CN1176218C

CN1176218C - 用于检测细菌的免疫捕捉法通用引物pcr方法

Info

Publication number: CN1176218C
Application number: CNB021019835A
Authority: CN
Inventors: 彭宣宪; 王三英; 张建营
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2002-01-22
Filing date: 2002-01-22
Publication date: 2004-11-17
Anticipated expiration: 2022-01-22
Also published as: CN1366183A

Abstract

涉及一种检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法，采用针对各种细菌的特异性抗体进行包被，经封闭后加入细菌溶液于36～38℃下免疫捕捉，然后热变性释放模板，吸取裂解液作为PCR反应模板，最后利用细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR，本发明将抗原抗体反应的特异性与PCR强大的扩增效率相结合，建立了检测病原菌的iUPPCR，其特异性是通过抗体对抗原的特异识别来达到，只有能被抗体识别的细菌才能被捕捉到，而被捕捉到的细菌均可经通用引物按同一程序扩增，故可以达到快速检出的目的，重复性好，特异性强、敏感性高，其原理可用于几乎所有病原菌的检测，具有较好的应用推广价值。

Description

用于检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法

(1)技术领域

本发明涉及一种检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法。

(2)背景技术

细菌感染性疾病长期危害人类健康，快速敏感检出病原菌是防制疾病的重要步骤。近年来，PCR技术已被应用于病原菌的检测，这些检测技术可分为2大类，分别为特异性引物PCR和非特异性引物PCR，前者依目的菌不同而往往需要不同的引物，而不同引物序列又可能需要不同的扩增条件，故当待检菌不明时则需进行多次PCR才可能得到结果，因此，难以达到快速特异检测的目的；后者一般根据细菌16SrRNA基因的保守性合成通用引物，所扩增的产物往往需要配合RFLP(限制性段片多态性分析)、SSCP(单链构象性多态性分析)或序列分析才能进行确定，故操作步骤较为繁锁。

(3)发明内容

本发明的目的旨在提供一种利用抗体特异性识别待检菌，再采用细菌16SrRNA基因通用引物进行PCR扩增，快速特异地检测病原菌的方法。

本发明所说的免疫捕捉法通用引物PCR(iUPPCR)方法操作步骤如下：

1)抗体包被：采用pH9.6，0.01mol/L碳酸缓冲液，将针对各种细菌的特异性抗体配制成抗体含量为1～10μg/mL的溶液，分别包被至固相载体上，每份50mL于4℃下过夜，然后用pH7.4，0.01mol/L磷酸盐-吐温缓冲液(PBS-T)洗板3次，每次3～5分钟；所说的固相载体为酶联反应板或塑料反应小管；

2)封闭：每孔加入50μL10％小牛血清，36～38℃封闭1小时，甩干；

3)免疫捕捉：每孔加入细菌溶液20～40μL，于36～38℃温育1小时，用PBS-T洗板5次，每次3～5分钟；

4)热变性释放模板：每孔加入20～40μL无菌双蒸水，沸水浴加热8～10分钟，吸取8～36μL裂解液作为PCR反应模板；

5)通用引物PCR(UPPCR)：在PCR反应管中依次加入10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L的MgCl₂3μL，混合dNTPs(各10mmol/L)0.5μL，74μmol/L的引物0.085μL，5U/μL的Taq酶0.1μL，最后加入模板至总体积25～50μL，混合后，94℃变性1分钟，51℃复性1分钟，70℃延伸2.5分钟，共循环40次；所说的引物为通用引物，由Sangon公司合成，选自细菌16SrRNA基因保守区，引物序列如下：正向引5’-AAACTCAAAGGAATTCGG-3’，逆向引物5’-GACGGGCGGTGTACAA-3’；

6)PCR产物鉴定：取PCR产物5μL，与适量加样缓冲液混合，点样于含0.5mg/μL的溴化乙啶(EB)的2.5％琼脂糖凝胶中，80V电泳30分钟，观察结果。

本发明将抗原抗体反应的特异性与PCR强大的扩增效率相结合，建立了检测病原菌的iUPPCR，其特异性是通过抗体对抗原的特异识别来达到，只有能被抗体识别的细菌才能被捕捉到，而被捕捉到的细菌均可经通用引物按同一程序扩增，故可以达到快速检出的目的，本免疫捕捉法PCR具有相当的敏感性，比直接裂解法PCR敏感，PCR产物条带更清晰。这可能是由于免疫捕捉的过程是利用了亲和层析的原理，从而将不利于PCR扩增的杂质除去，因此理论上1个细菌也可检出，这对于临床血液标本中的病原菌的检测具有重要意义。PCR标本来源不同，处理方法各异，用传统PCR检测方法不仅费时费力，而且干扰PCR扩增的物质也较多，容易出现假阴性，对于微量标本更是如此。采用本法可直接将标本加入反应孔内，通过亲和法进行标本纯化，从而不但提高了敏感性、同时也减少所需时间。具有快速、特异、敏感的特点，且重复性高。由于本发明使用的是细菌的通用引物，因此可推广至其它病原菌的检测，具有较好的临床推广价值。

(4)附图说明

图1为实施例3中福氏志贺菌型间交叉实验结果的PCR产物电泳图。

图2为实施例5中免疫捕捉法UPPCR和热变性法UPPCR检测粪便中志贺菌的比较实验PCR产物电泳图。

(5)具体实施方式

实施例1：

实验菌种：痢疾志贺菌(Shinglla dysenteriae)I型，宋氏志贺菌(Shigella sonnei)，福氏志贺菌(Shigella flexneri)1a、2a、2b、3a、4、5、Y变种，鲍氏志贺菌(Shigella boydii)1。其中痢疾志贺菌I型、宋氏志贺菌、福氏志贺菌4、鲍氏志贺菌16购自江西省卫生防疫站，福氏志贺菌1a、2a、2b、3a、5、Y变种购自福建省卫生防疫站。

通用引物：由Sangon公司合成，选自细菌16SrRNA基因保守区，经鉴定为电泳纯。引物序列如下：正向引物5’-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3’逆向引向物5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’。

诊断血清：上述志贺菌属各菌诊断血清为卫生部兰州生物制品研究所产品，4步硫酸铵法提纯抗体。

PCR试剂：Taq酶(MBI产品)，dNTPs(Sangon产品)。

限制性内切酶：Hae III(Ferments产品)。

分子量标准：pGEM-7Zf(+)/Hae III Markers(Sangon产品)。

肉汤培养基：0.5％牛肉膏，1％蛋白胨，0.5％氯化钠，pH7.2-7.4，121℃灭菌20分钟，37℃摇床培养18～24h。

细菌计数：显微镜直接计数和平板计数。

iUPPCR操作步骤：

1)首先抗体包被：用pH9.6，0.01mol/L碳酸缓冲液将上述志贺菌属各菌抗体稀释为10μg/mL，分别加入酶联反应板各孔，每孔50μL，于4℃冰箱过夜，然后用pH7.4，0.01mol/LPBS-T洗板3次，每次3分钟。

2)封闭：10％小牛血清37℃封闭1小时后甩干。

3)免疫捕捉：每孔加入细菌溶液20μL，于37℃保温1小时，用PBS-T洗板5次，每次3分钟。

4)热变性释放模板：每孔加入20μL无菌双蒸水，沸水浴加热10分钟，吸取18μL裂解液作为PCR反应模板。

5)UPPCR：在PCR反应管中依次加入10×PCR buffer 2.5μL，MgCl₂(25mmol/L)3μL，混合dNTPs(各10mmol/L)0.5μL，引物(74μmol/L)各0.085uL，Taq酶(5U/μL)0.1μL，最后加入模板至总体积25μL。混合后，94℃变性1分钟，51℃复性1分钟，70℃延伸2.5分钟，共循环40次。

6)PCR产物鉴定：取PCR产物5μL，与适量加样缓冲液混合，点样于2.5％的含0.5μg/mL EB的琼脂糖凝胶中，80V电泳30分钟。取限制性内切酶Hae III产品对PCR产物进行酶切鉴定，结果其酶切片段大小与理论值相符。

实施例2：

中和实验：同时设立中和组和对照组进行中和实验。材料及iUPPCR操作步骤均同实施例1，将痢疾志贺菌I型、宋氏志贺菌、福氏志贺菌4、鲍氏志贺菌16菌液稀释成20μL菌液中含50CFU病原菌。中和组取20μL菌液与等体积50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL相应抗体混合，于37℃温育1小时后加于反应板中：对照组则加入20μL菌液和20μL无菌水，其余步骤不变。中和结果见表1，三组中和组均无PCR扩增产物，而相应对照组均有扩增产物。

表1iUPPCR检测痢疾志贺菌I型、宋氏志贺菌、福氏志贺菌4、鲍氏志贺菌16的中和实验结果

中和组抗体浓度对照组

50μg/mL 100μg/mL 200μg/mL

痢疾志贺菌I型 - - - +

宋氏志贺菌 - - - +

福氏志贺菌4 - - - +

鲍氏志贺菌16 - - - +

实施例3：iUPPCR交叉实验

1)用种特异的单价诊断血清提纯抗体进行交叉实验：材料同实施例1，以痢疾志贺氏菌I型、宋氏志贺菌、福氏志贺菌4和鲍氏志贺菌16的单价诊断血清所提抗体包被反应板，每种抗体包被4孔，分别用于捕捉4种志贺氏菌，其余步骤同实施例1，PCR产物鉴定结果表明种间无交叉反应出现(见表2)。

表2采用特异性单价抗体捕捉的iUPPCR检测痢疾志贺菌I型、宋氏志贺菌、福氏志贺菌4和鲍氏志贺菌16的交叉实验结果

痢疾志贺菌I型宋氏志贺菌福氏志贺菌4 鲍氏志贺菌16

抗痢疾志贺氏I型 + - - -

抗宋内志贺氏 - + - -

抗福氏志贺氏4 - - + -

抗鲍氏志贺氏16-18 - - - +

2)用型特异的单价诊断血清提纯抗体进行交叉实验：以福氏志贺菌1型、2型、3型、4型、5型、6型单价诊断血清所提抗体包被反应板，每一种抗体包被6孔，分别用于捕捉福氏志贺菌1a、2a、3a、4、5、Y变种，其余步骤不变，PCR产物鉴定结果表明，型间无交叉反应出现(见表3)。图1为福氏志贺菌型间交叉反应实验结果的PCR产物电泳图，图1中

1：福氏志贺菌1a与抗1型抗体反应2：福氏志贺菌2a与抗1型抗体反应

3：福氏志贺菌2a与抗2型抗体反应4：福氏志贺菌3a与抗2型抗体反应

5：福氏志贺菌3a与抗3型抗体反应6：福氏志贺菌4与抗3型抗体反应

7：福氏志贺菌4与抗4型抗体反应8：福氏志贺菌5与抗4型抗体反应

9：福氏志贺菌5与抗5型抗体反应10：福氏志贺菌Y变种与抗5型抗体反应

11：福氏志贺菌Y变种与抗6型抗体反应M：pGEM-7Zf(+)/HaeIII Mrakers

表3采用型特异性单价抗体捕捉的iUPPCR检测福氏志贺菌1a、2a、3a、4、5和Y变种的交叉实验结果

福氏志贺菌

1a 2a 3a 4 5 Y变种

抗1型抗体 + - - - - -

抗2型抗体 - + - - - -

抗3型抗体 - - + - - -

抗4型抗体 - - - + - -

抗5型抗体 - - - - + -

抗6型抗体 - - - - - -

实施例4：

实验菌种：宋氏志贺菌(Shigella sonnei)购自江西省卫生防疫站。

通用引物：同实施例1。

诊断血清：宋氏志贺菌诊断血清为卫生部兰州生物制品研究所产品，4步硫酸铵法提纯抗体。

PCR试剂：同实施例1。

分子量标准：同实施例1。

肉汤培养基：同实施例1。

细菌计数：同实施例1。

每孔加入稀释定量后的细菌20μl进行捕捉，其浓度分别为每20μL菌液中含有菌体20、100、500、1000CFU。同时采用iUPPCRT和直接裂解法UPPCR进行扩增，iUPPCR操作方法同实施例1。直接裂解法UPPCR为取细菌培养液于3500rpm离心20分钟收集菌体，依实验要求用双蒸水稀释细菌，沸水变性10分钟，12000rpm离心10分钟。取上清液作为模板，进行UPPCR扩增。结果两法均为阳性。

将细菌浓度定为200、100和20个CFU/400μL，均分为20份。10份用于免疫捕捉，另10份用于热变性，其余步骤不变，结果表明两法有非常显著的差异(P均＜0.01)。(见表4)

表4：比较免疫捕捉法UPPCR和热变性法UPPCR检测10、5和1CFU细菌的敏感性

10CFU细菌 5CFU细菌 1CFU细菌

管数阳性数阳性率(％) 阳性数阳性率(％) 阳性数阳性率(％)

免疫捕捉UPPCR 10 10 100.0 10 100.0 4 40.0

热变性法UPPCR 10 6 60.0 2 20.0 0 0

空白对照 5 0 0 0 0 0 0

P＜0.01

实施例5：粪便环境模拟实验

实验菌种：痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)I型购自江西省卫生防疫站。

通用引物：同实施例1。

诊断血清：痢疾志贺菌诊断血清为卫生部兰州生物制品研究所产品，4步硫酸铵法提纯抗体。

PCR试剂：同实施例1。

限制性内切酶：同实施例1。

分子量标准：同实施例1。

肉汤培养基：同实施例1。

细菌计数：同实施例1。

粪便环境模拟标本：用无菌生理盐水将正常人粪便1g均匀悬浮，2500r/分钟离心10分钟，取上清稀释痢疾志贺菌I型，稀释后浓度为100CFU/200μL，分别于10个反应孔中进行捕捉，其余步骤不变。取粪便环境模拟标本，同时用iUPPCR和热变性直接裂解法UPPCR检测。iUPPCR方法同实施例1，热变性法同实施例4，结果前法的10管中有8管为阳性，阳性率为80％，后法的10管中无扩增产物出现(见图2)。两者有非常显著的差异(P＜0.01)。PCR产物经酶切鉴定，其片段与理论值相符。图2中：

1：pGEM-7Zf(+)/HaeIII Markers

2：免疫捕捉法UPPCR产物

3：热变性法UPPCR产物

实施例6：

通用引物：同实施例1。

诊断血清：同实施例1。

PCR试剂：同实施例1。

限制性内切酶：同实施例1。

分子量标准：同实施例1。

肉汤培养基：同实施例1。

细菌计数：同实施例1。

iUPPCR操作步骤：同实施例1。

沙门氏志贺氏琼脂(SS Agar)：上海市医学化验所试剂厂产品。

污水样品采集：从厦门大学附近医院和居民区污水排放点取污水35份，每份5mL，置于无菌容器中室温静置2小时，分别取上清20μL用于捕捉和40μL用于细菌培养。

污水细菌培养：称取53克沙门氏志贺氏琼脂，加入1000mL冷蒸馏水微火煮沸使完全溶解，冷至50℃左右倾入无菌平皿中凝固后备用。取40μL污水样品涂布平皿，37℃培养24小时。

血清学鉴定：挑取无色半透明菌落，按玻片凝集实验进行血清学鉴定。

以志贺菌属各菌型特异性抗体包被反应板，检测采自厦门大学附近的污水样品35份，同时采用细菌培养结合血清型反应的检测方法比较。结果iUPPCR检测的阳性率显著高于细菌培养和血清学方法(见表5)。从表中可看出两法有非常显著的差异(P＜0.01)，同时随机对5份阳性产物进行酶切鉴定，结果与理论片段长度一致。

表5采用iUPPCR和细菌培养结合血清学方法检测35份污水样品的阳性率比较

免疫捕捉法UPPCR 细菌培养和血清学方法

阳性数阳性率(％) 阳性数阳性率在(％)

痢疾志贺菌I型 2 5.7 0 0.0

痢疾志贺菌II型 0 0.0 0 0.0

福氏志贺菌1型 0 0.0 0 0.0

福氏志贺菌2型 15 42.9 5 14.3

福氏志贺菌3型 3 8.6 0 0.0

福氏志贺菌4型 0 0.0 0 0.0

福氏志贺菌5型 0 0.0 0 0.0

福氏志贺菌6型 0 0.0 0 0.0

宋氏志贺菌 3 8.6 0 0.0

鲍氏志贺菌1-6 0 0.0 0 0.0

鲍氏志贺菌7-11 0 0.0 0 0.0

鲍氏志贺菌12-15 0 0.0 0 0.0

鲍氏志贺菌16-18 0 0.0 0 0.0

合计 23 65.8 5 14.3^*

P＜0.0

Claims

1、用于检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法，其特征在于操作步骤如下：

1)抗体包被：采用pH9.6，0.01mol/L碳酸缓冲液，将针对各种细菌的特异性抗体配制成抗体含量为1～10μg/mL的溶液，将溶液中的抗体分别包被至固相载体上，每份50μL，于4℃过夜，然后用pH7.4，0.01mol/L磷酸盐-吐温缓冲液洗板3次，每次3～5分钟；

2)封闭：每份加入50μL 10％小牛血清，36～38℃封闭1小时，甩干；

3)免疫捕捉：每份加入细菌溶液20～40μL，于36～38℃温育1小时，用PBS-T洗液洗板5次，每次3～5分钟；

4)热变性释放模板：每份加入20～40μL无菌双蒸水，沸水浴加热8～10分钟，吸取18～36μL裂解液作为PCR反应模板；

5)通用引物PCR：在PCR反应管中依次加入10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L的MgCl₂3μL，混合dNTPs各10mmol/L 0.5μL，74μmol/L的引物0.085μL，5U/μL的Tag酶0.1μL，最后加入模板至总体积25～50μL，混合后，94℃变性1分钟，51℃复性1分钟，70℃延伸2.5分钟，共循环40次；所说的引物为通用引物，选自细菌16S rRNA基因保守区，引物序列如下：正向引物5’-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3，逆向引物5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’；

6)PCR产物鉴定：取PCR产物5μL，与适量加样缓冲液混合，点样于0.5μg/mL溴化乙啶的2.5％琼脂糖凝胶中，80V电泳30分钟，观察结果。

2.如权利要求1所述的用于检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法，其特征在于步骤4)热变性释放模板中无菌双蒸水每份所加体积与步骤3)免疫捕捉中每份所加细菌溶液体积一致。

3.如权利要求1所述的用于检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法，其特征在于所说的固相载体为酶联反应板或塑料反应小管。

4.如权利要求3所述的用于检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法，其特征在于所说的固相载体为酶联反应板。