CN117624277A - 一种咸蛋清蛋白的回收方法 - Google Patents

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滕建文
刘钊彬
傅佳慧
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Abstract

本发明属于副产物回收加工领域，具体为一种咸蛋清蛋白的回收方法。本发明在温和的热环境下通过机械剪切和EGCG的作用，诱导咸蛋清中的蛋白质发生非自然热聚集，随后通过水洗离心的方式将蛋清蛋白/EGCG复合物与盐离子相互分离。本发明能实现良好的脱盐率与蛋白回收率，具有连续化、操作简便、效果稳定等优点，是一种可持续，环境友好和可操作的从咸蛋清中分离蛋白质的策略，具有潜在商业应用价值。所制备出的脱盐蛋清蛋白/EGCG复合物具有更好的物理特性和体外抗氧化活性，可以作为良好的功能性蛋白配料用于高质量的食品添加剂、保健品、药物等。

Description

一种咸蛋清蛋白的回收方法
技术领域
本发明属于副产物回收加工领域，具体涉及一种咸蛋清蛋白的回收方法。
背景技术
咸蛋清作为咸鸭蛋黄生产加工的副产物，由于咸蛋清中盐含量高达7～10％，不易被直接应用在食品中，且高含盐环境下咸蛋清中蛋白的功能性质下降。过去，工厂对于咸蛋清的处理方式大都为直接废弃，从而造成了蛋白资源的浪费和环境污染。近年来，随着环境政策对副产物管理的限制不断增加，咸蛋清中蛋白的脱盐与回收成为了亟待解决的问题。此外，咸蛋清中蛋白的潜在价值得到了更广泛的认识，特别是对其中多种类功能蛋白质的估价认可。咸蛋清中蛋白如何在清洁温和的条件下被高效脱盐与回收利用引起了研究者们的广泛关注。
正如许多研究者所强调的，能够高效脱盐将会有助于实现咸蛋清的高品质、高价值和多领域的应用。现阶段，咸蛋清脱盐方法主要分为外加电场的膜分离技术，如超滤、电渗析和离子交换；以热诱导凝胶为代表的沉淀脱盐技术；以及酶法脱盐技术。遗憾的是，膜分离和酶法脱盐技术由于成本高、水资源有限、蛋白质流失严重等原因难以进一步产业化，而热诱导沉淀脱盐技术由于热处理强度过大，往往会使咸蛋清中蛋白严重变性，导致其功能特性丧失，但由于其脱盐工艺简单、成本低廉，其仍是业界推崇的主流脱盐方法。因此，建立一种温和、高效的脱盐方法来回收和保护蛋白功能，仍然是海鸭蛋制品行业最紧迫的挑战之一。
脱盐工艺开发的难题背后的核心科学问题在于蛋白的高效聚集控制。热强度的上升确实能有效促进聚集，但当温度过高或持续时间过长时，尺寸过大的致密颗粒，或无序凝胶结构的恶化可能会对蛋白质的物理性质造成不可逆的负面影响，从而降低其加工性和适用性，此外，高温还可能导致蛋白质氧化和降解，甚至产生有害产物。而热强度的下降又会大幅降低蛋清蛋白的聚集效率。蛋白质凝胶化过程中的多个阶段中复杂的分子间相互作用共同决定了凝胶的形成。通常早在凝胶形成的初期，如果即将参与聚集的蛋白初始作用力被改变，则参与骨架形成的蛋白种类，以及低聚体的密度、大小、形态等便随之发生变化。目前的主流观点认为蛋清的凝胶化是一段在早期以卵粘蛋白为主的蛋白相互作用形成的蛋白微聚集体，后期这种蛋白微聚集体再彼此紧密靠近排列形成蛋白凝胶网络的过程。而这种蛋白之间的相互作用会受到各种外界因素的影响，进而改变蛋白微聚集体中的蛋白丰度、密度，最终影响到脱盐率、回收率和整体凝胶的性质。
近年来许多研究人员报告称，热诱导中良性聚集体的控制可以通过温度点调节、剪切力设置以及添加类似食品伴侣的成分来实现。譬如工厂往往通过高温高压剪切使材料充分熟化，较高的剪切力和定向流动容易促使蛋白质分子链呈线性，凝胶网络结构多孔化，纤维感增强。此外，以往的研究表明，多酚类化合物可与自组装蛋白质相互作用，甚至诱导蛋白质的聚集行为，如原花青素已被证明通过氢键和疏水相互作用来沉淀谷蛋白，EGCG已被证明可以从大豆乳清废水诱导蛋白形成不易溶解的聚集物等。EGCG指表没食子儿茶素没食子酸酯，是绿茶中的主要儿茶素，其分子量为458.37，在多酚类物质中属于较大型。其带有8个游离酚羟基，亲水性强，能显著提高食品的抗氧化能力，是茶叶中的重要生物活性成分。虽然EGCG已被广泛用于与蛋白质发生共价或非共价相互作用，以调节蛋白质聚合体的结构和功能特性，但针对其对咸鸭蛋清中蛋白的调控特性的应用化例子较少。因此，在温和的温度下应用EGCG，通过与咸蛋清中的蛋白质共沉淀来改善蛋白质的物理、结构性质，并控制剪切力导致盐离子从聚集体中释放，可能是一种新的可行的回收方法。但是，在咸蛋清这种复杂的天然蛋白体系下EGCG调控蛋清中蛋白结构的变化规律尚不清楚，此外，EGCG与机械剪切在脱盐、诱导沉淀、改造蛋白质功能与结构上的协同规律研究较为缺乏。
本研究的主要目的在于利用EGCG与咸蛋清中蛋白的相互作用，在考察热处理和机械剪切力强度后，评估和建立一种通过EGCG和剪切力协同作用来从咸蛋清中脱盐与回收蛋白质的最佳策略。该工艺清洁、温和，降低了蛋清蛋白性能的恶化。该工艺为咸蛋清的综合利用提供了新思路，可望在蛋制品行业推广应用。
发明内容
本发明的目的在于解决现有咸蛋清脱盐工艺成本过高、蛋白损耗大、蛋白功能活性容易降低的问题，且克服现有技术中成本、脱盐率、蛋白回收率、蛋白物理特性与抗氧化活性难以兼顾的难点。本发明提供一种新型的咸蛋清蛋白脱盐回收工艺，有效降低成本并提高了脱盐率和蛋白回收率，同时所脱盐回收的产物是EGCG与蛋清蛋白相互作用的复合物，具有更高抗氧化活性。
本发明的技术方案为：
一种咸蛋清蛋白的回收方法，包括以下步骤：
S1.将咸蛋清用水稀释，得到咸蛋清稀释液；
S2.将步骤S1的咸蛋清稀释液与EGCG水溶液混合，得到混合液；
S3.步骤S2的混合液经摇床孵育，而后通过热诱导结合机械剪切力辅助的方式进行共聚集，得到水凝胶；
S4.步骤S3的水凝胶通过离心水洗的方式分离盐离子与蛋白，收集底部沉淀，将所述沉淀进行冷冻干燥，即得到所述咸蛋清蛋白。
进一步地，步骤S1为，咸蛋清稀释前，先进行超声处理，超声处理后的咸蛋清加入脱气超纯水稀释，于室温下搅拌充分水化，过滤除脂，得到咸蛋清稀释液。
进一步地，所述超声处理为：超声时间为30min，超声频率为40KHz；所述搅拌为：搅拌速率为100r/min，搅拌3h；所述咸蛋清稀释液中，咸蛋清与水的体积比为1：4。
进一步地，步骤S2为，将步骤S1的咸蛋清稀释液与质量浓度为0.5％的EGCG水溶液混合，置于容器中，抽真空至7Pa，充氮气2～3min，得到混合液。
进一步地，步骤S2的混合液中，EGCG和蛋白的质量比为1：800～1：40。
进一步地，步骤S3中，所述热诱导结合机械剪切力辅助的方式为于室温恒温条件下，施加速率为120～160ft/min的剪切力，而后升温至70～95℃，并在该温度保持5～15min，随后迅速降至室温。
进一步地，步骤S3中，所述热诱导结合机械剪切力辅助的方式为于30℃恒温1min，施加速率为145ft/min的剪切力，而后以5℃/min的升温速率升温94℃，并在该温度保持15min，随后迅速降至室温。
进一步地，步骤S4中，所述离心水洗为置于冷冻离心机中进行离心水洗脱盐，离心时间为10min，离心转速为10000r/min。
进一步地，步骤S4中，所述冷冻干燥条件为：预冻时冷阱温度-20℃，后升至-50℃冷冻干燥时间为48h，冷冻干燥真空度为0.5～1mbar。
本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了一种新型的咸蛋清蛋白脱盐回收工艺，可实现低成本连续化生产，工艺脱盐率高，水和蛋白损耗低。
(2)本发明的技术方案中，将EGCG作为聚集调控剂和功能保护剂添加至咸蛋清中，控制蛋清蛋白聚集形成具有利于脱盐又兼顾稳定性的空间网络结构，同时降低在热诱导过程中蛋白的物理特性的损失，并显著提高产物的抗氧化活性。
(3)本发明工艺未使用任何化学合成物质，温和、安全，操作简单。
附图说明
图1为热处理温度、热处理时间、剪切转速和EGCG浓度的脱盐率和蛋白回收率的影响结果图。
图2为热处理温度、热处理时间、剪切转速和EGCG浓度对脱盐回收产物的溶解度的影响结果图。
图3为热处理温度、热处理时间、剪切转速和EGCG浓度对脱盐回收产物的抗氧化活性的影响结果图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中涉及到的咸蛋清，来自产自广西北海某咸鸭蛋腌制企业的加工副产物，其中蛋白含量为9～11％，盐含量为5～7％；EGCG，购于上海源叶生物科技有限公司。
一种咸蛋清蛋白的回收方法，包括以下步骤：
S1.将咸蛋清用水稀释，得到咸蛋清稀释液；
S2.将步骤S1的咸蛋清稀释液与EGCG水溶液混合，得到混合液；
S3.步骤S2的混合液经摇床孵育，而后通过热诱导结合机械剪切力辅助的方式进行共聚集，得到水凝胶；
S4.步骤S3的水凝胶通过离心水洗的方式分离盐离子与蛋白，收集底部沉淀，将所述沉淀进行冷冻干燥，即得到所述咸蛋清蛋白。
上述咸蛋清蛋白的回收方法中参数的获取：
试验一、热处理温度对蛋白产物脱盐率，蛋白回收率，物理性质及抗氧化活性的影响。
步骤如下：
(1)将副产物咸蛋清超声处理30min，超声频率为40KHz；
(2)将超声后的咸蛋清按比例为1:4(v/v)分散于脱气超纯水中，后于电子搅拌机室温下搅拌3h充分水化，搅拌速率为100r/min，得到咸蛋清稀释液；
(3)将得到咸蛋清稀释液用滤布过滤；
(4)过滤后收集的咸蛋清稀释液立即进行热诱导凝胶，通过水浴温度可控式机械剪切装置-冷冻离心机联用平台实现热诱导凝胶程序，在开始测定前于30℃恒温1min，不施加剪切，以5℃/min的升温速率分别升温至70、80、90、95、100℃，并在该温度保持5min，后迅速降至室温；
(5)咸蛋清经热诱导后，进行两次离心水洗脱盐，离心转速为10000r/min，离心时间为10min，收集最终沉淀；
(6)将沉淀冷冻干燥即得脱盐蛋清蛋白冻干粉，冷冻干燥条件为：预冻时冷冻温度-20℃，后升至-50℃，冷冻干燥时间为48h，冷冻干燥真空度为0.5～1mbar。
结果如图1所示：图1展示了热处理温度对蛋白回收率与脱盐率的显著性影响，在95℃前蛋白回收率与温度呈正相关关系，而95℃后出现热分解现象，蛋白回收率显著减小。脱盐率则随温度的增加呈先下降后上升的趋势，其在80℃时降低至最低值。
试验二、热处理时间对蛋白产物脱盐率，蛋白回收率，物理性质及抗氧化活性的影响。
步骤如下：
(1)将副产物咸蛋清超声处理30min，超声频率为40KHz；
(2)将超声后的咸蛋清按比例为1:4(v/v)分散于脱气超纯水中，后于电子搅拌机室温下搅拌3h充分水化，搅拌速率为100r/min，得到咸蛋清稀释液；
(3)将得到咸蛋清稀释液用滤布过滤；
(4)过滤后收集的咸蛋清稀释液立即进行热诱导凝胶，通过水浴温度可控式机械剪切装置-冷冻离心机联用平台实现热诱导凝胶程序，在开始测定前于30℃恒温1min，不施加剪切，以5℃/min的升温速率升温至80℃，并在该温度分别保持2、3、5、10、15min，后迅速降至室温；
(5)咸蛋清经热诱导后，进行两次离心水洗脱盐，离心转速为10000r/min，离心时间为10min，收集最终沉淀；
(6)将沉淀冷冻干燥即得脱盐蛋清蛋白冻干粉，冷冻干燥条件为：预冻时冷阱温度-20℃，后升至-50℃，冷冻干燥时间为48h，冷冻干燥真空度为0.5-1mbar。
结果如图1所示：：图1展示了热处理时间对蛋白回收率与脱盐率的显著性影响，其中蛋白回收率在15min达到最高，此时脱盐率也保持在高理想值。然而其在5min时降低到最小值70.641±0.049％。据此推测，在80℃，5min的加热强度下，产物的脱盐率最为不理想，且此时的蛋白回收率仅在61.867±0.666％，因此适合使用此条件来进行剪切力辅助调控影响和EGCG辅助调控影响的对比探究。
试验三、机械剪切转速对蛋白产物脱盐率，蛋白回收率，物理性质及抗氧化活性的影响。
步骤如下：
(1)将副产物咸蛋清超声处理30min，超声频率为40KHz。
(2)将超声后的咸蛋清按比例为1:4(v/v)分散于脱气超纯水中，后于电子搅拌机室温下搅拌3h充分水化，搅拌速率为100r/min，得到咸蛋清稀释液；
(3)将得到咸蛋清稀释液用滤布过滤；
(4)过滤后收集的咸蛋清稀释液液立即进行热诱导凝胶，通过水浴温度可控式机械剪切装置-冷冻离心机联用平台实现热诱导凝胶程序，在开始测定前于30℃恒温1min，同时分别施加速率为40、80、120、160、200ft/min的剪切力，以5℃/min的升温速率升温80℃，并在该温度保持5min，后迅速降至室温；
(5)咸蛋清经热诱导后，进行两次离心水洗脱盐，离心转速为10000r/min，离心时间为10min，收集最终沉淀；
(6)将沉淀冷冻干燥即得脱盐蛋清蛋白冻干粉，冷冻干燥条件为：预冻时冷阱温度-20℃，后升至-50℃，冷冻干燥时间为48h，冷冻干燥真空度为0.5-1mbar。
结果如图1所示：剪切对脱盐率的影响程度大于蛋白质的回收率，回收率在120ft/min时达到最高值。另一方面，脱盐率在120ft/min时也达到了90.960±0.634％的最大值。在120～160ft/min之间可能存在更高的脱盐率点。
试验四、EGCG浓度，以及EGCG与剪切力协同下分别对蛋白产物脱盐率，蛋白回收率，物理性质及抗氧化活性的影响。
步骤如下：
(1)将副产物咸蛋清超声处理30min，超声频率为40KHz；
(2)将超声后的咸蛋清按比例为1:4(v/v)分散于脱气超纯水中，后于电子搅拌机室温下搅拌3h充分水化，搅拌速率为100r/min，得到咸蛋清稀释液；
(3)将得到咸蛋清稀释液用滤布过滤；
(4)将质量浓度为0.5％的EGCG溶液和咸蛋清稀释液按不同比例混合均匀，置于容器内，抽真空至7Pa，并充氮气2～3min(插入液面下充)后盖塞，分别得到EGCG和蛋白的质量比为1：800、1：400、1：200、1：100、1：40混合液；而后立即进行孵育，摇床环境为室温下1h，转速为150r/min；
(5)孵育后的混合液立即进行温和热诱导凝胶，通过水浴温度可控式机械剪切装置-冷冻离心机联用平台实现热诱导凝胶程序，在开始测定前于30℃恒温1min，分别进行不施加剪切和施加120ft/min剪切两个实验组，以5℃/min的升温速率升温80℃，并在该温度保持5min，后迅速降至室温；
(6)咸蛋清经热诱导后，进行两次离心水洗脱盐，离心转速为10000r/min，离心时间为10min，收集最终沉淀；
(7)将沉淀冷冻干燥即得脱盐蛋清蛋白冻干粉，冷冻干燥条件为：预冻时冷阱温度-20℃，后升至-50℃，冷冻干燥时间为48h，冷冻干燥真空度为0.5-1mbar。
结果如图1所示：低浓度的EGCG提高了蛋白质的回收率(最高为75.49±3.68％)，而脱盐率也受到EGCG的调节，脱盐率的变化趋势与蛋白质的回收率相同，在1：400时达到最大值81.568±0.140％，在1：200～1：400之间可能存在更高的脱盐率点。与试验三的机械剪切相比，本试验中，EGCG对咸蛋清中蛋白的回收促进效果更高，机械剪切则在提高脱盐率上更有优势。此外，图1中两条曲线则展示了在120ft/min时不同EGCG浓度下咸蛋清中蛋白回收率与脱盐率的变化情况，简而言之，剪切处理可以配合EGCG进一步提高脱盐与回收效率。比起单纯施加120ft/min剪切速率的对照组，在EGCG与剪切协同调节下蛋白回收率有进一步的提高，但会一定程度拉低剪切处理的脱盐效率。
工艺优化
选取热处理温度、热处理时间、剪切转速和EGCG浓度作为影响因素，以脱盐率为响应值，通过响应面模型试验优化得到预测的最佳工艺条件为：
(1)将副产物咸蛋清超声处理30min，超声频率为40KHz；
(2)将超声后的咸蛋清按比例为1:4(v/v)分散于脱气超纯水中，后于电子搅拌机室温下搅拌3h充分水化，搅拌速率为100r/min，得到咸蛋清稀释液；
(3)将得到咸蛋清稀释液用滤布过滤；
(4)将质量浓度为0.5％的EGCG溶液和咸蛋清稀释液按1：260的配比混合均匀，置于容器内，抽真空至7Pa，并充氮气2～3min(插入液面下充)后盖塞，得到混合液；而后立即进行孵育，摇床环境为室温下1h，转速为150r/min；
(5)孵育后的混合液立即进行热诱导凝胶，通过水浴温度可控式机械剪切装置-冷冻离心机联用平台实现热诱导凝胶程序，在开始测定前于30℃恒温1min，施加速率为145ft/min的剪切力，而后以5℃/min的升温速率升温94℃，并在该温度保持15min，随后迅速降至室温；
(6)咸蛋清经热诱导后，进行两次离心水洗脱盐，离心转速为10000r/min，离心时间为10min，收集最终沉淀；
(7)将沉淀冷冻干燥即得脱盐蛋清蛋白冻干粉，冷冻干燥条件为：预冻时冷阱温度-20℃，后升至-50℃，冷冻干燥时间为48h，冷冻干燥真空度为0.5-1mbar。
本实验采用优化后的工艺进行3组平行试验，结果如表1所示。比较得到的平均脱盐率为96.52％。与模型理论预测值间的相对偏差很小，验证三次后，得到三组脱盐率之间的相对误差为0.63％，小于10％，与理论值相对偏差十分接近，证明响应面得到的咸蛋清脱盐率最优实验条件是可行可靠的。
表1工艺优化得到的样品的脱盐率
性能测定
对上述试验一至试验四中制得的脱盐蛋清蛋白冻干粉或脱盐蛋清蛋白/EGCG复合物冻干粉的脱盐率、蛋白回收率、抗氧化性、EGCG复合率进行测定。
测试方法为：
一、蛋白回收率
采用凯氏定氮法评估脱盐蛋清蛋白冻干粉的蛋白回收率，冻干后称量冻干样的质量。取1g样品置于凯氏烧瓶中，加入6.4g混合催化剂(0.4g五水硫酸铜、6.0g硫酸钾)混匀，加入12ml硫酸和2粒玻璃珠，将凯氏烧瓶置于电炉上升温420℃下消煮4h。而后将消化至呈澄清透明的样品转移至自动凯氏定氮仪中进行测定。
蛋白回收率可以用以下公式计算：
式中：
N、N1为样品冻干样和咸蛋清稀释液冻干样的蛋白含量(％)；
W、W1为样品冻干样和咸蛋清稀释液冻干样的质量(g)。
二、脱盐率
对咸蛋清水洗离心后的上清液进行含盐量测定。首先，在加入超纯水(50ml)和滴加0.1MAgNO3之前，将1g的咸蛋清上清液样品转移到250ml的锥形烧瓶中，然后样品溶液被温和地煮沸10min，直到溶解得到透明的上清液，随后添加1ml的5％酪酸钾指示剂，然后用0.1MAgNO3溶液滴定，直至颜色永久呈橙黄色。NaCl含量计算如下：
式中：
c是硝酸银标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
V是样品定容体积，单位为毫升(ml)；
V1用于滴定的试样体积，单位为毫升(ml)；
V2空白试验消耗的硝酸银标准滴定溶液体积，单位为毫升(ml)；
V3滴定试液时消耗的硝酸银标准滴定溶液体积，单位为毫升(ml)；
m试样质量，单位为克(g)。
脱盐率可以用以下公式计算：
式中：
S1、S2为第一次、第二次上清液中的氯化物含量(％)。
M1、M2为第一次、第二次上清液的质量(g)。
S为咸蛋清稀释液中氯化物的含量，M为咸蛋清稀释液的质量(g)。
三、溶解度
冻干蛋白质首先分散在1％(w/v)的去离子水中，搅拌1h，然后水合过夜直至完全溶解。然后，将蛋白质在1300×g转速下离心30min。上清液中的蛋白质含量用Bradford法测定。溶解度用完全溶解在上清液中的蛋白质比例表示。
四、质构特性
使用配备P/35圆柱形探针的TPA纹理分析仪(TMS-PRO，美国FTC公司)测定硬度和回弹性。方法根据设计，并稍作修改。沉淀物被切割成约1x1x1.5cm3的立方体。TPA模型的参数如下：记录前速度为5.0mm/s，记录速度为1.0mm/s，记录后速度为5.0mm/s，压缩比为50％，触发点负载为0.98N。
五、抗氧化性
采用DPPH自由基和ABTS自由基法评估脱盐蛋清蛋白冻干粉的抗氧化性。
DPPH·清除能力测定：在等体积混合0.5mg/ml样品溶液和DPPH·乙醇溶液之前，用乙醇配制0.12mMDPPH醇溶液。混合后在避光环境中反应1h，随后使用UV-分光光度计在517nm处检测吸光值。
DPPH·自由基清除率可以用以下公式计算：
式中：
A0是空白样品吸光度(用超纯水替代样品加入DPPH·)；
A1是对照样品的吸光度(用乙醇替代DPPH·加入样品)；
A2是样品的吸光度。
ABTS+·清除能力测定：等体积混合7mMABTS+·溶液和2.45mM过硫酸钾溶液，室温避光反应12h，得到ABTS+·自由基溶液。使用前，将ABTS+·溶液用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释至OD734＝0.7±0.02。然后将500uL样液(10mg/ml)与3.5ml的ABTS+·溶液混合，避光反应6min，在734nm波长下测反应液吸光度(Ai)，空白组(Aj)为等体积pH7.4的PBS代替ABTS+·溶液，对照组(Av)为等体积pH7.4的磷酸盐缓冲液代替样品。
ABTS+·自由基清除率可以用以下公式计算：
结果显示
1、咸蛋清中蛋白本身的溶解度不高，仅为71.15±3.48％。这可能与蛋白长期暴露在过咸的环境中有关。试验一和试验二中热处理的强度极大地削弱了蛋白的溶解度，除70℃外，在所有温度下蛋白的溶解度都急剧下降，在80℃时达到最低，但随着温度的升高，溶解度又有所回升，这是由于大块蛋白质聚集体的再热降解所致。此外，随着加热时间的延长，蛋白质在5分钟后达到最低水平。在试验三和试验四中，蛋白质的溶解度随着试验三中剪切力施加和试验四中EGCG处理的应用而提高，当剪切力达到80和120ft/min，EGCG达到2.5和50μM/g蛋白质时，蛋白质的溶解度接近或超过40％。溶解度的提高可能与粒径的减小和蛋白质结构的变化有关(如图2所示)。
2、表2显示了不同处理后咸蛋清中蛋白凝胶的质构分析结果，其中包括硬度、内聚性、弹性、胶粘性和咀嚼性五个参数。对所有咸蛋清中蛋白凝胶的质构分析结果表明，试验四中，蛋白质浓度小于1：400的EGCG凝胶的硬度、胶粘性和咀嚼性明显高于除100℃,5min以外的其他凝胶，但随着EGCG浓度的升高，凝胶受到了不利影响，这可能是由于过量EGCG的屏蔽作用使得蛋白质间的吸引力减弱。对于试验一和试验二中在80～100℃下处理5min的凝胶组和在80℃下加热更长时间的凝胶组，其硬度和内聚性均高于一些剪切组，这表明热诱导凝胶的热变性可能会导致建立更多的蛋白质-蛋白质相互作用。试验三中过大的剪切力不利于形成稳定的凝胶，但试验三中适当的剪切力的施加(40～120ft/min)有利于赋予凝胶更好的弹性。
表2热处理温度、热处理时间、剪切转速和EGCG浓度对咸蛋清中蛋白凝胶质构的影响；(P<0.05)
3、从图3可以看出，相同浓度下的EGCG和Vc在DPPH·自由基清除能力上的表现没有显著差异，均大于95％。未处理咸蛋清本身也具有一定的清除能力，随着热处理强度的增加，试验一和试验二中DPPH·和ABTS+·自由基清除能力显著降低。
试验三中，剪切速率40～160ft/min下DPPH·自由基清除能力与未处理咸蛋清相比没有显著差异，而200ft/min下则明显下降至15.775±3.057％。相似地，剪切速率40～160ft/min下咸蛋清中蛋白回收产物的ABTS+·自由基清除能力整体比未处理咸蛋清高，但是随着剪切速率的增加，其清除活性仍旧被严重削弱。这表明合适的剪切速率可以有效提高蛋白回收产物的自由基清除活性，但是剪切速率不宜超过160ft/min。
试验四中，不同EGCG比例下的蛋白回收产物的DPPH·自由基清除能力均低于0.5％的EGCG和Vc，但不同EGCG比例下的蛋白回收产物的DPPH·清除活性显著高于单独的未处理咸蛋清，分别在33.155±0.116％，35.701±0.291％，40.665±1.302％，50.279±0.012％，42.944±1.581％。
这一结果表明，EGCG对蛋白回收产物的DPPH·清除活性做出了贡献，相比于未处理咸蛋清，各浓度下的EGCG均有效地保护甚至提升了蛋白回收产物的DPPH·清除活性，这种效果在1：800～1：100范围内呈正相关，在1：40时有所降低。然而，EGCG对EE复合物的ABTS+·清除活性做出了更显著贡献，尽管1：800～1：100比例下复合物中EGCG的相对含量都远低于0.5％的EGCG，但是与EGCG相比，除1：100以外其它样品均不存在极显著差异，且EE的ABTS+·清除活性已远高于未处理咸蛋清，这一结果表明EGCG对蛋白回收产物的DPPH·清除活性做出了贡献，并且在1：40比例下达到最高的活性。
上述说明是针对发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (9)

1.一种咸蛋清蛋白的回收方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将咸蛋清用水稀释，得到咸蛋清稀释液；
S2.将步骤S1的咸蛋清稀释液与EGCG水溶液混合，得到混合液；
S3.步骤S2的混合液经摇床孵育，而后通过热诱导结合机械剪切力辅助的方式进行共聚集，得到水凝胶；
S4.步骤S3的水凝胶通过离心水洗的方式分离盐离子与蛋白，收集底部沉淀，将所述沉淀进行冷冻干燥，即得到所述咸蛋清蛋白。
2.根据权利要求1所述的咸蛋清蛋白的回收方法，其特征在于，步骤S1为，咸蛋清稀释前，先进行超声处理，超声处理后的咸蛋清加入脱气超纯水稀释，于室温下搅拌充分水化，过滤除脂，得到咸蛋清稀释液。
3.根据权利要求2所述的咸蛋清蛋白的回收方法，其特征在于，所述超声处理为：超声时间为30min，超声频率为40KHz；所述搅拌为：搅拌速率为100r/min，搅拌3h；所述咸蛋清稀释液中，咸蛋清与水的体积比为1：4。
4.根据权利要求1所述的咸蛋清蛋白的回收方法，其特征在于，步骤S2为，将步骤S1的咸蛋清稀释液与质量浓度为0.5％的EGCG水溶液混合，置于容器中，抽真空至7Pa，充氮气2～3min，得到混合液。
5.根据权利要求1所述的咸蛋清蛋白的回收方法，其特征在于，步骤S2的混合液中，EGCG和蛋白的质量比为1：800～1：40。
6.根据权利要求1所述的咸蛋清蛋白的回收方法，其特征在于，步骤S3中，所述热诱导结合机械剪切力辅助的方式为于室温恒温条件下，施加速率为120～160ft/min的剪切力，而后升温至70～95℃，并在该温度保持5～15min，随后迅速降至室温。
7.根据权利要求1所述的咸蛋清蛋白的回收方法，其特征在于，步骤S3中，所述热诱导结合机械剪切力辅助的方式为于30℃恒温1min，施加速率为145ft/min的剪切力，而后以5℃/min的升温速率升温94℃，并在该温度保持15min，随后迅速降至室温。
8.根据权利要求1所述的咸蛋清蛋白的回收方法，其特征在于，步骤S4中，所述离心水洗为置于冷冻离心机中进行离心水洗脱盐，离心时间为10min，离心转速为10000r/min。
9.根据权利要求1所述的咸蛋清蛋白的回收方法，其特征在于，步骤S4中，所述冷冻干燥条件为：预冻时冷阱温度-20℃，后升至-50℃，冷冻干燥时间为48h，冷冻干燥真空度为0.5～1mbar。
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