CN115251227B - 一种复合改性肌原纤维蛋白复合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于肉类食品加工技术领域,具体涉及一种复合改性肌原纤维蛋白复合物及其制备方法与应用。本发明通过采用脉冲光技术协同槲皮素作用于鱼肉中的肌原纤维蛋白,显著改变了肌原纤维蛋白的结构特性和理化特性,提升了鱼肉中肌原纤维蛋白的氧化稳定性。本发明未引入高剂量的非鱼蛋白组分,在提高肌原纤维蛋白功能特性的同时保持了鱼肉蛋白的营养价值与风味特性,满足了鱼类肌原纤维蛋白产品的品质需求。本发明能耗低、无污染、安全性高、成本低且各项参数易于调控,工艺简单,在工业化生产实践中具有较好的推广应用前景。
Description
技术领域
本发明属于肉类食品加工技术领域,具体涉及一种复合改性肌原纤维蛋白复合物及其制备方法与应用。
背景技术
肌原纤维蛋白是肌肉纤维的主要组成部分,其在肉制品的功能特性中起着重要作用。例如,肉类97%的持水能力受控于肌原纤维蛋白,大约75%的乳化能力与肌原纤维蛋白有关。此外,肉制品在运输和加工过程中极易发生蛋白质氧化反应,导致其功能性降低,如凝胶化和乳化等。继而进一步导致肉制品色泽暗淡、风味下降,营养成分流失,嫩度和持水性能减弱,严重影响品质,进而造成经济损失。因此,肌原纤维蛋白功能的改进以及氧化稳定性的提升是肉制品质地和感官特性改善以及低盐低脂产品质量提高的基础。
目前,对肌原纤维蛋白功能特性的改进方式主要采用物理法、化学法或酶法。但大多数化学改性法会破坏蛋白质的营养价值,可能产生有毒物质,对环境造成一定的污染。一些物理改性方式不但会造成蛋白质中营养成分的流失,也会使一些生物活性物质受到破坏。酶解法对肌原纤维蛋白进行改性,应用成本高,工艺条件严苛。
脉冲光技术作为一种新兴的可发出强烈白光(100~1100 nm)的非热处理技术,可作用于蛋白质的二硫键和非共价键。对氨基酸侧链进行修饰,改善蛋白质交联聚集,从而导致蛋白质空间结构发生改变。此外,槲皮素属于多酚类化合物,原料易得,提取率高且溶解性好。其具有较强的络合金属离子的性能以及自由基清除能力,与肌原纤维蛋白相互作用可有效抑制其氧化反应,同时也会对其结构、功能和营养特性产生影响。
在专利CN201810585829.0中的技术方案,采用天然多酚协同磷酸化技术改善肌原纤维蛋白的抗氧化活性及功能特性,使其氧化稳定性增强,乳化活性、乳化稳定性、凝胶弹性均得到一定程度的改善。但该方案中通过对改性肌原纤维蛋白溶液进行水浴加热和降温冷却以得到改性肌原纤维蛋白凝胶,加热过程难以控制升温速度,容易使得蛋白变性。对肌原纤维蛋白加热速度过快,其疏水性基团暴露在蛋白外部,容易降低肉制品的乳化性和乳化稳定性。此外,该方案中制备改性肌原纤维蛋白凝胶的工艺流程耗时长,参数不可控,成本高,效率低,不利于工业化生产。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中肌原纤维蛋白的氧化稳定性差致使肉制品质地和感官特性受影响、对肌原纤维蛋白功能特性进行改善的工艺流程耗时长,参数不可控的缺陷,提供了一种复合改性肌原纤维蛋白复合物及其制备方法,并将其应用于肉制品加工技术中。
为实现上述发明目的,本发明通过以下技术方案实现:
一种复合改性肌原纤维蛋白复合物的制备方法,包括以下步骤:
(S.1)从鱼肉中提取肌原纤维蛋白;
(S.2)将步骤(S.1)中提取得到的肌原纤维蛋白配制成肌原纤维蛋白溶液,然后向其中加入槲皮素,混合均匀后,得到肌原纤维蛋白-槲皮素混合液;
(S.3)取步骤(S.2)中得到的肌原纤维蛋白-槲皮素混合液进行脉冲光处理,得到脉冲光改性肌原纤维蛋白-槲皮素混合液;
(S.4)取步骤(S.3)中得到的脉冲光改性肌原纤维蛋白-槲皮素混合液进行冷冻干燥,得到基于脉冲光与槲皮素的复合改性肌原纤维蛋白复合物的粉末。
鱼肉中富含的肌原纤维蛋白除赋予肉制品特有的风味、口感和营养外,它的一些功能特性如乳化性和凝胶弹性等对产品的最终品质起重要作用。故而需要通过各种修饰来改变其功能特性。为了提升鱼类肌原纤维蛋白的凝胶特性,现有的技术大多通过添加淀粉、胶体、大豆蛋白、乳清蛋白等非鱼肉蛋白成分的方式。但该方式容易导致其制品的蛋白含量下降,营养价值降低,风味弱化,并引入一定致敏风险。常见的对肌原纤维蛋白进行修饰的方法包括磷酸化、糖基化等,而利用磷酸化改善蛋白功能特性是目前研究的热点之一。通过引进磷酸根改变了蛋白质的等电点、溶解度、乳化特性等,并改变了蛋白质分子的交联特性,影响了凝胶强度、弹性及保水性。但磷酸盐只能螯合金属离子,并不具备清除自由基的能力,单独使用抗氧化效果有限。
脉冲光具有光解效应,其利用惰性气体灯发出与太阳光谱相近,但强度更强的紫外光至红外线区域强烈脉冲闪光,从而实现对蛋白质改性与强化处理的一种新型非热加工技术。当闪照时,脉冲光产生的高能量可弱化或破坏蛋白质分子中的二硫键以及非共价键,致使蛋白质的空间结构发生改变。肌原纤维蛋白内部的残基发生暴露和重排,改善了其结构稳定性,乳化性以及起泡性。采用脉冲光对提取出来的肌原纤维蛋白进行处理,处理条件温和、均匀、绿色、无害,操作简便且效率高,处理过程中耗能小、无环境污染,各项参数容易调整和控制。但脉冲光在对蛋白的改性处理过程中会在一定程度上促进肌原纤维蛋白的氧化,而这个氧化主要由自由基所引发。自由基很大一部分是由光解诱导产生。
槲皮素作为植物多酚类的天然抗氧化剂,广泛存在于许多植物的茎皮、花、叶、芽、种子、果实中。原料易得,提取率高且溶解性好。脉冲光处理产生的光热效应在一定程度上也会加速肌原纤维蛋白的氧化,加入槲皮素可以有效缓解脉冲光对蛋白质造成的氧化损伤。槲皮素中的羟基具有极好的氢原子和电子转移能力,可以消除由脉冲光处理诱导产生的自由基,从而在一定程度上防止肌原纤维蛋白受到氧化损伤,继而有效抑制肌原纤维蛋白中羰基的形成。另外,槲皮素属于多酚类化合物,其本身具有较强的络合金属离子的性能以及自由基清除能力,可与蛋白、多糖通过氢键、疏水作用力等方式进行非共价结合。其也能与蛋白质中的巯基和氨基发生加成反应,使蛋白质二级、三级结构发生变化。从而改变肌原纤维蛋白的表面疏水性、巯基和羰基含量,有效抑制肌原纤维蛋白的氧化反应。槲皮素作为食品添加剂,可以提高肌原纤维蛋白的氧化稳定性,延长肉制品的货架期。
因此,本发明创新性地采用脉冲光技术协同槲皮素作用于鱼肉中的肌原纤维蛋白,显著改变了鱼肉中肌原纤维蛋白的结构特性和理化特性,提升了肌原纤维蛋白的氧化稳定性。
作为优选,所述步骤(S.2)中配制成的肌原纤维蛋白溶液的浓度为10~40mg/mL。
配制成的肌原纤维蛋白溶液的浓度低于10 mg/mL,溶液中肌原纤维蛋白含量过低,改性效果不明显。肌原纤维蛋白溶液的浓度高于40 mg/mL,容易发生絮凝。同时,肌原纤维蛋白溶液的浓度过高,也会超出仪器的检测限定范围,导致仪器损坏。
作为优选,所述步骤(S.2)中加入的槲皮素的质量百分比浓度为1.0%~4.0%。
作为天然抗氧化剂的槲皮素与蛋白质能以非共价或共价方式发生相互作用,从而显著提高肌原纤维蛋白的抗氧化性和清除自由基能力,大大延长了肉制品的货架期。同时,槲皮素修饰了蛋白质侧链氨基酸的功能基团,改变了蛋白质结构、表面亲水性/疏水性、溶解度,进而影响蛋白质的功能特性,使肌原纤维蛋白的乳化特性及凝胶弹性得到显著改善。因为槲皮素本身具有颜色,当槲皮素的质量百分比浓度高于4.0%时,容易影响后期制备出的产品美观性。而槲皮素的质量百分比浓度低于1.0%时,槲皮素含量过低,改性效果不明显。
作为优选,所述步骤(S.2)中混合均匀的反应条件为:将步骤(S.1)中得到的肌原纤维蛋白重悬于缓冲液中,反应温度为0~4℃,反应时间为0.5~1.5h,且每隔5~20min涡旋一次。
作为优选,所述步骤(S.2)中缓冲液为0.6M NaCl、15mM哌嗪-N,N'-二(2-乙烷磺酸)构成的pH值为6.0的盐溶液。
作为进一步优选,所述步骤(S.2)中缓冲液为0.6 mol/L NaCl 构成的pH值为7.2的20 mmol/L Tris-HCl缓冲液。
作为进一步优选,所述步骤(S.2)中缓冲液为100mM KCl、25mM K2HPO4/KH2PO4、2mMEDTA构成的pH值为7.5的盐溶液。
上述采用的缓冲液为一种两性缓冲液,可以很好地阻碍溶液pH的变化。此外,两性缓冲液的解离常数(pKa)随温度变化最小,具有盐平衡的作用,可以较好地稳定肌原纤维蛋白的性质。
作为优选,所述步骤(S.3)中对肌原纤维蛋白-槲皮素混合液进行脉冲光处理的反应条件为:放置于靠近氙灯的样品托盘上,电压为1.0~3.0 kV、脉冲能量为5~20 J、脉冲强度为4.0~9.0 J/m2,脉冲频率为0.5~3次/秒,脉冲光闪照时间为15~30 min。
对肌原纤维蛋白-槲皮素混合液进行脉冲光处理时,当脉冲光闪照时间低于15min,则反应不彻底,导致脉冲光改性效果不明显。当脉冲光闪照时间超过30 min时,则会产生“过度加工”效应。
作为优选,所述步骤(S.1)中从鱼肉中提取肌原纤维蛋白的具体步骤为:
将鱼肉研磨并加入肌原纤维蛋白提取液后进行均质化、离心、洗涤、过滤并调节pH值,得到肌原纤维蛋白沉淀,冷藏备用。
通过磷酸化引入大量磷酸根基团,改变蛋白质分子的电负性。有利于提高蛋白质分子间静电斥力,使之在食品体系中更容易分散,相互排斥。从而能够提高肌原纤维蛋白的溶解性和聚集稳定性,并降低等电点,改变肌原纤维蛋白的交联特性,从而改善蛋白的乳化特性及凝胶弹性。此外,磷酸盐具有金属离子螯合能力,具有一定的抗氧化性,使得被螯合的金属离子无法参与氧化反应,有助于提高肉制品的氧化稳定性。
作为优选,所述步骤(S.1)中肌原纤维蛋白提取液为10mM三聚磷酸钠、0.1 M KCl、2 mM MgCl2、1 mM EGTA、0.5 mM 二硫苏糖醇、10 mM K2HPO4构成的pH值为7.0的盐溶液。
肌原纤维蛋白提取液中的三聚磷酸钠(TPP)具有强大的肌球蛋白提取能力,其可以增加离子强度,有助于肌原纤维蛋白溶出。此外,三聚磷酸钠可以螯合金属离子,提高肌原纤维蛋白的水结合能力。
一种复合改性肌原纤维蛋白复合物的制备方法得到的复合改性肌原纤维蛋白复合物。
一种复合改性肌原纤维蛋白复合物在肉制品加工功能中的应用。
因此,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明通过采用脉冲光技术协同槲皮素作用于鱼肉中的肌原纤维蛋白,显著改变了肌原纤维蛋白的结构特性和理化特性,提升了鱼肉中肌原纤维蛋白的氧化稳定性;
(2)本发明未引入高剂量的非鱼蛋白组分,在提高肌原纤维蛋白功能特性的同时保持了鱼肉蛋白的营养价值与风味特性,满足了鱼类肌原纤维蛋白产品的品质需求;
(3)本发明能耗低、无污染、安全性高、成本低且各项参数易于调控,工艺简单,在工业化生产实践中具有较好的推广应用前景。
附图说明
图1为复合改性肌原纤维蛋白复合物的制备过程脉冲光处理装置图。
图2为改性前后肌原纤维蛋白中的羰基含量变化图。
具体实施方式
下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外,下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例,而不是全部的实施例。因此,基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种复合改性肌原纤维蛋白复合物的制备方法,包括以下步骤:
(S.1)制备肌原纤维蛋白溶液:取青鱼(市售)肉切块,提取肌原纤维蛋白,于4 ℃备用;
其中,肌原纤维蛋白的具体提取方法如下:
取30 g鱼肉经研磨机研磨两次并加入120 mL的肌原纤维蛋白提取液(10mM三聚磷酸钠、0.1 M KCl、2 mM MgCl2、1 mM EGTA、0.5 mM 二硫苏糖醇和10 mM K2HPO4,pH 7.0),将切碎的样品均质化20秒。在4 ℃下以2000g离心10分钟,弃去上清液,留取沉淀。取沉淀重复上述步骤两次,向最后所得的沉淀中加入4倍体积0.1M NaCl 洗涤3次。过滤肌原纤维蛋白悬浮液,用0.1 M HCl将pH值调节至6.0~6.2,得到肌原纤维蛋白沉淀。即为肌原纤维蛋白,于4 ℃冷藏备用;
将肌原纤维蛋白重悬于缓冲液(0.6 M NaCl、15 mM 哌嗪-N, N'-二(2-乙烷磺酸),pH 6.0)中,采用双缩脲比色法进行测定肌原纤维蛋白含量,从而制备出浓度为20mg/mL的肌原纤维蛋白溶液;
(S.2)制备肌原纤维蛋白-槲皮素混合液:取1.0 g槲皮素和50 mL步骤(S.1)中所得的肌原纤维蛋白溶液在4 ℃的环境中混合均匀,反应1小时,每隔15分钟涡旋一次,得到肌原纤维蛋白-槲皮素混合液;
(S.3)脉冲光处理:取50 mL步骤(S.2)中得到的肌原纤维蛋白-槲皮素混合液置于玻璃柱形容器中,放置于距氙灯3 cm的样品托盘上。设置脉冲电压为2 kV、脉冲能量为10J、脉冲强度为6.5 J/m2、脉冲频率为1次/秒、脉冲光闪照时间为15 min;
(S.4)冷冻干燥:取步骤(S.3)中利用脉冲光处理后的肌原纤维蛋白-槲皮素混合液进行冷冻干燥,得到基于脉冲光与槲皮素的复合改性肌原纤维蛋白复合物的粉末产品。
实施例2
一种复合改性肌原纤维蛋白复合物的制备方法,包括以下步骤:
(S.1)制备肌原纤维蛋白溶液:取青鱼(市售)肉切块,提取肌原纤维蛋白,于4 ℃备用;
其中,肌原纤维蛋白的具体提取方法如下:
取30 g鱼肉经研磨机研磨两次并加入120 mL的肌原纤维蛋白提取液(10mM三聚磷酸钠、0.1 M KCl、2 mM MgCl2、1 mM EGTA、0.5 mM 二硫苏糖醇和10 mM K2HPO4,pH 7.0),将切碎的样品均质化20秒。在4 ℃下以2000g离心10分钟,弃去上清液,留取沉淀。取沉淀重复上述步骤两次,向最后所得的沉淀中加入4倍体积0.1M NaCl 洗涤3次。过滤肌原纤维蛋白悬浮液,用0.1 M HCl将pH值调节至6.0~6.2,得到肌原纤维蛋白沉淀。即为肌原纤维蛋白,于4 ℃冷藏备用;
将肌原纤维蛋白重悬于缓冲液(0.6 M NaCl、15 mM 哌嗪-N, N'-二(2-乙烷磺酸),pH 6.0)中,采用双缩脲比色法进行测定肌原纤维蛋白含量,从而制备出浓度为20mg/mL的肌原纤维蛋白溶液;
(S.2)制备肌原纤维蛋白-槲皮素混合液:取1.0 g槲皮素和50 mL步骤(S.1)中所得的肌原纤维蛋白溶液在4 ℃的环境中混合均匀,反应1小时,每隔15分钟涡旋一次,得到肌原纤维蛋白-槲皮素混合液;
(S.3)脉冲光处理:取50 mL步骤(S.2)中得到的肌原纤维蛋白-槲皮素混合液置于玻璃柱形容器中,放置于距氙灯3 cm的样品托盘上。设置脉冲电压为2 kV、脉冲能量为10J、脉冲强度为6.5 J/m2、脉冲频率为1次/秒、脉冲光闪照时间为25 min;
(S.4)冷冻干燥:取步骤(S.3)中利用脉冲光处理后的肌原纤维蛋白-槲皮素混合液进行冷冻干燥,得到基于脉冲光与槲皮素的复合改性肌原纤维蛋白复合物的粉末产品。
实施例3
一种复合改性肌原纤维蛋白复合物的制备方法,包括以下步骤:
(S.1)制备肌原纤维蛋白溶液:取青鱼(市售)肉切块,提取肌原纤维蛋白,于4 ℃备用;
其中,肌原纤维蛋白的具体提取方法如下:
取30 g鱼肉经研磨机研磨两次并加入120 mL的肌原纤维蛋白提取液(10mM三聚磷酸钠、0.1 M KCl、2 mM MgCl2、1 mM EGTA、0.5 mM 二硫苏糖醇和10 mM K2HPO4,pH 7.0),将切碎的样品均质化20秒。在4 ℃下以2000g离心10分钟,弃去上清液,留取沉淀。取沉淀重复上述步骤两次,向最后所得的沉淀中加入4倍体积0.1M NaCl 洗涤3次。过滤肌原纤维蛋白悬浮液,用0.1 M HCl将pH值调节至6.0~6.2,得到肌原纤维蛋白沉淀。即为肌原纤维蛋白,于4 ℃冷藏备用;
将肌原纤维蛋白重悬于缓冲液(0.6 M NaCl、15 mM 哌嗪-N, N'-二(2-乙烷磺酸),pH 6.0)中,采用双缩脲比色法进行测定肌原纤维蛋白含量,从而制备出浓度为20mg/mL的肌原纤维蛋白溶液;
(S.2)制备肌原纤维蛋白-槲皮素混合液:取1.0 g槲皮素和50 mL步骤(S.1)中所得的肌原纤维蛋白溶液在4 ℃的环境中混合均匀,反应1小时,每隔15分钟涡旋一次,得到肌原纤维蛋白-槲皮素混合液;
(S.3)脉冲光处理:取50 mL步骤(S.2)中得到的肌原纤维蛋白-槲皮素混合液置于玻璃柱形容器中,放置于距氙灯3 cm的样品托盘上。设置脉冲电压为2 kV、脉冲能量为10J、脉冲强度为6.5 J/m2、脉冲频率为1次/秒、脉冲光闪照时间为30 min;
(S.4)冷冻干燥:取步骤(S.3)中利用脉冲光处理后的肌原纤维蛋白-槲皮素混合液进行冷冻干燥,得到基于脉冲光与槲皮素的复合改性肌原纤维蛋白复合物的粉末产品。
实施例4
一种复合改性肌原纤维蛋白复合物的制备方法,包括以下步骤:
(S.1)制备肌原纤维蛋白溶液:取青鱼(市售)肉切块,提取肌原纤维蛋白,于4 ℃备用;
其中,肌原纤维蛋白的具体提取方法如下:
取30 g鱼肉经研磨机研磨两次并加入120 mL的肌原纤维蛋白提取液(10mM三聚磷酸钠、0.1 M KCl、2 mM MgCl2、1 mM EGTA、0.5 mM 二硫苏糖醇和10 mM K2HPO4,pH 7.0),将切碎的样品均质化20秒。在4 ℃下以2000g离心10分钟,弃去上清液,留取沉淀。取沉淀重复上述步骤两次,向最后所得的沉淀中加入4倍体积0.1M NaCl 洗涤3次。过滤肌原纤维蛋白悬浮液,用0.1 M HCl将pH值调节至6.0~6.2,得到肌原纤维蛋白沉淀。即为肌原纤维蛋白,于4 ℃冷藏备用;
将肌原纤维蛋白重悬于缓冲液(0.6 M NaCl、15 mM 哌嗪-N, N'-二(2-乙烷磺酸),pH 6.0)中,采用双缩脲比色法进行测定肌原纤维蛋白含量,从而制备出浓度为10mg/mL的肌原纤维蛋白溶液;
(S.2)制备肌原纤维蛋白-槲皮素混合液:取1.0 g槲皮素和100 mL步骤(S.1)中所得的肌原纤维蛋白溶液在0 ℃的环境中混合均匀,反应0.5小时,每隔5分钟涡旋一次,得到肌原纤维蛋白-槲皮素混合液;
(S.3)脉冲光处理:取50 mL步骤(S.2)中得到的肌原纤维蛋白-槲皮素混合液置于玻璃柱形容器中,放置于距氙灯3 cm的样品托盘上。设置脉冲电压为1.0 kV、脉冲能量为5J、脉冲强度为4.0 J/m2、脉冲频率为0.5次/秒、脉冲光闪照时间为25 min;
(S.4)冷冻干燥:取步骤(S.3)中利用脉冲光处理后的肌原纤维蛋白-槲皮素混合液进行冷冻干燥,得到基于脉冲光与槲皮素的复合改性肌原纤维蛋白复合物的粉末产品。
实施例5
一种复合改性肌原纤维蛋白复合物的制备方法,包括以下步骤:
(S.1)制备肌原纤维蛋白溶液:取青鱼(市售)肉切块,提取肌原纤维蛋白,于4 ℃备用;
其中,肌原纤维蛋白的具体提取方法如下:
取30 g鱼肉经研磨机研磨两次并加入120 mL的肌原纤维蛋白提取液(10mM三聚磷酸钠、0.1 M KCl、2 mM MgCl2、1 mM EGTA、0.5 mM 二硫苏糖醇和10 mM K2HPO4,pH 7.0),将切碎的样品均质化20秒。在4 ℃下以2000g离心10分钟,弃去上清液,留取沉淀。取沉淀重复上述步骤两次,向最后所得的沉淀中加入4倍体积0.1M NaCl 洗涤3次。过滤肌原纤维蛋白悬浮液,用0.1 M HCl将pH值调节至6.0~6.2,得到肌原纤维蛋白沉淀。即为肌原纤维蛋白,于4 ℃冷藏备用;
将肌原纤维蛋白重悬于缓冲液(0.6 M NaCl、15 mM 哌嗪-N, N'-二(2-乙烷磺酸),pH 6.0)中,采用双缩脲比色法进行测定肌原纤维蛋白含量,从而制备出浓度为40mg/mL的肌原纤维蛋白溶液;
(S.2)制备肌原纤维蛋白-槲皮素混合液:取1.0 g槲皮素和23 mL步骤(S.1)中所得的肌原纤维蛋白溶液在2 ℃的环境中混合均匀,反应1.5小时,每隔20分钟涡旋一次,得到肌原纤维蛋白-槲皮素混合液;
(S.3)脉冲光处理:取50 mL步骤(S.2)中得到的肌原纤维蛋白-槲皮素混合液置于玻璃柱形容器中,放置于距氙灯3 cm的样品托盘上。设置脉冲电压为3.0 kV、脉冲能量为20J、脉冲强度为9.0 J/m2、脉冲频率为3次/秒、脉冲光闪照时间为25 min;
(S.4)冷冻干燥:取步骤(S.3)中利用脉冲光处理后的肌原纤维蛋白-槲皮素混合液进行冷冻干燥,得到基于脉冲光与槲皮素的复合改性肌原纤维蛋白复合物的粉末产品。
对比例1
一种复合改性肌原纤维蛋白复合物的制备方法,包括以下步骤:
(S.1)制备肌原纤维蛋白溶液:取青鱼(市售)肉切块,提取肌原纤维蛋白,于4 ℃备用;
其中,肌原纤维蛋白的具体提取方法如下:
取30 g鱼肉经研磨机研磨两次并加入120 mL的肌原纤维蛋白提取液(10mM三聚磷酸钠、0.1 M KCl、2 mM MgCl2、1 mM EGTA、0.5 mM 二硫苏糖醇和10 mM K2HPO4,pH 7.0),将切碎的样品均质化20秒。在4 ℃下以2000g离心10分钟,弃去上清液,留取沉淀。取沉淀重复上述步骤两次,向最后所得的沉淀中加入4倍体积0.1M NaCl 洗涤3次。过滤肌原纤维蛋白悬浮液,用0.1 M HCl将pH值调节至6.0~6.2,得到肌原纤维蛋白沉淀。即为肌原纤维蛋白,于4 ℃冷藏备用;
将肌原纤维蛋白重悬于缓冲液(0.6 M NaCl、15 mM 哌嗪-N, N'-二(2-乙烷磺酸),pH 6.0)中,采用双缩脲比色法进行测定肌原纤维蛋白含量,从而制备出浓度为20mg/mL的肌原纤维蛋白溶液;
(S.2)冷冻干燥:取步骤(S.1)中得到的肌原纤维蛋白溶液进行冷冻干燥,得到肌原纤维蛋白的粉末产品。
对比例2
一种复合改性肌原纤维蛋白复合物的制备方法,包括以下步骤:
(S.1)制备肌原纤维蛋白溶液:取青鱼(市售)肉切块,提取肌原纤维蛋白,于4 ℃备用;
其中,肌原纤维蛋白的具体提取方法如下:
取30 g鱼肉经研磨机研磨两次并加入120 mL的肌原纤维蛋白提取液(10mM三聚磷酸钠、0.1 M KCl、2 mM MgCl2、1 mM EGTA、0.5 mM 二硫苏糖醇和10 mM K2HPO4,pH 7.0),将切碎的样品均质化20秒。在4 ℃下以2000g离心10分钟,弃去上清液,留取沉淀。取沉淀重复上述步骤两次,向最后所得的沉淀中加入4倍体积0.1M NaCl 洗涤3次。过滤肌原纤维蛋白悬浮液,用0.1 M HCl将pH值调节至6.0~6.2,得到肌原纤维蛋白沉淀。即为肌原纤维蛋白,于4 ℃冷藏备用;
将肌原纤维蛋白重悬于缓冲液(0.6 M NaCl、15 mM 哌嗪-N, N'-二(2-乙烷磺酸),pH 6.0)中,采用双缩脲比色法进行测定肌原纤维蛋白含量,从而制备出浓度为20mg/mL的肌原纤维蛋白溶液;
(S.2)制备肌原纤维蛋白-槲皮素混合液:取1.0 g槲皮素和50 mL步骤(S.1)中所得的肌原纤维蛋白溶液在4 ℃的环境中混合均匀,反应1小时,每隔15分钟涡旋一次,得到肌原纤维蛋白-槲皮素混合液;
(S.3)冷冻干燥:取步骤(S.2)中得到的肌原纤维蛋白-槲皮素混合液进行冷冻干燥,得到经过槲皮素处理的复合改性肌原纤维蛋白复合物的粉末产品。
对比例3
一种复合改性肌原纤维蛋白复合物的制备方法,包括以下步骤:
(S.1)制备肌原纤维蛋白溶液:取青鱼(市售)肉切块,提取肌原纤维蛋白,于4 ℃备用;
其中,肌原纤维蛋白的具体提取方法如下:
取30 g鱼肉经研磨机研磨两次并加入120 mL的肌原纤维蛋白提取液(10mM三聚磷酸钠、0.1 M KCl、2 mM MgCl2、1 mM EGTA、0.5 mM 二硫苏糖醇和10 mM K2HPO4,pH 7.0),将切碎的样品均质化20秒。在4 ℃下以2000g离心10分钟,弃去上清液,留取沉淀。取沉淀重复上述步骤两次,向最后所得的沉淀中加入4倍体积0.1M NaCl 洗涤3次。过滤肌原纤维蛋白悬浮液,用0.1 M HCl将pH值调节至6.0~6.2,得到肌原纤维蛋白沉淀。即为肌原纤维蛋白,于4 ℃冷藏备用;
将肌原纤维蛋白重悬于缓冲液(0.6 M NaCl、15 mM 哌嗪-N, N'-二(2-乙烷磺酸),pH 6.0)中,采用双缩脲比色法进行测定肌原纤维蛋白含量,从而制备出浓度为20mg/mL的肌原纤维蛋白溶液;
(S.2)脉冲光处理:取50 mL步骤(S.1)中得到的肌原纤维蛋白溶液置于玻璃柱形容器中,放置于距氙灯3 cm的样品托盘上。设置脉冲电压为2 kV、脉冲能量为10 J、脉冲强度为6.5 J/m2、脉冲频率为1次/秒、脉冲光闪照时间为25 min;
(S.3)冷冻干燥:取步骤(S.2)中利用脉冲光处理后的肌原纤维蛋白溶液进行冷冻干燥,得到经过脉冲光处理的复合改性肌原纤维蛋白复合物的粉末产品。
脉冲光与槲皮素的改性处理对肌原纤维蛋白的粒径、zeta电位、乳化性能以及起泡性能的影响如下表1所示。
表1
【性能测试及分析】
【试验1】复合改性肌原纤维蛋白复合物的凝胶特性测定
分别按照实施例1~3以及对比例1~3的制备方法改性得到的复合改性肌原纤维蛋白复合物的粉末产品作为实验样品。借助静态激光粒子分析仪测量样品的粒径。在测量之前,每个样品需用少量蒸馏水稀释以避免多重散射效应。此外,使用粒径分析仪(Zetasizer)测定样品的zeta电位。
从表1中数据分析比较可知:对比未经脉冲光及槲皮素处理的样品的粒径,发现未经改性处理的肌原纤维蛋白粉末样品(对比例1)受到槲皮素的静电相互作用,导致粒径显著降低。此外,加入槲皮素并经脉冲光处理25min的样品(实施例2)具有最小的粒径,为25.43 μm,但过度的脉冲光处理则会导致样品粒径的增加。这可能是由于复合改性肌原纤维蛋白复合物的颗粒通过共价和非共价键重新聚合。“过度加工”效应可能通过蛋白质-蛋白质相互作用导致颗粒重新聚合,从而导致粒径分布的增强。通常,如果在蛋白质链表面带负电荷的氨基酸较多,则蛋白质溶液的zeta电位为负值。而蛋白质的绝对电荷可以起到抑制和聚集的作用。虽然绝对值低的蛋白质有凝结的趋势,但蛋白质表面的高净电荷(正或负)会干扰蛋白质的聚集,并通过静电排斥使蛋白质分散,从而降低粒子的大小和扩大粒子的分布。本实验结果表明,所有样品都表现出负表面电荷。加入槲皮素并经脉冲光处理25min的样品(实施例2)表现出最高的净电荷强度,可能是由于蛋白质表面极性残基具有更高的可利用性。此外,加入槲皮素并经脉冲光处理30min的样品(实施例3)的zeta电位显著降低,可能粒子发生了再聚合。
【试验2】复合改性肌原纤维蛋白复合物的乳化特性测定
分别按照实施例1~3以及对比例1~3的制备方法改性得到的复合改性肌原纤维蛋白复合物,通过比浊技术测定乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)。取0.2g复合改性肌原纤维蛋白复合物的粉末产品溶解在1.0mL浓度为0.1 M的缓冲液(缓冲液为0.6 MNaCl、15 mM 哌嗪-N,N'-二 (2-乙烷磺酸) 构成的pH值为6.0的盐溶液)中。再向其加入2~3mL芝麻油,以转速10000rpm均质2min,得到含有复合改性肌原纤维蛋白复合物的乳液。将乳液静置10min,取出50~55μL乳液分散在5~6mL 浓度为0.1%(按质量百分比计)的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中,测定500nm处的吸光度。
乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)的计算方法如下:
式中:N:稀释倍数;θ:油相占的比例;C:蛋白质浓度(g/mL);L:比色皿的光路长度(1 cm)。
式中:A0:0 min 时的吸光值;At:t min时的吸光值;ΔT:t min与0 min的差值;ΔA:At与A0的差值。
从表1中数据分析比较可知:在均质过程中,含有亲水基团和疏水基团的蛋白质颗粒吸附在形成的油滴表面,形成保护层。从而防止油滴聚结、絮凝和重力分离。未经任何处理的样品(对比例1)的乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)最小。而加入槲皮素并经脉冲光处理25min的样品(实施例2),乳化性能最强。说明脉冲光和槲皮素处理可以增加肌原纤维蛋白的比表面积和表面疏水性。增加表面积体积比可以使更多的蛋白质链产生界面膜以覆盖油滴表面,从而提高乳化性能。此外,表面疏水性的增加可以确保更有效地吸收油滴表面的蛋白质颗粒。加入槲皮素并经脉冲光处理30min的样品(实施例3)可能发生过度加工,导致肌原纤维蛋白聚集体的形成以及疏水基团向蛋白质结构的内部迁移,致使乳化活性指数降低。
【试验3】复合改性肌原纤维蛋白复合物的起泡特性测定
分别按照实施例1~3以及对比例1~3的制备方法改性得到的复合改性肌原纤维蛋白复合物的粉末产品作为实验样品。取10mg复合改性肌原纤维蛋白复合物的粉末产品溶解在30 mL浓度为0.1 M缓冲液(缓冲液为0.1 M Na2HPO4 /NaH2PO4、50 mM KCl、2mM EDTA构成的pH值为7.5的盐溶液)中,形成含有复合改性肌原纤维蛋白复合物的混合溶液。将该混合溶液在室温下以8000 r/min搅拌30 min,使其发泡。将泡沫转移到量筒中测量泡沫的体积。
起泡能力FO(%)计算方法如下:
起泡稳定性FS(%)计算方法如下:
式中:V1是搅打结束时泡沫的体积(mL),V0是含有复合改性肌原纤维蛋白复合物的混合溶液的初始体积(mL)。此外,在静置30 min后再次测定泡沫体积(V2)以确定泡沫稳定性。
从表1中数据分析比较可知:肌原纤维蛋白的起泡特性受到了脉冲光和槲皮素改性处理的显著影响。与未经任何处理的样品(对比例1)的起泡能力是206.34%相比,加入槲皮素并经脉冲光处理15min的样品(实施例1)和加入槲皮素并经脉冲光处理25min的样品(实施例2)的起泡能力分别提高至219.16%和248.55%。此外,过度的脉冲光处理容易导致肌原纤维蛋白的起泡能力显著降低。同时,起泡稳定性也观察到了相同的变化趋势。原因在于起泡过程取决于三个重要参数,包括表面疏水性、粒径以及表面活性剂的结构。由于蛋白质表面疏水基团可以导致界面区域更有效的吸收,因此表面疏水性的改变被视为起泡特性发生变化的主要原因。此外,粒径的降低以及比表面积的增加也会影响起泡特性。因此,在槲皮素与脉冲光的协同作用下,蛋白质链发生部分变性,致使产生部分打开的可在空气/水表面吸收的分子,从而使蛋白质更有效地吸附在空气/水界面上。
【试验4】复合改性肌原纤维蛋白复合物的抗氧化特性测定
分别按照实施例1~3以及对比例1~3的制备方法改性得到的复合改性肌原纤维蛋白复合物的粉末产品作为实验样品。取10 mg制得的复合改性肌原纤维蛋白复合物的粉末样品溶于2 mL缓冲液(0.1 M Na2HPO4 /NaH2PO4、50 mM KCl、2mM EDTA,pH=7.5)中得到含有复合改性肌原纤维蛋白复合物的溶液。取500 μL含有复合改性肌原纤维蛋白复合物的溶液与500 μL 10 mM二硝基苯肼(DNPH)溶液混合。在25 ℃的黑暗环境中孵育1小时,每隔15min涡旋一次。然后取沉淀物用乙酸乙酯/乙醇溶液(体积比为1:1)洗涤3次以除去残留的二硝基苯肼(DNPH)。将沉淀物重溶于500 μL 浓度为6M盐酸胍溶液中,测定370 nm处的吸光度。使用双缩脲法测定蛋白质浓度。
肌原纤维蛋白中的羰基含量计算公式为:
羰基含量(nmol/mg)=106×A/(C×ε×b)
式中:A为样品吸光度,b为光程(0.54 cm),C为蛋白质浓度(mg/mL),ε为吸收系数[22000 L/(mol·cm)]。
氧化稳定性(%)计算方法为:
其中:F1是最优处理方式对应的样品(实施例2)中的羰基含量,F0是未经任何处理的样品(对比例1)中羰基含量。
改性前后肌原纤维蛋白中的羰基含量变化如图2所示。
从图2中数据分析比较可知:肌原纤维蛋白的过度氧化会降低其功能特性和营养价值。而蛋白质氧化通常伴随着羰基含量的增加。槲皮素的羟基具有较好的转移氢原子和电子的能力,可以清除自由基,防止肌原纤维蛋白受到氧化损伤,从而抑制羰基的形成。相较于未经改性处理的肌原纤维蛋白粉末样品(对比例1),加入槲皮素并经脉冲光处理25min的样品(实施例2)表现出最低的羰基含量,该处理方式可将肌原纤维蛋白的氧化稳定性提升69.7~72.3%。
综上,本发明通过采用脉冲光技术协同槲皮素作用于鱼肉中的肌原纤维蛋白,显著改变了肌原纤维蛋白的结构特性和理化特性,提升了鱼肉中肌原纤维蛋白的氧化稳定性。同时,本发明未引入高剂量的非鱼蛋白组分,在提高肌原纤维蛋白功能特性的同时保持了鱼肉蛋白的营养价值与风味特性,满足了鱼类肌原纤维蛋白产品的品质需求。此外,本发明能耗低、无污染、安全性高、成本低且各项参数易于调控,工艺简单。相较于未经复合改性处理的肌原纤维蛋白,复合改性肌原纤维蛋白复合物的粉末产品的乳化活性提高了32.3~34.2%,起泡特性提高了31.0~32.13%,氧化稳定性提升了69.7~72.3%。相较于目前效率及安全性较高的酶法改性,本发明所涉及的处理方法,可将乳化性由398.37 m2/g提高到458.12m2/g,羰基含量由1.57 nmol/mg降低到1.24 nmol/mg(降低了21%)。说明经过脉冲光和槲皮素改性后的复合改性肌原纤维蛋白复合物在食品行业工业化生产实践中具有较好的推广应用前景。
以上所述仅是对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明,对本领域的普通技术人员而言,依据本发明提供的思想,在具体实施方式上会有改变之处,而这些改变也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种复合改性肌原纤维蛋白复合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(S.1)将鱼肉研磨并加入10mM三聚磷酸钠、0.1M KCl、2mM MgCl2、1mM EGTA、0.5mM 二硫苏糖醇、10mM K2HPO4构成的pH值为7.0的盐溶液后进行均质化、离心、洗涤、过滤并调节pH值,得到肌原纤维蛋白沉淀,冷藏备用;
(S.2)将步骤(S.1)中得到的肌原纤维蛋白重悬于0.6M NaCl、15mM哌嗪-N,N'-二(2-乙烷磺酸)构成的pH值为6.0的盐溶液中,配制成浓度为10~40mg/mL的肌原纤维蛋白溶液,然后向其中加入质量百分比浓度为1.0%~4.0%的槲皮素,在0~4℃反应0.5~1.5h,且每隔5~20min涡旋一次,混合均匀后,得到肌原纤维蛋白-槲皮素混合液;
(S.3)取步骤(S.2)中得到的肌原纤维蛋白-槲皮素混合液放置于靠近氙灯的样品托盘上,电压为1.0~3.0kV、脉冲能量为5~20J、脉冲强度为4.0~9.0J/m2、脉冲频率为0.5~3次/秒、脉冲光闪照时间为15~30min,进行脉冲光处理,得到脉冲光改性肌原纤维蛋白-槲皮素混合液;
(S.4)取步骤(S.3)中得到的脉冲光改性肌原纤维蛋白-槲皮素混合液进行冷冻干燥,得到基于脉冲光与槲皮素的复合改性肌原纤维蛋白复合物的粉末。
2.如权利要求1所述的一种复合改性肌原纤维蛋白复合物的制备方法制备得到的复合改性肌原纤维蛋白复合物。
3.如权利要求2所述复合改性肌原纤维蛋白复合物在肉制品加工中的应用。
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