CN1366183A - 用于检测细菌的免疫捕捉法通用引物pcr方法 - Google Patents
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Abstract
涉及一种检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法,采用针对各种细菌的特异性抗体进行包被,经封闭后加入细菌溶液于36~38℃下免疫捕捉,然后热变性释放模板,吸取裂解液作为PCR反应模板,最后利用细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR,本发明将抗原抗体反应的特异性与PCR强大的扩增效率相结合,建立了检测病原菌的iUPPCR,其特异性是通过抗体对抗原的特异识别来达到,只有能被抗体识别的细菌才能被捕捉到,而被捕捉到的细菌均可经通用引物按同一程序扩增,故可以达到快速检出的目的,重复性好,特异性强、敏感性高,其原理可用于几乎所有病原菌的检测,具有较好的应用推广价值。
Description
(1)技术领域
本发明涉及一种检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法。
(2)背景技术
细菌感染性疾病长期危害人类健康,快速敏感检出病原菌是防制疾病的重要步骤。近年来,PCR技术已被应用于病原菌的检测,这些检测技术可分为2大类,分别为特异性引物PCR和非特异性引物PCR,前者依目的菌不同而往往需要不同的引物,而不同引物序列又可能需要不同的扩增条件,故当待检菌不明时则需进行多次PCR才可能得到结果,因此,难以达到快速特异检测的目的;后者一般根据细菌16S rRNA基因的保守性合成通用引物,所扩增的产物往往需要配合RFLP(限制性段片多态性分析)、SSCP(单链构象性多态性分析)或序列分析才能进行确定,故操作步骤较为繁锁。
(3)发明内容
本发明的目的旨在提供一种利用抗体特异性识别待检菌,再采用细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增,快速特异地检测病原菌的方法。
本发明所说的免疫捕捉法通用引物PCR(iUPPCR)方法操作步骤如下:
1)抗体包被:采用pH9.6,0.01mol/L碳酸缓冲液,将针对各种细菌的特异性抗体配制成抗体含量为1~10μg/mL的溶液,分别包被至固相载体上,每份50mL于4℃下过夜,然后用pH7.4,0.01mol/L磷酸盐-吐温缓冲液(PBS-T)洗板3次,每次3~5min;所说的固相载体为酶联反应板或塑料反应小管;
2)封闭:每孔加入50μL10%小牛血清,36~38℃封闭1hr,甩干;
3)免疫捕捉:每孔加入细菌溶液20~40μL,于36~38℃温育1hr,用PBS-T洗板5次,每次3~5min;
4)热变性释放模板:每孔加入20~40μL无菌双蒸水,沸水浴加热8~10min,吸取8~36μL裂解液作为PCR反应模板;
5)通用引物PCR(UPPCR):在PCR反应管中依次加入10×PCR缓冲液2.5μL,25mmol/L的MgCl23μL,混合dNTPs(各10mmol/L)0.5μL,74μmol/L的引物0.085μL,5U/μL的Taq酶0.1μL,最后加入模板至总体积25~50μL,混合后,94℃变性1min,51℃复性1min,70℃延伸2.5min,共循环40次;所说的引物为通用引物,由Sangon公司合成,选自细菌16S rRNA基因保守区,引物序列如下:正向引5’-AAACTCAAAGGAATTCGG-3’,逆向引物5’-GACGGGCGGTG TACAA-3’;
6)PCR产物鉴定:取PCR产物5μL,与适量加样缓冲液混合,点样于含0.5mg/μL的溴化乙啶(EB)的2.5%琼脂糖凝胶中,80V电泳30min,观察结果。
本发明将抗原抗体反应的特异性与PCR强大的扩增效率相结合,建立了检测病原菌的iUPPCR,其特异性是通过抗体对抗原的特异识别来达到,只有能被抗体识别的细菌才能被捕捉到,而被捕捉到的细菌均可经通用引物按同一程序扩增,故可以达到快速检出的目的,本免疫捕捉法PCR具有相当的敏感性,比直接裂解法PCR敏感,PCR产物条带更清晰。这可能是由于免疫捕捉的过程是利用了亲和层析的原理,从而将不利于PCR扩增的杂质除去,因此理论上1个细菌也可检出,这对于临床血液标本中的病原菌的检测具有重要意义。PCR标本来源不同,处理方法各异,用传统PCR检测方法不仅费时费力,而且干扰PCR扩增的物质也较多,容易出现假阴性,对于微量标本更是如此。采用本法可直接将标本加入反应孔内,通过亲和法进行标本纯化,从而不但提高了敏感性、同时也减少所需时间。具有快速、特异、敏感的特点,且重复性高。由于本发明使用的是细菌的通用引物,因此可推广至其它病原菌的检测,具有较好的临床推广价值。
(4)附图说明
图1为实施例3中福氏志贺菌型间交叉实验结果的PCR产物电泳图。
图2为实施例5中免疫捕捉法UPPCR和热变性法UPPCR检测粪便中志贺菌的比较实验PCR产物电泳图。
(5)具体实施方式
实施例1:
实验菌种:痢疾志贺菌(Shinglla dysenteriae)I型,宋氏志贺菌(Shigella sonnei),福氏志贺菌(Shigella flexneri)1a、2a、2b、3a、4、5、Y变种,鲍氏志贺菌(Shigella boydii)1。其中痢疾志贺菌I型、宋氏志贺菌、福氏志贺菌4、鲍氏志贺菌16购自江西省卫生防疫站,福氏志贺菌1a、2a、2b、3a、5、Y变种购自福建省卫生防疫站。
通用引物:由Sangon公司合成,选自细菌16S rRNA基因保守区,经鉴定为电泳纯。引物序列如下:正向引物5’-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3’逆向引向物5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’。
诊断血清:上述志贺菌属各菌诊断血清为卫生部兰州生物制品研究所产品,4步硫酸铵法提纯抗体。PCR试剂:Taq酶(MBI产品),dNTPs(Sangon产品)。
限制性内切酶:Hae III(Ferments产品)。
分子量标准:pGEM-7Zf(+)/Hae III Markers(Sangon产品)。
肉汤培养基:0.5%牛肉膏,1%蛋白胨,0.5%氯化钠,pH7.2-7.4,121℃灭菌20min,37℃摇床培养18~24h。
细菌计数:显微镜直接计数和平板计数。
iUPPCR操作步骤:
1)首先抗体包被:用pH9.6,0.01mol/L碳酸缓冲液将上述志贺菌属各菌抗体稀释为10μg/mL,分别加入酶联反应板各孔,每孔50μL,于4℃冰箱过夜,然后用pH7.4,0.01mol/LPBS-T洗板3次,每次3min。
2)封闭:10%小牛血清37℃封闭1hr后甩干。
3)免疫捕捉:每孔加入细菌溶液20μL,于37℃保温1hr,用PBS-T洗板5次,每次3min。
4)热变性释放模板:每孔加入20μL无菌双蒸水,沸水浴加热10min,吸取18μL裂解液作为PCR反应模板。
5)UPPCR:在PCR反应管中依次加入10×PCR buffer 2.5μL,MgCl2(25mmol/L)3μL,混合dNTPs(各10mmol/L)0.5μL,引物(74μmol/L)各0.085uL,Taq酶(5U/μL)0.1μL,最后加入模板至总体积25μL。混合后,94℃变性1min,51℃复性1min,70℃延伸2.5min,共循环40次。
6)PCR产物鉴定:取PCR产物5μL,与适量加样缓冲液混合,点样于2.5%的含0.5μg/mL EB的琼脂糖凝胶中,80V电泳30min。取限制性内切酶Hae III产品对PCR产物进行酶切鉴定,结果其酶切片段大小与理论值相符。
实施例2:
中和实验:同时设立中和组和对照组进行中和实验。材料及iUPPCR操作步骤均同实施例1,将痢疾志贺菌I型、宋氏志贺菌、福氏志贺菌4、鲍氏志贺菌16菌液稀释成20μL菌液中含50 CFU病原菌。中和组取20μL菌液与等体积50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL相应抗体混合,于37℃温育1hr后加于反应板中;对照组则加入20μL菌液和20μL无菌水,其余步骤不变。中和结果见表1,三组中和组均无PCR扩增产物,而相应对照组均有扩增产物。
表1:iUPPCR检测痢疾志贺菌I型、宋氏志贺菌、福氏志贺菌4、鲍氏志贺菌16的中和实验结果
中和组抗体浓度 对照组
50μg/mL 100μg/mL 200μg/mL痢疾志贺菌I型 - - - +宋氏志贺菌 - - - +福氏志贺菌4 - - - +鲍氏志贺菌16 - - - +
实施例3:iUPPCR交叉实验
1)用种特异的单价诊断血清提纯抗体进行交叉实验:材料同实施例1,以痢疾志贺氏菌I型、宋氏志贺菌、福氏志贺菌4和鲍氏志贺菌16的单价诊断血清所提抗体包被反应板,每种抗体包被4孔,分别用于捕捉4种志贺氏菌,其余步骤同实施例1,PCR产物鉴定结果表明种间无交叉反应出现(见表2)。
表2:采用特异性单价抗体捕捉的iUPPCR检测痢疾志贺菌I型、宋氏志贺菌、福氏志贺菌4和鲍氏志贺菌16的交叉实验结果
痢疾志贺菌I型 宋氏志贺菌 福氏志贺菌4 鲍氏志贺菌16抗痢疾志贺氏I型 + - - -抗宋内志贺氏 - + - -抗福氏志贺氏4 - - + -抗鲍氏志贺氏16-18 - - - +
2)用型特异的单价诊断血清提纯抗体进行交叉实验:以福氏志贺菌1型、2型、3型、4型、5型、6型单价诊断血清所提抗体包被反应板,每一种抗体包被6孔,分别用于捕捉福氏志贺菌1a、2a、3a、4、5、Y变种,其余步骤不变,PCR产物鉴定结果表明,型间无交叉反应出现(见表3)。图1为福氏志贺菌型间交叉反应实验结果的PCR产物电泳图,图1中
1:福氏志贺菌1a与抗1型抗体反应2:福氏志贺菌2a与抗1型抗体反应
3:福氏志贺菌2a与抗2型抗体反应4:福氏志贺菌3a与抗2型抗体反应
5:福氏志贺菌3a与抗3型抗体反应6:福氏志贺菌4与抗3型抗体反应
7:福氏志贺菌4与抗4型抗体反应8:福氏志贺菌5与抗4型抗体反应
9:福氏志贺菌5与抗5型抗体反应10:福氏志贺菌Y变种与抗5型抗体反应
11:福氏志贺菌Y变种与抗6型抗体反应M:pGEM-7Zf(+)/HaeIII Makers
表3:采用型特异性单价抗体捕捉的iUPPCR检测福氏志贺菌1a、2a、3a、4、5和Y变种的交叉实验结果
福氏志贺菌
1a 2a 3a 4 5 Y变种抗1型抗体 + - - - - -抗2型抗体 - + - - - -抗3型抗体 - - + - - -抗4型抗体 - - - + - -抗5型抗体 - - - - + -抗6型抗体 - - - - - -
实施例4:
实验菌种:宋氏志贺菌(Shigella sonnei)购自江西省卫生防疫站。
通用引物:同实施例1。
诊断血清:宋氏志贺菌诊断血清为卫生部兰州生物制品研究所产品,4步硫酸铵法提纯抗体。
PCR试剂:同实施例1。
分子量标准:同实施例1。
肉汤培养基:同实施例1。
细菌计数:同实施例1。
每孔加入稀释定量后的细菌20μl进行捕捉,其浓度分别为每20μL菌液中含有菌体20、100、500、1000CFU。同时采用iUPPCRT和直接裂解法UPPCR进行扩增,iUPPCR操作方法同实施例1。直接裂解法UPPCR为取细菌培养液于3500rpm离心20min收集菌体,依实验要求用双蒸水稀释细菌,沸水变性10min,12000rpm离心10min。取上清液作为模板,进行UPPCR扩增。结果两法均为阳性。
将细菌浓度定为200、100和20个CFU/400μL,均分为20份。10份用于免疫捕捉,另10份用于热变性,其余步骤不变,结果表明两法有非常显著的差异(P均<0.01)。(见表4)
表4:比较免疫捕捉法UPPCR和热变性法UPPCR检测10、5和ICFU细菌的敏感性
10 CFU细菌 5 CFU细菌 1 CFU细菌
管数 阳性数 阳性率(%) 阳性数 阳性率(%) 阳性数 阳性率(%)免疫捕捉UPPCR 10 10 100.0 10 100.0 4 40.0热变性法UPPCR 10 6 60.0 2 20.0 0 0空白对照 5 0 0 0 0 0 0P<0.01
实施例5:粪便环境模拟实验
实验菌种:痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)I型购自江西省卫生防疫站。
通用引物:同实施例1。
诊断血清:痢疾志贺菌诊断血清为卫生部兰州生物制品研究所产品,4步硫酸铵法提纯抗体。
PCR试剂:同实施例1。
限制性内切酶:同实施例1。
分子量标准:同实施例1。
肉汤培养基:同实施例1。
细菌计数:同实施例1。
粪便环境模拟标本:用无菌生理盐水将正常人粪便1g均匀悬浮,2500r/min离心10min,取上清稀释痢疾志贺菌I型,稀释后浓度为100 CFU/200μL,分别于10个反应孔中进行捕捉,其余步骤不变。取粪便环境模拟标本,同时用iUPPCR和热变性直接裂解法UPPCR检测。iUPPCR方法同实施例1,热变性法同实施例4,结果前法的10管中有8管为阳性,阳性率为80%,后法的10管中无扩增产物出现(见图3)。两者有非常显著的差异(P<0.01)。PCR产物经酶切鉴定,其片段与理论值相符。图3中:
1:pGEM-7Zf(+)/HaeIII Markers
2:免疫捕捉法UPPCR产物
3:热变性法UPPCR产物
实施例6:
通用引物:同实施例1。
诊断血清:同实施例1。
PCR试剂:同实施例1。
限制性内切酶:同实施例1。
分子量标准:同实施例1。
肉汤培养基:同实施例1。
细菌计数:同实施例1。
iUPPCR操作步骤:同实施例1。
沙门氏志贺氏琼脂(SS Agar):上海市医学化验所试剂厂产品。
污水样品采集:从厦门大学附近医院和居民区污水排放点取污水35份,每份5mL,置于无菌容器中室温静置2hr,分别取上清20μL用于捕捉和40μL用于细菌培养。
污水细菌培养:称取53克沙门氏志贺氏琼脂,加入1000mL冷蒸馏水微火煮沸使完全溶解,冷至50℃左右倾入无菌平皿中凝固后备用。取40μL污水样品涂布平皿,37℃培养24hr。
血清学鉴定:挑取无色半透明菌落,按玻片凝集实验进行血清学鉴定。
以志贺菌属各菌型特异性抗体包被反应板,检测采自厦门大学附近的污水样品35份,同时采用细菌培养结合血清型反应的检测方法比较。结果iUPPCR检测的阳性率显著高于细菌培养和血清学方法(见表5)。从表中可看出两法有非常显著的差异(P<0.01),同时随机对5份阳性产物进行酶切鉴定,结果与理论片段长度一致。
表5采用iUPPCR和细菌培养结合血清学方法检测35份污水样品的阳性率比较
免疫捕捉法UPPCR 细菌培养和血清学方法
阳性数 阳性率(%) 阳性数 阳性率在(%)痢疾志贺菌I型 2 5.7 0 0.0痢疾志贺菌II型 0 0.0 0 0.0福氏志贺菌1型 0 0.0 0 0.0福氏志贺菌2型 15 42.9 5 14.3福氏志贺菌3型 3 8.6 0 0.0福氏志贺菌4型 0 0.0 0 0.0福氏志贺菌5型 0 0.0 0 0.0福氏志贺菌6型 0 0.0 0 0.0宋氏志贺菌 3 8.6 0 0.0鲍氏志贺菌1-6 0 0.0 0 0.0鲍氏志贺菌7-11 0 0.0 0 0.0鲍氏志贺菌12-15 0 0.0 0 0.0鲍氏志贺菌16-18 0 0.0 0 0.0合计 23 65.8 5 14.3*P<0.0
Claims (4)
1、用于检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法,其特征在于操作步骤如下:
1)抗体包被:采用pH9.6,0.01mol/L碳酸缓冲液,将针对各种细菌的特异性抗体配制成抗体含量为1~10μg/mL的溶液,将溶液分别包被至固相载体上,每份50μL,于4℃下过夜,然后用pH7.4,0.01mol/L磷酸盐-吐温缓冲液(PBS-T)洗板3次,每次3~5min;
2)封闭:每份加入50μL10%小牛血清,36~38℃封闭1hr,甩干;
3)免疫捕捉:每份加入细菌溶液20~40μL,于36~38℃温育1hr,用PBS-T洗液洗板5次,每次3~5min;
4)热变性释放模板:每份加入20~40μL无菌双蒸水,沸水浴加热8~10min,吸取18~36μL裂解液作为PCR反应模板;
5)通用引物PCR(UPPCR):在PCR反应管中依次加入10×PCR缓冲液2.5μL,25mmol/L的MgCl23μL,混合dNTPs(各10mmol/L)0.5μL,74μmol/L的引物0.085μL,5U/μL的Tag酶0.1μL,最后加入模板至总体积25~50μL,混合后,94℃变性1min,51℃复性1min,70℃延伸2.5min,共循环40次;所说的引物为通用引物,选自细菌16S rRNA基因保守区,引物序列如下:正向引物5’-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3,逆向引物5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’;
6)PCR产物鉴定:取PCR产物5μL,与适量加样缓冲液混合,点样于0.5μg/mL溴化乙啶(EB)的2.5%琼脂糖凝胶中,80V电泳30min,观察结果。
2.如权利要求1所述的用于检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法,其特征在于步骤4热变性释放模板中无菌双蒸水每份所加体积与步骤3免疫捕捉中每份所加细菌溶液体积一致。
3.如权利要求1所述的用于检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法,其特征在于所说的固相载体为酶联反应板或塑料反应小管。
4.如权利要求3所述的用于检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法,其特征在于所说的固相载体为酶联反应板。
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