CN100465616C - 活菌微量检测方法 - Google Patents
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Abstract
活菌微量检测方法，涉及一种病原性活菌，提供一种微量快速检测病原性活菌的方法。步骤为免疫捕捉，将针对病原菌的特异性抗体包被至已经预加碳酸缓冲液的固相载体各孔中静置或孵育，用含有非离子型去污剂的磷酸盐-吐温缓冲液洗板；加入小牛血清封闭甩干；加入细菌溶液，温育得病原菌；捕捉到病原菌后，在固相载体的各孔中加入培养基，培养后离心，丢弃上清，加入无菌双蒸水混匀作为PCR反应模板；取无菌的新枪头分别吸加10×PCR缓冲液，dNTP，MgCl2溶液，两条引物，Taq酶及PCR反应模板于PCR管中心至管底；扩增后取PCR产物电泳上样缓冲液混合，点样于琼脂糖凝胶中电泳，观察结果。快速简便，高效灵敏。
Description
技术领域
本发明涉及一种病原性活菌，尤其是涉及一种病原性活菌的微量快速检测方法。
背景技术
病原菌严重危害人们身体健康和工农业生产。快速检测是控制其所引起病害的必要前提。细菌的检测方法很多，其目的均为确定样本中是否有病原菌以及这些病原菌是否有病原性。由于具有病原性的细菌往往是活的，因此确定待检标本中的细菌是否有活性具有特别重要的意义。采用传统的分离培养方法可以确定待检标本中的细菌是否具有活性，但费时费力，且效率低下，特别是在快速检测方面显示出明显的缺陷。近年来，PCR(聚合酶链式反应)技术已经有效地应用于病原菌的微量快速检测，但这些以PCR为基础衍生出来的快速诊断技术并不能鉴别活菌和死菌。我们(见中国专利ZL02101983.5，用于检测细菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法)设计利用抗体特异性识别待检菌，再采用细菌16S rRNA基因进行通用引物PCR扩增(UPPCR)，建立了通用引物免疫捕捉法PCR技术，实现了快速特异地检测混合物中病原菌的目的。该专利将抗体特异性引入PCR系统，实现了采用通用引物检测细菌的目的，但亦存在不能区分活菌和死菌的不足之处。
发明内容
本发明的目的在于针对采用通用引物免疫捕捉法PCR技术检测细菌时存在不能区分活菌与死菌的不足之处，提供一种微量快速检测病原性活菌的方法。
本发明采用的技术方案是：首先，利用抗体特异性捕捉病原菌；然后，将捕捉到的病原菌在无菌的新鲜LB培养基中培养1-2h，取培养物按直接热变性法提取模板，如待检样本中无活菌则培养液中无法提取到细菌模板，如有则可以获取该病原菌的模板；最后，利用16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，得到待检样本中的该基因片段分析以确定该病原菌的存在。
本发明的具体步骤如下：
1)免疫捕捉：
将1～1000μg/mL，最好为500μg/mL的针对病原菌的特异性抗体包被至已经预加每孔40～300μl，最好为50μl；pH为9.2～10.8，最好为pH9.6，浓度为0.01～0.1mol/L，最好为0.01mol/L的碳酸缓冲液的固相载体各孔中，静置或者孵育，然后用含有0.05％～3％，最好为0.05％的非离子型去污剂；pH为6.4～7.6，最好pH为7.4的磷酸盐—吐温缓冲液(PBS-T)洗板至少1次；每孔加入至少50μL 10％小牛血清，37℃封闭至少30min，甩干；每孔加入细菌溶液50～300μl，温育得到被捕捉于固相载体上的与抗体相应的病原菌；
2)制备被捕捉病原菌再培养及PCR反应模板：
用免疫捕捉法捕捉到病原菌后，在固相载体的各孔中均加入新鲜灭菌LB培养基50～300μl，于37℃分批培养后把培养物分别吸到离心管中离心，丢弃上清，加入无菌双蒸水混匀作为PCR反应模板；
3)UPPCR扩增及检测：
取无菌的新枪头分别吸加10×PCR缓冲液，dNTP(脱氧核苷酸混合物)，MgCl2溶液，两条引物(上游引物：5’-AAACTCAAAGGAATTGAC-3’；下游引物：5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’)，Taq酶及步骤2)中得到的PCR反应模板于各PCR管中，各试剂充分混匀并离心，将PCR反应体系离心至管底；将加好反应体系后的薄壁PCR管置于PCR扩增仪中，扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸2.5min，共40个循环；72℃再延伸10min。扩增后取PCR产物至少5μl，与1/10～1/5体积的电泳上样缓冲液混合，点样于含0.1～1μg/ml，最好0.5μg/ml溴化乙啶(EB)的0.8％～1.5％琼脂糖凝胶中，80～120V电泳，随后在紫外光下观察结果并拍照记录。
在步骤1)中，所述的针对病原菌的特异性抗体选自型特异性抗体或群特异性抗体，碳酸缓冲液的固相载体最好选自96孔板，酶联条，聚苯乙烯或聚氯乙烯材料等。所述的静置其温度最好为4℃，静置时间最好为18h，孵育的温度最好为37℃，孵育的时间最好为2～3h。所述的非离子型去污剂最好选自吐温-20，Triton，NP40等。所述的温育的温度为37℃，温育的时间为0.5～1.5h。
在步骤2)中，所述的分批培养最好分3批培养，培养时间分别为1h，2h和3h，到达培养时间后把培养物分别吸到离心管中于3000～10000rpm离心2～5min，丢弃上清，加入10μl无菌双蒸水混匀作为PCR反应模板。
在步骤3)中，所述的10×PCR缓冲液的终浓度为1×PCR缓冲液，dNTP终浓度为每种脱氧核苷酸各0.2mM，MgCl2溶液终浓度为3mM。所述的缓冲液含0.25％溴酚蓝的40％蔗糖溶液混合。所述的电泳的时间最好为30min～1h。
本发明利用抗体的特异性捕捉病原菌，然后将捕捉到的病原菌在无菌的新鲜LB培养基中培养，由于只有活菌才有生长繁殖的能力，因此只有取活菌培养物采用直接热变性法才可以提取到阳性模板。最后利用16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，得到待检样本中所有细菌的该基因片段分析以确定是否存在该病原菌活菌，从而达到微量、快速检测病原性活菌的目的。
与采用通用引物免疫捕捉的方法相比，本发明的突出优点在于快速、微量判断待检物中是否存在活菌。对于病原菌检测，基于生化特性的传统分离培养方法约需72h，而本发明只需6～7h，是一种快速简便的方法。另一方面，对于低至含有10CFU(菌落形成单位)菌量的样品也能够准确检测到，是一种高效灵敏的方法。
附图说明
图1为免疫捕捉后再培养UPPCR技术和免疫捕捉法UPPCR技术同步检测结果的产物图谱。在图1中，M，分子量标准；1-3，10CFU大肠杆菌0157∶H7组捕捉后分别培养1h，2h和3h的培养物UPPCR检测产物；4-5，100CFU大肠杆菌0157∶H7组捕捉后分别培养1h和2h的培养物UPPCR检测产物；6，大肠杆菌0157∶H7死菌组捕捉后培养3h的培养物UPPCR检测产物；7-9，大肠杆菌0157∶H710CFU组，100CFU组和死菌组进行免疫捕捉法UPPCR检测产物；10，未加大肠杆菌0157∶H7进行通用引物免疫捕捉法PCR检测产物；11，未加大肠杆菌0157∶H7单克隆抗体进行通用引物免疫捕捉法PCR检测产物；12，UPPCR阴性对照。
图2为免疫捕捉UPPCR方法特异性检测结果的产物图谱。在图2中，M，分子量标准；1，大肠杆菌0157∶H7(85-988)免疫捕捉UPPCR方法检测产物；2，大肠杆菌0∶55(EPEC)免疫捕捉UPPCR方法检测产物；3，大肠杆菌0157∶H7(88-2364)免疫捕捉UPPCR方法检测产物；4，大肠杆菌0157∶H7(EDL-933)免疫捕捉UPPCR方法检测产物；5，大肠杆菌1392(ETEC)免疫捕捉UPPCR方法检测产物；6，未加细菌进行免疫捕捉UPPCR方法检测的阴性对照；7，未加大肠杆菌0157∶H7单克隆抗体进行免疫捕捉UPPCR方法检测的阴性对照；8，UPPCR阴性对照。
图3为免疫捕捉后再培养UPPCR技术检测多种病原菌的产物图谱1。在图3中，M，分子量标准；1，金黄色葡萄球菌捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；2，金黄色葡萄球菌灭活组捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；3，铜绿假单胞菌捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；4，铜绿假单胞菌灭活组捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；5，荧光假单胞菌捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；6，荧光假单胞菌灭活组捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；7，嗜水气单胞菌捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；8，嗜水气单胞菌灭活组捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；9，副溶血弧菌捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；10，副溶血弧菌灭活组捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；11，美人鱼发光杆菌捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；12，美人鱼发光杆菌灭活组捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物。
图4为免疫捕捉后再培养UPPCR技术检测多种病原菌的产物图谱2。在图4中，M，分子量标准；1，鳗弧菌捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；2，鳗弧菌灭活组捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；3，温和气单胞菌捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；4，温和气单胞菌灭活组捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；5，福氏志贺氏菌捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；6，福氏志贺氏菌灭活组捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；7，痢疾志贺氏菌捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；8，痢疾志贺氏菌灭活组捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；9，鲍氏志贺氏菌捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；10，鲍氏志贺氏菌灭活组捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；11，宋内氏志贺氏菌捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物；12，宋内氏志贺氏菌灭活组捕捉后培养2h的培养物UPPCR检测产物。
具体实施方式
实施例1
1、免疫捕捉：实验采用大肠杆菌0157:H7(Escherichia coli 0157：H7，85-988)、大肠杆菌0157:H7(E.coli 0157：H7，88-2364)、大肠杆菌0157:H7(E.coli 0157：H7，EDL-933)，均为本实验室保存菌种。将大肠杆菌0157∶H7单克隆抗体用pH9.6，0.01mol/L碳酸缓冲液稀释分别包被至酶联条各孔中(500μg/mL)，每孔50μl，于4℃冰箱过夜；然后用pH7.4，含0.05％吐温-20的0.01mol/L磷酸盐—吐温缓冲液(PBS-T)洗板3次，每次3～5min；每孔加入50μL 10％小牛血清，37℃封闭1h，甩干；按照加入细菌的数量分为10CFU(菌落形成单位)、100CFU和死菌三组，每孔加入细菌溶液并用生理盐水补足至50μl，于37℃温育1h；得到被捕捉于固相载体上的与抗体相应的病原菌。
2、制备被捕捉病原菌再培养及PCR反应模板：用免疫捕捉法捕捉后，加入新鲜灭菌LB培养基50μl，37℃分别培养1h，2h和3h，把培养物分别吸到离心管中于10000rpm离心2min，丢弃上清，加入10μl无菌双蒸水后混匀作为PCR反应模板。
3、UPPCR及检测：取无菌的新枪头按顺序吸加2.5μl10×缓冲液，0.5μl dNTP(核苷酸混合物，各10mM)，3μl MgCl2(25mM)，每条引物各0.5μl(上游引物：5’-AAACTCAAAGGAATTGAC-3’；下游引物：5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’，浓度均为25μM)，0.2μl Taq酶(5U/μl)，及10μl模板于各PCR管中，最后以无菌双蒸水补足至体积为25μl，各试剂充分混匀并稍加离心后收集于管底；将加样后的薄壁PCR管置于PCR扩增仪中，扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸2.5min，共40个循环；72℃再延伸10min。扩增后取PCR产物5μl，与1μl加样缓冲液(0.25％溴酚蓝，40％蔗糖水溶液)混合，点样于含0.5μg/mL溴化乙啶(EB)的1.5％琼脂糖凝胶中，80V电压下电泳1h，随后在紫外光下观察结果并拍照记录。检测结果见附图1。
实施例2
1、免疫捕捉：实验采用大肠杆菌0157:H7(E.coli 0157：H7，85-988)、大肠杆菌0157:H7(E.coli 0157：H7，88-2364)、大肠杆菌0157:H7(E.coli 0157：H7，EDL-933)、大肠杆菌0:55(E.coli 0:55，EPEC)、大肠杆菌1392(E.coli 1392，ETEC)，均为本实验室保存菌种。将大肠杆菌0157∶H7单克隆抗体用pH9.2，0.01mol/L碳酸缓冲液稀释分别包被至酶联反应96孔板各孔中(50μg/mL)，每孔100μl，于4℃冰箱过夜；然后用pH7.6，含0.05％吐温-20的0.01mol/L磷酸盐—吐温缓冲液(PBS-T)洗板3次，每次3～5min；每孔加入100μL10％小牛血清，37℃封闭1h，甩干；每孔加入10CFU(菌落形成单位)的细菌溶液并用生理盐水补足至100μl，于37℃温育1h；得到被捕捉于固相载体上的与抗体相应的病原菌。
2、制备模板：用免疫捕捉法捕捉后，将孔板用PBS-T洗板3次，每次3～5min，甩干；每孔加入40μl无菌双蒸水，把孔板沸水浴10min，在孔板剩余液体中吸取10μl作为UPPCR扩增的模板。
3、UPPCR及检测同实施例1。检测结果见附图2。
实施例3
1、免疫捕捉：实验采用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，为本实验室保存菌种。将金黄色葡萄球菌抗血清用pH10.8，0.05mol/L碳酸缓冲液稀释分别包被至酶联反应酶联条各孔中(100μg/mL)，每孔150μl，于4℃冰箱过夜；然后用pH6.4，含3％吐温-20的0.01mol/L磷酸盐—吐温缓冲液(PBS-T)洗板3次，每次3～5min；每孔加入300μL10％小牛血清，37℃封闭1h，甩干；每孔加入100CFU细菌溶液并用生理盐水补足至300μl，于37℃温育30min；得到被捕捉于固相载体上的与抗体相应的病原菌。
2、制备被捕捉病原菌再培养及PCR反应模板：用免疫捕捉法捕捉后，加入新鲜灭菌LB培养基100μl，37℃培养2h，把培养物分别吸到离心管中于3000rpm离心5min，丢弃上清，加入10μl无菌双蒸水后混匀作为PCR反应模板。
3、UPPCR及检测：取无菌的新枪头按顺序吸加2.5μl 10×缓冲液，0.5μl dNTP(核苷酸混合物，各10mM)，3μlMgCl2(25mM)，每条引物各0.5μl(上游引物：5’-AAACTCAAAGGAATTGAC-3’；下游引物：5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’，浓度均为25μM)，0.2μl Taq酶(5U/μl)，及10μl模板于各PCR管中，最后以无菌双蒸水补足至体积为25μl，各试剂充分混匀并稍加离心后收集于管底；将加样后的薄壁PCR管置于PCR扩增仪中，扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸2.5min，共40个循环；72℃再延伸10min。扩增后取PCR产物7μl，与1μl加样缓冲液(0.25％溴酚蓝，40％蔗糖水溶液)混合，点样于含0.5μg/mL溴化乙啶(EB)的0.8％琼脂糖凝胶中，120V电压下电泳30min，随后在紫外光下观察结果并拍照记录。检测结果见附图3。
实施例4
1、免疫捕捉：实验采用铜绿假单胞菌(绿脓杆菌，Pseudomonas aeruginosa)，为本实验室保存菌种。将铜绿假单胞菌抗血清用pH9.9，0.1mol/L碳酸缓冲液稀释分别包被至酶联反应96孔板各孔中(150μg/mL)，每孔200μl，于4℃冰箱过夜；然后用pH7.0，含2％吐温-20的0.01mol/L磷酸盐—吐温缓冲液(PBS-T)洗板3次，每次3～5min；每孔加入200μL 10％小牛血清，37℃封闭30min，甩干；每孔加入100CFU细菌溶液并用生理盐水补足至200μl，于37℃温育1h；得到被捕捉于固相载体上的与抗体相应的病原菌。
2、制备被捕捉病原菌再培养及PCR反应模板：用免疫捕捉法捕捉后，加入新鲜灭菌LB培养基200μl，37℃培养2h，把培养物分别吸到离心管中于5000rpm离心3min，丢弃上清，加入10μl无菌双蒸水后混匀作为PCR反应模板。
3、UPPCR及检测同实施例1。检测结果见附图3。
实施例5
1、免疫捕捉：实验采用荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，为本实验室保存菌种。将荧光假单胞菌抗血清用pH10.4，0.08mol/L碳酸缓冲液稀释分别包被至酶联反应酶联条各孔中(400μg/mL)，每孔250μl，于37℃孵育3h；然后用pH6.8，含1.5.％ Triton的0.01mol/L磷酸盐—吐温缓冲液(PBS-T)洗板3次，每次3～5min；每孔加入250μL 10％小牛血清，37℃封闭1h，甩干；每孔加入100CFU细菌溶液并用生理盐水补足至250μl，于37℃温育45min；得到被捕捉于固相载体上的与抗体相应的病原菌。
2、制备被捕捉病原菌再培养及PCR反应模板：用免疫捕捉法捕捉后，加入新鲜灭菌LB培养基300μl，37℃培养2h，把培养物分别吸到离心管中于10000rpm离心2min，丢弃上清，加入10μl无菌双蒸水后混匀作为PCR反应模板。
3、UPPCR及检测同实施例3。检测结果见附图3。
实施例6
1、免疫捕捉：实验采用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，为本实验室保存菌种。将嗜水气单胞菌抗血清用pH10.2，0.03mol/L碳酸缓冲液稀释分别包被至酶联反应酶联条各孔中(600μg/mL)，每孔80μl，于4℃冰箱过夜；然后用pH7.0，含2.25％吐温-20的0.01mol/L磷酸盐—吐温缓冲液(PBS-T)洗板3次，每次3～5min；每孔加入80μL 10％小牛血清，37℃封闭45min，甩干；每孔加入100CFU细菌溶液并用生理盐水补足至80μl，于37℃温育45min；得到被捕捉于固相载体上的与抗体相应的病原菌。
2、制备被捕捉病原菌再培养及PCR反应模板：用免疫捕捉法捕捉后，加入新鲜灭菌LB培养基250μl，37℃培养2h，把培养物分别吸到离心管中于10000rpm离心2min，丢弃上清，加入10μl无菌双蒸水后混匀作为PCR反应模板。
3、UPPCR及检测同实施例1。检测结果见附图3。
实施例7
1、免疫捕捉：实验采用副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，为本实验室保存菌种。将副溶血弧菌抗血清用pH10.6，0.07mol/L碳酸缓冲液稀释分别包被至酶联反应酶联条各孔中(700μg/mL)，每孔240μl，于37℃孵育2.5h；然后用pH7.3，含0.35％ Triton的0.01mol/L磷酸盐—吐温缓冲液(PBS-T)洗板3次，每次3～5min；每孔加入240μL 10％小牛血清，37℃封闭1h，甩干；每孔加入100CFU细菌溶液并用生理盐水补足至240μl，于37℃温育1h；得到被捕捉于固相载体上的与抗体相应的病原菌。
2、制备被捕捉病原菌再培养及PCR反应模板：用免疫捕捉法捕捉后，加入新鲜灭菌LB培养基80μl，37℃培养2h，把培养物分别吸到离心管中于4000rpm离心5min，丢弃上清，加入10μl无菌双蒸水后混匀作为PCR反应模板。
3、UPPCR及检测同实施例1。检测结果见附图3。
实施例8
1、免疫捕捉：实验采用美人鱼发光杆菌(Photobacterium Damsela)，为本实验室保存菌种。将美人鱼发光杆菌抗血清用pH9.8，0.06mol/L碳酸缓冲液稀释分别包被至酶联反应96孔板各孔中(50μg/mL)，每孔180μl，于4℃冰箱过夜；然后用pH6.5，含1.25％吐温-20的0.01mol/L磷酸盐—吐温缓冲液(PBS-T)洗板3次，每次3～5min；每孔加入180μL 10％小牛血清，37℃封闭30min，甩干；每孔加入100CFU细菌溶液并用生理盐水补足至180μ1，于37℃温育30min；得到被捕捉于固相载体上的与抗体相应的病原菌。
2、制备被捕捉病原菌再培养及PCR反应模板：用免疫捕捉法捕捉后，加入新鲜灭菌LB培养基120μl，37℃培养2h，把培养物分别吸到离心管中于6000rpm离心3min，丢弃上清，加入10μl无菌双蒸水后混匀作为PCR反应模板。
3、UPPCR及检测同实施例3。检测结果见附图3。
实施例9
1、免疫捕捉：实验采用鳗弧菌(Vibrio anguillarum)，为本实验室保存菌种。将鳗弧菌抗血清用pH10.3，0.09mol/L碳酸缓冲液稀释分别包被至酶联反应酶联条各孔中(1000μg/mL)，每孔120μl，于4℃冰箱过夜；然后用pH7.2，含1.8％吐温-20的0.02mol/L磷酸盐—吐温缓冲液(PBS-T)洗板3次，每次3～5min；每孔加入120μL 10％小牛血清，37℃封闭1h，甩干；每孔加入100CFU细菌溶液并用生理盐水补足至120μl，于37℃温育1h；得到被捕捉于固相载体上的与抗体相应的病原菌。
2、制备被捕捉病原菌再培养及PCR反应模板：用免疫捕捉法捕捉后，加入新鲜灭菌LB培养基60μl，37℃培养2h，把培养物分别吸到离心管中于3500rpm离心5min，丢弃上清，加入10μl无菌双蒸水后混匀作为PCR反应模板。
3、UPPCR及检测同实施例3。检测结果见附图4。
实施例10
1、免疫捕捉：实验采用温和气单胞菌(Aeromonas sobria)，为本实验室保存菌种。将温和气单胞菌抗血清用pH10.5，0.06mol/L碳酸缓冲液稀释分别包被至酶联反应酶联条各孔中(900μg/mL)，每孔70μl，于4℃冰箱过夜；然后用pH6.9，含0.75％吐温-20的0.01mol/L磷酸盐—吐温缓冲液(PBS-T)洗板3次，每次3～5min；每孔加入70μL 10％小牛血清，37℃封闭1h，甩干；每孔加入100CFU细菌溶液并用生理盐水补足至70μl，于37℃温育1h；得到被捕捉于固相载体上的与抗体相应的病原菌。
2、制备被捕捉病原菌再培养及PCR反应模板：用免疫捕捉法捕捉后，加入新鲜灭菌LB培养基240μl，37℃培养2h，把培养物分别吸到离心管中于9000rpm离心2min，丢弃上清，加入10μl无菌双蒸水后混匀作为PCR反应模板。
3、UPPCR及检测同实施例1。检测结果见附图4。
实施例11
1、免疫捕捉：实验采用福氏志贺氏菌1a亚型(Shigella flexneri subtype la)福氏志贺氏菌2a亚型(Sh.flexneri subtype 2a)福氏志贺氏菌2b亚型(Sh.flexneri subtype2b)福氏志贺氏菌3a亚型(Sh.flexneri subtype 3a)福氏志贺氏菌5型(Sh.flexneriserotype 5)，痢疾志贺氏菌(Sh.dysenteriae)，鲍氏志贺氏菌(Sh.boydii)，宋内氏志贺氏菌(Sh.sonnei)，为本实验室保存菌种。将金黄色葡萄球菌抗血清用pH9.6，0.01mol/L碳酸缓冲液稀释分别包被至酶联反应96孔板各孔中(800μg/mL)，每孔60μl，于4℃冰箱过夜；然后用pH7.4，含0.05％吐温-20的0.01mol/L磷酸盐—吐温缓冲液(PBS-T)洗板3次，每次3～5min；每孔加入60μL 10％小牛血清，37℃封闭1h，甩干；每孔加入100CFU细菌溶液并用生理盐水补足至60μl，于37℃温育1h；得到被捕捉于固相载体上的与抗体相应的病原菌。
2、制备被捕捉病原菌再培养及PCR反应模板：用免疫捕捉法捕捉后，加入新鲜灭菌LB培养基50μl，37℃培养2h，把培养物分别吸到离心管中于7000rpm离心3min，丢弃上清，加入10μl无菌双蒸水后混匀作为PCR反应模板。
3、UPPCR及检测同实施例1。检测结果见附图4。
Claims (9)
1、活菌微量检测方法，其特征在于其步骤为：
1)免疫捕捉：
将1～1000μg/mL的针对病原菌的特异性抗体包被至已经预加每孔40～300μl，pH为9.2～10.8，浓度为0.01～0.1mol/L的碳酸缓冲液的固相载体各孔中，静置或者孵育，然后用含有0.05％～3％的非离子型去污剂，pH为6.4～7.6的磷酸盐—吐温缓冲液洗板至少1次；每孔加入至少50μL10％小牛血清，37℃封闭至少30min，甩干；每孔加入细菌溶液50～300μl，温育得到被捕捉于固相载体上的与抗体相应的病原菌；
2)制备被捕捉病原菌再培养及PCR反应模板：
用免疫捕捉法捕捉到病原菌后，在固相载体的各孔中均加入新鲜灭菌LB培养基50～300μl，于37℃分批培养后把培养物分别吸到离心管中离心，丢弃上清，加入无菌双蒸水混匀作为PCR反应模板；
3)UPPCR扩增及检测：
取无菌的新枪头分别吸加10×PCR缓冲液，dNTP，MgCl2溶液，两条引物，Taq酶及步骤2)中得到的PCR反应模板于各PCR管中，各试剂充分混匀并离心，将PCR反应体系离心至管底，两条引物为：
上游引物5’-AAACTCAAAGGAATTGAC-3’，
下游引物5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’；
将加好反应体系后的薄壁PCR管置于PCR扩增仪中，扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸2.5min，共40个循环，72℃再延伸10min；扩增后取PCR产物至少5μl，与1/10～1/5体积的电泳上样缓冲液混合，点样于含0.1～1μg/ml溴化乙啶的0.8％～1.5％琼脂糖凝胶中，80～120V电泳，随后在紫外光下观察结果并拍照记录。
2、如权利要求1所述的活菌微量检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述的针对病原菌的特异性抗体选自型特异性抗体或群特异性抗体。
3、如权利要求1所述的活菌微量检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述的碳酸缓冲液的固相载体选自96孔板，酶联条，聚苯乙烯或聚氯乙烯材料。
4、如权利要求1所述的活菌微量检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述的静置其温度为4℃，静置时间为18h，孵育的温度为37℃，孵育的时间为2～3h。
5、如权利要求1所述的活菌微量检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述的非离子型去污剂选自吐温-20，Triton或NP40。
6、如权利要求1所述的活菌微量检测方法，其特征在于在步骤1)中，所述的温育的温度为37℃，温育的时间为0.5～1.5h。
7、如权利要求1所述的活菌微量检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述的分批培养分3批培养，培养时间分别为1h，2h和3h，到达培养时间后把培养物分别吸到离心管中于3000～10000rpm离心2～5min，丢弃上清，加入10μl无菌双蒸水混匀作为PCR反应模板。
8、如权利要求1所述的活菌微量检测方法，其特征在于在步骤3)中，所述的10×PCR缓冲液的终浓度为1×PCR缓冲液，dNTP终浓度为每种脱氧核苷酸各0.2mM，MgCl2溶液终浓度为3mM。
9、如权利要求1所述的活菌微量检测方法，其特征在于在步骤3)中，所述的电泳的时间为30min～1h。
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