CN117618669A - 一种可原位聚合的含有活性成分的胶原注射剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及可原位聚合药物技术领域，具体地说是一种可原位聚合的含有活性成分的胶原注射剂及其制备方法。胶原注射剂包括胶原蛋白、人参皂甙Rh1、川芎嗪、淫羊藿苷、EDTA。其制备方法包括：S1：在低温条件下，以酸性溶液溶解胶原，得到胶原溶液；S2：在低温条件下，以中性透析液对步骤S1得到的胶原溶液进行透析，得到中性胶原溶液；S3：将步骤S2得到的中性胶原溶液与人参皂甙Rh1、川芎嗪、淫羊藿苷混合、得到含有活性成分的胶原注射剂。同现有技术相比，胶原溶液中添加了活性成分能在局部注射部位形成药物库，延长药物作用时间，减少给药次数；胶原组合物选用生物相容性良好的原材料，具有良好的热稳定、凝胶强度和细胞相容性。
Description
技术领域
本发明涉及可原位聚合药物技术领域，具体地说是一种可原位聚合的含有活性成分的胶原注射剂及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白是脊椎动物结缔组织中最丰富的结构蛋白，由于其结构和非结构作用，是在医疗保健和化妆品等健康相关领域应用最广泛的多功能生物材料之一。胶原蛋白独特的四级结构赋予其优异的生物相容性、生物降解性和低免疫原性等，使其在医美及组织修复等领域得到了大量工业化应用。同时，用于构建胶原制品的胶原常以胶原分子形式存在，胶原分子在一定条件下可以组装成微纤维并进一步形成胶原纤维，构成胶原特有的四分之一错列排布，进而在一定条件下可制备得到各种形式的胶原基材料。
可原位聚合的胶原作为一种可注射的支架，可用于填充任何形状和尺寸的缺损，并且带来的创伤较小，含有大量的水分，可使溶于其中的物质以及低相对分子质量的物质从其间渗透扩散，以支持营养物质和细胞代谢产物的交换。
然而现有的可原位聚合的胶原注射剂释放速度较快，需要多次给药。注射剂中需要进一步添加活性成分以提高对于软骨组织的治疗效果，促进软骨组织的再生。
发明内容
本发明为克服现有技术的不足，提供一种可原位聚合的含有活性成分的胶原注射剂及其制备方法。
为实现上述目的，提供一种可原位聚合的含有活性成分的胶原注射剂，其特征在于：包括胶原蛋白、人参皂甙Rh1、川芎嗪、淫羊藿苷、EDTA。人参皂甙Rh1的来源为五加科植物人参的干燥根，分子式为C36H62O9，CAS号为63223-86-9；川芎嗪为川芎中的活性成分，分子式为C8H12N2，CAS号为1124-11-4；淫羊藿苷是淫羊藿的干燥茎叶提取物，分子式为C33H40O15，CAS号为489-32-7。
所述胶原注射剂具有260-360mmol/kg的渗透压，PH为6.0-8.0。
所述胶原蛋白的浓度为10mg/mL-35mg/mL，人参皂甙Rh1的浓度为0.1ug/mL-1.0ug/mL，川芎嗪的浓度为5ug/mL -25ug/mL，淫羊藿苷的浓度为10umol/L -100umol/L，EDTA的浓度为0.01-0.1%。
所述胶原蛋白的浓度为30mg/mL，人参皂甙Rh1的浓度为0.6ug/mL，川芎嗪的浓度为10ug/mL，淫羊藿苷的浓度为25umol/mL，EDTA的浓度为0.05%。
所述胶原注射剂还包括种子细胞。
本发明还提供一种可原位聚合的含有活性成分的胶原注射剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：在低温条件下，以酸性溶液溶解胶原，得到胶原溶液；
S2：在低温条件下，以中性透析液对步骤S1得到的胶原溶液进行透析，得到中性胶原溶液；
S3：将步骤S2得到的中性胶原溶液与人参皂甙Rh1、川芎嗪、淫羊藿苷混合，得到含有活性成分的胶原注射剂。
所述步骤S1中的低温条件为2℃-20℃；所述酸性溶液选自盐酸水溶液、乙酸水溶液和磷酸水溶液中的至少一种，酸性溶液的摩尔浓度为0.01mol/L-0.5mol/L；所述胶原为以哺乳动物、鱼类、两栖动物的皮肤、跟腱组织中的至少一种为原料提取的胶原，胶原的浓度为10mg/mL-65mg/ml。
所述步骤S2中的低温条件为为2℃-20℃；所述中性透析液包括磷酸盐缓冲液、EDTA中的至少一种；采用截留分子量1000-10000道尔顿的透析袋进行透析；透析时间为72h-120h，当透析袋内外PH相同时，可判定透析过程已充分进行，透析充分后的胶原溶液PH为6.0-8.0。
将步骤S3制得的含有活性成分的胶原注射液与种子细胞混合，具体包括以下步骤：
S4：取得人脐带间充质干细胞，使用胰酶消化后以细胞密度5×103个细胞/cm2传代培养；
S5：取生长良好的人脐带间充质干细胞制成密度为5×107个/mL的种子细胞悬液；
S6：将步骤S3制得的含有活性成分的胶原注射液与步骤S5制得的种子细胞悬液混合均匀。
步骤S6混合后的溶液中，人参皂甙Rh1终浓度为0.6ug/mL，川芎嗪终浓度为10ug/mL，淫羊藿苷终浓度为25umol/L，胶原蛋白终浓度为30mg/mL，种子细胞密度为5×106个/mL。
本发明同现有技术相比，具有以下优点：
1、该胶原溶液中添加了活性成分能在局部注射部位形成药物库，延长药物作用时间，减少给药次数，提高患者依从性等。人参皂甙具有生长因子和类生长因子样活性，能在体内外协同生长因子作用刺激骨髓干细胞增殖并诱导其定向分化。川芎嗪对关节软骨传导性损伤的修复过程有一定的作用，主要是改善受损软骨细胞萎缩及肿胀变性情况。淫羊藿苷能够促进软骨细胞的增殖和软骨生成相关基因的表达，减少细胞外基质的降解。人参皂甙Rh1、川芎嗪和淫羊藿苷能够相互协同作用于软骨损伤部位，能够促进软骨细胞的增殖和软骨生成相关基因的表达并改善组织的炎症反应，对调节细胞生长、增殖和分化起着重要作用，促进缺损部位的再生，添加EDTA能够减少胶原蛋白的降解，延长对软骨缺损部位的修复时间。
2、胶原组合物选用生物相容性良好的原材料，组分中不包含有化学凝胶中所添加的引发剂，在生理PH下是可注射的，且在软组织缺陷部位即可原位聚合形成凝胶块，具有良好的热稳定、凝胶强度和细胞相容性。
3、在低温条件下，诱导胶原分子纤维化自组装，有效降低了胶原分子自组装的温度阈值，拓宽了胶原纤维化自组装特征分子行为的应用范围。
附图说明
图1为实施例1制得的胶原溶液在37℃原位凝胶化图片。
图2为种子细细胞包埋在胶原蛋白凝胶内培养5d后的细胞荧光显微照片。
实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：通过PBS缓冲液进行透析随后调节PH制备可原位聚合胶原注射剂
（1）称取适量无菌猪皮胶原蛋白样品，在2-8℃的温度条件下，用0.5mol/L乙酸配制成猪皮胶原蛋白浓度为35mg/mL的样品100mL。
（2）将胶原蛋白溶液装入截留分子量为8000-4000道尔顿透析袋中，在2-8 ℃的温度条件下，用0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液透析，透析持续120h，每天将PH值2.5调整到最终PH值7.4，此时透析袋内外PH相同。
（3）收集最终的透明粘性胶原蛋白溶液并离心以除去气泡。最终的透明粘性胶原蛋白溶液的PH为7.4，在室温下未形成凝胶。
（4）上述步骤（1）、（2）、（3）均是进行无菌操作。
（5）将步骤（3）得到的胶原蛋白溶液放入37℃金属浴中孵育，观察胶原蛋白凝胶的出现。如图1所示，透明粘性胶原蛋白溶液在5min内形成了白色不透明的胶原蛋白凝胶。
（6）将步骤（3）得到的胶原蛋白溶液注射到大鼠关节软骨组织缺损处，利用生物体的生理温度使之原位形成胶原蛋白凝胶。
实施例2：EDTA对胶原蛋白原位凝胶化的影响
（1）称取适量无菌猪皮胶原蛋白样品，在2-8℃的温度条件下，用0.5mol/L乙酸配制成猪皮胶原蛋白浓度为35mg/mL的样品100mL。
（2）将胶原蛋白溶液装入截留分子量为8000-4000道尔顿透析袋中，在2-8 ℃的温度条件下，用含有0.05%EDTA的0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液透析，透析持续120h，每天将PH值2.5调整到最终PH值7.4，此时透析袋内外pH相同。
（3）收集最终的透明粘性胶原蛋白溶液并离心以除去气泡。最终的透明粘性胶原蛋白溶液的PH为7.4，在室温下未形成凝胶。
（4）上述步骤（1）、（2）、（3）均是进行无菌操作。
（5）将步骤（3）得到的胶原蛋白溶液放入37℃金属浴中孵育，观察胶原蛋白凝胶的出现。结果表明，含有EDTA透明粘性胶原蛋白溶液在3min内形成了白色不透明的胶原蛋白凝胶，相比于不含EDTA的胶原溶液（5min），EDTA显著的缩短了胶原蛋白原位凝胶化的时间。
（6）将步骤（3）得到的胶原蛋白溶液注射到大鼠关节软骨组织缺损处，利用生物体的生理温度使之原位形成胶原蛋白凝胶。
实施例3：含人参皂甙Rh1胶原注射剂
（1）将人参皂甙Rh1（成都瑞芬思德丹生物科技有限公司）加入到如实施例2所述制备的中性胶原蛋白溶液，配置得到的混合液中人参皂甙Rh1终浓度为0.6ug/mL，胶原蛋白终浓度为30mg/mL。
（2）将步骤（1）得到的混合液置于37℃下恒温孵育2-5min，得到包埋人参皂甙Rh1的胶原凝胶。
（3）将2mL包埋人参皂甙Rh1的胶原凝胶放置到透析膜中，并将其浸泡到4mL PBS中，将复合体系在37℃下进行持续振荡。
（4）以同样的方法配置不含有人参皂甙Rh1的胶原凝胶作为对照组。
（5）在浸泡的第1，3，5，7，14，21天，分别收取浸泡液并加入等量的新浸泡液，各时间点收取浸泡液经微孔滤膜过滤，HPLC测定浸泡液中人参皂苷Rb1含量，计算不同时间点的累积释放百分率。结果表明，第1天时，包埋人参皂甙Rh1的胶原凝胶的人参皂苷Rb1释放量为2.15±2.13%，在21d的时间内持续释放了总共50.85±0.43%。说明含有人参皂甙Rh1的胶原注射剂在局部注射部位形成药物库，长期持续性释放从而延长药物作用时间。
实施例4：含川芎嗪的胶原注射剂
（1）川芎嗪（北京索莱宝科技有限公司）加入到如实施例2所述制备的中性胶原蛋白溶液，配置得到的混合液中川芎嗪终浓度为10ug/mL，胶原蛋白终浓度为30mg/mL。
（2）将步骤（1）得到的混合液置于37℃下恒温孵育2-5min，得到包埋川芎嗪的胶原凝胶。
（3）将2mL包埋川芎嗪的胶原凝胶放置到透析膜中，并将其浸泡到4mL PBS中，将复合体系在37℃下进行持续振荡。
（4）以同样的方法配置不含有人参皂甙Rh1的胶原凝胶作为对照组。
（5）在浸泡的第1，3，5，7，14，21天，分别收取浸泡液并加入等量的新浸泡液，各时间点收取浸泡液经微孔滤膜过滤，HPLC测定浸泡液中川芎嗪含量，计算不同时间点的累积释放百分率。结果表明，第1天时，包埋人川芎嗪的胶原凝胶的人川芎嗪释放量为8.23±1.57%，在21d的时间内持续释放了总共61.14±1.25%。说明含有川芎嗪的胶原注射剂能够在局部注射部位形成药物库，延长药物作用时间，减少给药次数，提高患者依从性，能够长期持续性修复软骨组织缺损。
实施例5：含淫羊藿苷胶原注射剂
（1）淫羊藿苷（成都格利普生物科技有限公司）加入到如实施例2所述制备的中性胶原蛋白溶液，配置得到的混合液中淫羊藿苷终浓度为25umol/L的混合溶液，胶原蛋白终浓度为30mg/mL。
（2）将步骤（1）得到的混合液置于37℃下恒温孵育2-5min，得到包埋淫羊藿苷的胶原凝胶。
（3）将2mL包埋淫羊藿苷的胶原凝胶放置到透析膜中，并将其浸泡到4mL PBS中，将复合体系在37℃下进行持续振荡。
（4）以同样的方法配置不含有淫羊藿苷的胶原凝胶作为对照组。
（5）在浸泡的第1，3，5，7，14，21天，分别收取浸泡液并加入等量的新浸泡液，各时间点收取浸泡液经微孔滤膜过滤，HPLC测定浸泡液中淫羊藿苷含量。 计算不同时间点的累积释放百分率。结果表明，第1天时，包埋淫羊藿苷的胶原凝胶的淫羊藿苷释放量为5.35±0.92%，在21d的时间内持续释放了总共49.88±1.27%。说明含有淫羊藿苷的胶原注射剂能够在局部注射部位形成药物库，延长药物作用时间，减少给药次数，提高患者依从性，能够长期持续性修复软骨组织缺损。
实施例6：包埋种子细胞的含有活性成分的胶原注射剂
（1）无菌条件下，将人脐带内的华通胶剥离并剪碎成1-3 mm3小块，接种于培养瓶中，加入培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，约5~7d见人脐带间充质干细胞于瓶底生长，随后每2~3d换液一次，约9~14 d后达到75%~85%汇合度时，使用0.25X TrypLE Express酶消化，以细胞密度5 × 103个细胞/cm2传代培养。
（2）取生长良好的人脐带间充质干细胞制成密度为5 × 107个/mL的种子细胞悬液。
（3）将包含活性成分胶原溶液与步骤（2）制得的种子细胞悬液混合均匀。其中，药材胶原溶液中，人参皂甙Rh1终浓度为0.6ug/mL，川芎嗪终浓度为10ug/mL，淫羊藿苷终浓度为25umol/L，胶原蛋白终浓度为30mg/mL，种子细胞密度为5 × 106个/mL。
（4）上述步骤（1）、（2）、（3）均是进行无菌操作。
（5）将步骤（3）得到的混合液置于37℃下恒温孵育2-5min，得到包埋种子细胞的含有活性成分的胶原凝胶。
（6）种子细胞包埋在胶原蛋白凝胶的体外实验，用荧光显微镜观察种子细胞的生长状态。如图2所示，该凝胶的原料组分具有较好的生物相容性，有利于种子细胞的增殖。
（7）将步骤（3）得到的混合液注射到大鼠关节软骨组织缺损处，利用生物体的生理温度使之原位形成包埋种子细胞及活性成分的胶原蛋白凝胶。通过添加人参皂甙Rh1、川芎嗪和淫羊藿苷等成分，通过各组分的协同配合作用，对调节间充质干细胞细胞生长、增殖和分化起着重要作用。可通过促进间充质干细胞的软骨分化、加速缺损部位的软骨再生，具有较好的成软骨诱导作用。
Claims (10)
1.一种可原位聚合的含有活性成分的胶原注射剂，其特征在于：包括胶原蛋白、人参皂甙Rh1、川芎嗪、淫羊藿苷、EDTA。
2.根据权利要求1所述的一种可原位聚合的含有活性成分的胶原注射剂，其特征在于：所述胶原注射剂具有260-360mmol/kg的渗透压，PH为6.0-8.0。
3.根据权利要求1所述的一种可原位聚合的含有活性成分的胶原注射剂，其特征在于：所述胶原蛋白的浓度为10mg/mL-35mg/mL，人参皂甙Rh1的浓度为0.1ug/mL-1.0ug/mL，川芎嗪的浓度为5ug/mL -25ug/mL，淫羊藿苷的浓度为10umol/L -100umol/L，EDTA的浓度为0.01-0.1%。
4.根据权利要求3所述的一种可原位聚合的含有活性成分的胶原注射剂，其特征在于：所述胶原蛋白的浓度为30mg/mL，人参皂甙Rh1的浓度为0.6ug/mL，川芎嗪的浓度为10ug/mL，淫羊藿苷的浓度为25umol/mL，EDTA的浓度为0.05%。
5.根据权利要求1所述的一种可原位聚合的含有活性成分的胶原注射剂，其特征在于：所述胶原注射剂还包括种子细胞。
6.一种可原位聚合的含有活性成分的胶原注射剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：在低温条件下，以酸性溶液溶解胶原，得到胶原溶液；
S2：在低温条件下，以中性透析液对步骤S1得到的胶原溶液进行透析，得到中性胶原溶液；
S3：将步骤S2得到的中性胶原溶液与人参皂甙Rh1、川芎嗪、淫羊藿苷混合，得到含有活性成分的胶原注射剂。
7.根据权利要求6所述的一种可原位聚合的含有活性成分的胶原注射剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中的低温条件为2℃-20℃；所述酸性溶液选自盐酸水溶液、乙酸水溶液和磷酸水溶液中的至少一种，酸性溶液的摩尔浓度为0.01mol/L-0.5mol/L；所述胶原为以哺乳动物、鱼类、两栖动物的皮肤、跟腱组织中的至少一种为原料提取的胶原，胶原的浓度为10mg/mL-65mg/ml。
8.根据权利要求6所述的一种可原位聚合的含有活性成分的胶原注射剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中的低温条件为为2℃-20℃；所述中性透析液包括磷酸盐缓冲液、EDTA中的至少一种；采用截留分子量1000-10000道尔顿的透析袋进行透析；透析时间为72h-120h，当透析袋内外PH相同时，可判定透析过程已充分进行，透析充分后的胶原溶液PH为6.0-8.0。
9.根据权利要求6所述的一种可原位聚合的含有活性成分的胶原注射剂的制备方法，其特征在于：将步骤S3制得的含有活性成分的胶原注射液与种子细胞混合，具体包括以下步骤：
S4：取得人脐带间充质干细胞，使用胰酶消化后以细胞密度5×103个细胞/cm2传代培养；
S5：取生长良好的人脐带间充质干细胞制成密度为5×107个/mL的种子细胞悬液；
S6：将步骤S3制得的含有活性成分的胶原注射液与步骤S5制得的种子细胞悬液混合均匀。
10.根据权利要求9所述的一种可原位聚合的含有活性成分的胶原注射剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S6混合后的溶液中，人参皂甙Rh1终浓度为0.6ug/mL，川芎嗪终浓度为10ug/mL，淫羊藿苷终浓度为25umol/L，胶原蛋白终浓度为30mg/mL，种子细胞密度为5×106个/mL。
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