证了产物的纯度、产率，又节省操作步骤，降低了成本。
根据本发明的具体的实施例，第一肽段和第二肽段的合成方法为本领域常规方法，并不限于下述方法。
根据本发明的具体的实施例，固相合成获得第一肽段的步骤如下：
1)肼树脂的构建。使用DMF/DCM溶胀树脂，树脂可以是2-Cl-Trityl resin、wangresin或SASRIN resin，添加Fmoc-NHNH2和DIEA(N-N-二异丙基乙胺)到上述树脂中，反应2-24小时后，抽干反应液，清洗树脂，可获得肼树脂；
2)按照固相多肽合成的方法，根据第一肽段的序列，依次将：Fmoc-Ala-COOH、Fmoc-Gln(R1)-COOH、Fmoc-Gly-COOH、Fmoc-Glu(R2)-COOH、Fmoc-Leu-COOH、Fmoc-Tyr(R3)-COOH、Fmoc-Ser(R3)-COOH、Fmoc-Ser(R3)-COOH、Fmoc-Val-COOH、Fmoc-Asp(R2)-COOH、Fmoc-Ser(R3)-COOH、Fmoc-Thr(R3)-COOH、Fmoc-Phe-COOH、Fmoc-Thr(R3)-COOH、Fmoc-Gly-COOH、Fmoc-Glu(R2)-COOH、Fmoc-Aib-COOH、Fmoc-His(R1)-COOH逐个偶联到上述树脂上，得到全保护的索马鲁肽第一肽片段。氨基酸偶联过程中使用的偶联试剂选自DIC、EDCI、HATU、HCTU、PyAOP、PyBOP中的至少一种；
3)向全保护的索马鲁肽第一肽段树脂中，加入切割试剂，室温切割2-3小时，收集切割液，旋蒸去除液体，得到索马鲁肽第一肽段。
其中切割试剂为(85-97％)TFA、(1-5％)EDT、(1-5％)H2O、(1-5％)TIPS的混合液。
根据本发明的具体的实施例，固相合成获得第二肽段的步骤如下：
1)使用DMF/DCM溶胀树脂，树脂可以是2-Cl-Trityl resin、wang resin或SASRINresin；
2)将Fmoc-Gly-COOH及DIEA加入到上述溶胀好的树脂中，反应2-12小时，投料比为树脂：Fmoc-Gly-COOH:DIEA＝1:(1-6):(2-12)；
3)按照固相多肽合成的方法，根据第二段肽的序列，依次将：Fmoc-Arg(R5)-COOH、Fmoc-Gly-COOH、Fmoc-Arg(R5)-COOH、Fmoc-Val-COOH、Fmoc-Leu-COOH、Fmoc-Trp(R4)-COOH、Fmoc-Ala-COOH、Fmoc-Ile-COOH、Fmoc-Phe-COOH、Fmoc-Glu(R2)-COOH、Fmoc-Lys(R6)-COOH、Boc-Cys(R1)-COOH逐个偶联到上述树脂上。氨基酸偶联过程中使用的偶联试剂选自DIC、EDCI、HATU、HCTU、PyAOP、PyBOP中的至少一种。其中R6可以是Alloc、ivDde、Dde、Mtt、Mmt中任一种；
4)脱除掉R6保护基，依次将Fmoc-AEEA-COOH、Fmoc-AEEA-COOH、Fmoc-γ-Glu(R2)-COOH和R2-Otc-COOH偶联到Lys侧链上，投料比为树脂：(Fmoc-AEEA-COOH/Fmoc-AEEA-COOH/Fmoc-γ-Glu(R2)-COOH/R2-Otc-COOH):偶联试剂＝1:(2-6):(2-6)。所述偶联试剂选自DIC、EDCI、HATU、HCTU、PyAOP、PyBOP中的至少一种；
5)向全保护的索马鲁肽第二肽段树脂中，加入切割试剂，室温切割2-3小时，收集切割液，旋蒸去除液体，得到索马鲁肽第二肽段。
其中切割试剂为(85-97％)TFA、(1-5％)EDT、(1-5％)H2O、(1-5％)TIPS的混合液。
根据本发明的具体的实施例，索马鲁肽的合成与纯化过程如下：
1)将固相合成的第一肽段溶于含盐酸胍的pH3.0左右的磷酸缓冲液中，冰盐浴至零下10℃，加入亚硝酸钠溶液进行C端活化，活化时间为5-60min；
2)待活化完成后，加入巯基试剂，并调pH至5.0左右，室温反应5-60min；
3)待反应完后，将固相合成的第二肽段加入到上述溶液中进行肽片段的连接，反应时间为0.5-12小时；
4)反应结束后，纯化冻干得到索马鲁肽中间体；
5)将索马鲁肽中间体溶于含盐酸胍的磷酸盐缓冲液中，加入还原试剂、巯基试剂和脱硫试剂，并调节pH至6.5后在30-45℃条件下进行脱硫反应。其中，还原试剂可选TCEP；巯基试剂可选MESNa或tBuSH；脱硫试剂可选VA044。可选摩尔比为索马鲁肽中间体：还原试剂：巯基试剂：脱硫试剂＝1：250：100：50；
6)待脱硫结束后，使用高效液相色谱进行一次分离纯化冻干，获得索马鲁肽纯品。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1索马鲁肽第一肽段的合成
采用以下方法合成第一肽段：
NH2-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-CONHNH2
1)称取5g 0.43mmoL/g的2-Cl-(Trt)-Cl树脂于合成管内，采用DMF/DCM(1:1)溶胀树脂20min，之后抽干，用DMF、DCM、DMF各洗两遍。称取含有1g的Fmoc-NHNH2的DMF溶液，加入到含有树脂的合成管内，添加DMF至溶液没过树脂。向合成管内加入1.4mL DIEA后，常温反应2小时，之后加入2mL甲醇继续反应1小时。反应结束后，抽干反应液，用DMF、DCM、DMF、甲醇、乙醚各洗两遍，真空泵抽干，获得干燥的2-Cl-trityl-NHNH-Fmoc resin，测得树脂替代值为0.35mmoL/g，放置于-20℃冰箱，保存待用；
2)称取2-Cl-trityl-NHNH-Fmoc resin(0.35mmol/g，0.72g，0.25mmol)置于反应管中，加入50mL DMF/DCM，溶胀树脂1小时。抽干树脂，加入15mL 20％哌啶/DMF进行Fmoc的脱除。脱除反应进行两次，每次15分钟。使用DMF和DCM洗涤脱除反应后的树脂。称量Fmoc-Ala-OH(0.31g,1mmol)、DIC(0.19mL，1.25mmol)和Oxyma(0.17g,1.25mmol)溶于10mL DMF中，混匀后加入上述洗涤干净的树脂，室温反应2小时，进行氨基酸的缩合。根据索马鲁肽第一肽段的氨基酸序列，依次偶联Fmoc-Gln(Trt)-COOH、Fmoc-Gly-COOH、Fmoc-Glu(OtBu)-COOH、Fmoc-Leu-COOH、Fmoc-Tyr(tBu)-COOH、Fmoc-Ser(tBu)-COOH、Fmoc-Ser(tBu)-COOH、Fmoc-Val-COOH、Fmoc-Asp(OtBu)-COOH、Fmoc-Ser(tBu)-COOH、Fmoc-Thr(tBu)-COOH、Fmoc-Phe-COOH、Fmoc-Thr(tBu)-COOH、Fmoc-Gly-COOH、Fmoc-Glu(OtBu)-COOH、Fmoc-Aib-COOH、Boc-His(Trt)-COOH。每一次偶联过程均包括Fmoc的脱除、树脂的洗涤和氨基酸的缩合。最后使用甲醇洗涤树脂，风干后获得全保护索马鲁肽第一肽段树脂；
3)将上述全保护索马鲁肽第一肽段树脂置于反应管中，向其加入10mL切割试剂，包括87.5％三氟乙酸、5％H2O、5％TIPS和2.5％EDT，室温反应2小时。抽滤，收集全保护切割液。旋蒸去除切割液后，乙醚沉淀，沉淀干燥后获得索马鲁肽第一肽段，图1为其色谱图。高效液相色谱纯化冻干后获得375mg纯肽。
实施例2索马鲁肽第二肽段的合成
采用以下方法合成第二肽段：
NH2-Cys(Trt)-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(OtBu)-Otc(OtBu)]-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-COOH
1)称取2-Cl-Trityl resin(0.43mmol/g,2.3g，1mmol)置于反应管中，加入100mLDMF/DCM，溶胀树脂1小时。称取Fmoc-Gly-OH(1.18g,4mmol)溶于20mL DMF中并加入DIEA(1.3mL，8mmol)，混匀后加入上述溶胀好的树脂中，室温反应12小时。反应结束后，加入5mL甲醇。继续反应30min后，抽干树脂，使用DMF和DCM洗涤树脂，最后使用甲醇收缩树脂，获得干燥的Fmoc-Gly-2-Cl-trityl resin，测得树脂替代值为0.39mmol/g；
2)称取Fmoc-Gly-2-Cl-trityl resin(0.39mmol/g,0.64g，0.25mmol)置于反应管中，加入50mL DMF/DCM，溶胀树脂1小时。抽干树脂，加入10mL 20％哌啶/DMF进行Fmoc的脱除。脱除反应进行两次，每次15分钟。使用DMF和DCM洗涤脱除反应后的树脂。称量Fmoc-Arg(Pbf)-OH(0.64g，1mmol)、DIC(0.19mL，1.25mmol)和Oxyma(0.17g，1.25mmol)溶于10mL DMF中，混匀后加入上述洗涤干净的树脂，室温反应2小时，进行氨基酸的缩合。根据索马鲁肽第二段肽的氨基酸序列，依次偶联Fmoc-Gly-COOH、Fmoc-Arg(Pbf)-COOH、Fmoc-Val-COOH、Fmoc-Leu-COOH、Fmoc-Trp(Boc)-COOH、Fmoc-Ala-COOH、Fmoc-Ile-COOH、Fmoc-Phe-COOH、Fmoc-Glu(OtBu)-COOH、Fmoc-Lys(Alloc)-COOH、Boc-Cys(Trt)-COOH。除最后Boc-Cys(Trt)-COOH氨基酸外，每一次偶联过程均包括Fmoc的脱除、树脂的洗涤和氨基酸的缩合；
3)待Boc-Cys(Trt)-COOH氨基酸缩合完毕后，抽干树脂，使用DMF洗涤树脂四次后使用DCM洗涤树脂2次。称量四三苯基膦钯(0.057g，0.05mmol)和苯硅烷(3.1mL，25mmol)加入到上述DCM洗后的树脂中，补加DCM至没过树脂，进行2次脱Alloc保护基，每次反应时间为2小时。待反应结束后，使用DMF和DCM进行树脂的洗涤。依次将Fmoc-AEEA-COOH、Fmoc-AEEA-COOH、Fmoc-γ-Glu(OtBu)-COOH和OtBu-Otc-COOH缩合到Lys侧链上。待缩合结束后，使用DMF和DCM洗涤脱除反应后的树脂。最后使用甲醇洗涤树脂，风干后获得全保护索马鲁肽第二肽段树脂；
4)将上述全保护索马鲁肽第二肽段树脂置于反应管中，向其加入10mL切割试剂，包含87.5％三氟乙酸、5％H2O、5％TIPS和2.5％EDT溶液，室温反应2小时。抽滤，收集全保护切割液。旋蒸去除切割液后，乙醚沉淀，沉淀干燥后获得索马鲁肽第二肽段，图2为其色谱图。高效液相色谱纯化冻干后获得420mg纯肽。
实施例3索马鲁肽中间体的获得
1)称取实施例1制备的第一肽段(1mM，9.6mg)溶于4.5mL pH为3.0的盐酸胍溶液中，将上述反应管放入冰盐浴中，使其降温至-10℃左右。加入500μL 50mM的亚硝酸钠溶液，冰浴条件下反应30分钟。反应结束后，加入100mM、84mg MPAA，调pH至5.0，室温反应30分钟后，分析型色谱进样监测转化效率。待完全转化完后，加入1mM(11.2mg)实施例2制备的第二肽段。分析型色谱监测反应进程，结果见图3，其中15min处对应索马鲁肽中间体。待完全转化为索马鲁肽中间体NH2-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Cys-Lys[AE EA-AEEA-γ-Glu-Otc]-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH后，半制备型色谱(Vydac C8)进行分离纯化。经冻干后获得18.5mg产物，分离产率为89.3％，图4为其质谱图。
实施例4索马鲁肽中间体的脱硫反应
称取16.5mg实施3制备的索马鲁肽中间体溶于盐酸胍溶液中，加入250mM TCEP、100mM MESNa和50mM VA044加入到上述溶液中，至终体积为4mL，调节pH至6.5左右。在40℃下反应12小时，高效液相色谱监测反应进程，如图5所示。待完全反应后，使用高效液相色谱对脱硫反应进行一步纯化。采用0.1％TFA-水/乙腈体系作为流动相体系。收集目的峰纯度在99％以上的馏分，冷冻干燥获得14.2mg索马鲁肽纯品。其色谱图和质谱图分别如图6、图7所示，表明通过本发明提供的制备方法，可获得的纯品索马鲁肽具有99％以上的纯度，图7中的质谱结果也表明了合成索马鲁肽的正确性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (9)
1.一种索马鲁肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
(1)固相合成获得全保护第一肽段和全保护第二片段，其中，
所述全保护第一肽段的氨基酸序列为NH2-His(R1)-Aib-Glu(R2)-Gly-Thr(R3)-Phe-Thr(R3)-Ser(R3)-Asp(R2)-Val-Ser(R3)-Ser(R3)-Ty r(R3)-Leu-Glu(R2)-Gly-Gln(R1)-Ala-CONHNH2；
所述全保护第二肽段的氨基酸序列为NH2-Cys(R1)-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu(R2)-Otc(R2)]-Glu(R2)-Phe-Ile-Ala-Trp(R4)-Leu-Val-Ar g(R5)-Gly-Arg(R5)-Gly-COOH；
其中，R1选自Trt、Mtt中的任意一种；
R2选自OtBu、pNB、Dmab、Allyl中的任意一种；
R3选自tBu、Trt、Dmab中的任意一种；
R4选自Boc、Mts、Alloc中的任意一种；
R5选自Pbf、bis-Boc、tfa、Alloc中的任意一种；
(2)切割所述全保护第一肽段和全保护第二肽段获得第一肽段和第二肽段，其中，
所述第一肽段的氨基酸序列为：
NH2-His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-CONHNH2；
所述第二肽段的氨基酸序列为：
NH2-Cys-Lys[AEEA-AEEA-γ-Glu-Otc]-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH；
(3)将所述第一肽段、所述第二肽段混合，发生缩合反应，以便获得索马鲁肽中间体；
(4)对所述索马鲁肽中间体进行脱硫反应，得到脱硫液，获得索马鲁肽粗品；
(5)纯化索马鲁肽粗品，获得索马鲁肽纯品。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)进一步包括将保护基CONHNH2预先构建于固相合成所述第一肽段时所使用的树脂中。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述树脂包括选自2-Cl-Tritylresin、wang resin或SASRIN resin。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)进一步包括利用偶联试剂将氨基酸偶联到固相合成目标肽段时所使用的树脂；
任选地，所述偶联试剂独立地选自DIC、EDCI、HATU、HCTU、PyAOP、PyBOP中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括利用切割试剂切割所述全保护第一肽段和全保护第二肽段，所述切割试剂包括TFA、EDT、TIPS和水；
任选地，所述切割试剂中TFA、EDT、H2O和TIPS的体积比为(85-97):(1-5):(1-5):(1-5)。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)进一步包括在所述第一肽段、所述第二肽段混合前，对所述第一肽段的C端进行活化处理；
任选地，所述活化处理包括分别利用活化试剂和巯基试剂A对所述第一肽段的C端进行活化处理；
任选地，所述活化试剂包括亚硝酸盐；
任选地，所述利用活化试剂对所述第一肽段的C端进行活化处理的时间为5-60min；
任选地，所述巯基试剂A包括选自MPAA、MESNa中的至少一种；
任选地，所述利用巯基试剂A对所述第一肽段的C端进行活化处理的时间为5-60min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述第一肽段和第二肽段的摩尔比为1:(1-2)；
任选地，所述缩合反应的时间为0.5-12h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)进一步包括利用脱硫试剂对所述索马鲁肽中间体进行脱硫反应；
任选地，所述脱硫试剂包括引发剂、还原试剂和巯基试剂B；
任选地，所述引发剂包括选自VA044或四乙基硼酸钠；
任选地，所述还原试剂包括选自TCEP或DTT；
任选地，所述巯基试剂B包括选自MESNa、tBuSH和MTG中的至少一种；
任选地，所述索马鲁肽中间体、所述还原试剂、所述巯基试剂B与所述引发剂的摩尔比为1:(100-250):(10-100):(5-50)。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)进一步包括利用高效液相色谱法对所述索马鲁肽粗品进行纯化。
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