CN117618567A - 一种用于乳腺癌保乳术后放疗增敏的纳米复合水凝胶及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种用于乳腺癌保乳术后放疗增敏的纳米复合水凝胶及制备方法，包括负载有介孔金纳米离子M@AuNPs的水凝胶，制备方法为：原料包括改性壳聚糖溶液、改性透明质酸溶液及M@AuNPs；将M@AuNPs分散于改性透明质酸溶液中，然后将改性壳聚糖溶液与改性透明质酸溶液等量均匀混合制得水凝胶。本发明设计及制备了一种包载纳米粒子的可注射水凝胶，该水凝胶结构中均匀包载外层改性的金纳米粒子，能够缓慢靶向释放治疗药物实施免疫治疗的同时由于金纳米粒子具有更高的原子序数而实现射线能量的沉积从而有效灭杀瘤床位置肿瘤细胞。该策略有效降低了全乳放疗辐射剂量，有利于对出瘤床外乳房正常组织实现保护。
Description
技术领域
本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种适用于乳腺癌保乳术后可注射放疗定位增敏的纳米复合水凝胶及制备方法。
背景技术
乳腺癌指的是乳腺来源的恶性肿瘤，据世卫组织国际癌症研究机构2023年所发布数据显示乳腺癌已经取代肺癌成为全球第一大癌症。在我国，每年新发乳腺癌病例约为42万例，发病率约7.7％，是发病率最高的恶性肿瘤。早期乳腺癌采用保乳手术的治疗效果相对较好，在一定程度上追求乳房外观保留的同时治愈率往往能达到90％以上。中国国家卫健委会发布的《乳腺癌诊疗规范》(2018年版)指出：原则上所有接受保乳手术的患者均需接受放射治疗。在保乳术后必须做预防性放疗，必要时还有辅助化疗，控制病情发展，起到预防局部复发和远处转移的作用。
目前保乳术后放疗模式为全乳照射加瘤床的推量照射或单纯针对瘤床的加速部分乳腺照射。目前确定术后瘤床区的照射范围采取较多的仍是在术后皮肤疤痕处放置铅丝，即依据术痕大小来判定瘤床范围，但是肿瘤实际位置与术后疤痕二者存在较大差异，目前临床上往往无法明确界定瘤床辐照加速区，正常组织难以躲开放疗射线。由于放疗放射线对人体是有损伤的，因此寻求整体放疗剂量的降低能够减少对正常组织照射所带来的损伤。
发明内容
针对现有技术中存在的乳腺癌保乳术后放疗射线对正常组织具有潜在危险的问题，本发明设计的目的在于提供一种生物相容性优异的放疗增敏水凝胶及制备方法，具体通过以下技术方案加以实现：
一种用于乳腺癌保乳术后放疗增敏的纳米复合水凝胶，包括负载有介孔金纳米离子M@AuNPs的水凝胶。
一种用于乳腺癌保乳术后放疗增敏的纳米复合水凝胶的制备方法，原料包括改性壳聚糖溶液、改性透明质酸溶液及M@AuNPs；
所述方法包括按料液比1mg:5mL的比例将M@AuNPs分散于改性透明质酸溶液中，然后将改性壳聚糖溶液与改性透明质酸溶液等量均匀混合制得水凝胶。
本发明以天然生物多糖为原料，其具有生物相容性优异、价廉易得的优点的同时其结构中丰富的羟基、氨基使其可通过简单改性即满足希夫碱反应条件，所得水凝胶能够快速在原位成胶的同时具有一定的自我修复能力，更满足目标位置易受挤压的实际情况。
进一步地，上述方法具体包括以下步骤：
1)将改性壳聚糖粉末使用无菌PBS溶液配制成5wt％A溶液；
2)将改性透明质酸粉末使用无菌PBS溶液配制成10wt％B溶液；
3)按料液比1mg:5mL的比例将M@AuNPs分散于B溶液中；
4)将等量的A溶液和B溶液于西林瓶中均匀混合成胶或使用注射器混合均匀成胶。
壳聚糖壳聚糖为天然多糖甲壳素脱除部分乙酰基的产物，具有生物降解性、生物相容性、无毒性、抑菌、增强免疫等多种生理功能，在药物递送等生物医用领域具有广泛应用。
进一步地，壳聚糖选用羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、羧乙基壳聚糖、N-琥珀酰壳聚糖中的任一种。
进一步地，改性壳聚糖按照以下方法制得：
称取一定量壳聚糖溶解于1-3％乙酸溶液后加入300-600mL甲醇并进行机械搅拌；将一定量丁二酸酐溶解于丙酮配制成丁二酸酐溶液；将壳聚糖溶液滴入丁二酸酐混液后静置过夜；将混合液抽滤后乙醇洗涤重新抽滤得固体产物；固体产物溶于水中并调节溶液pH＝8-9后用过量丙酮、乙醇洗涤后经抽滤、冷冻干燥得产物。
透明质酸作为一种线性黏多糖，其在人体内分布广泛，发挥着重要的生理功能作用，在医疗美容等方面应用广泛。
进一步地，改性透明质酸为醛基化透明质酸，具体按以下方法制得：将透明质酸溶于水中并调节溶液pH＝4-5；加入EDCI搅拌使之溶解后加入丙二醇酰肼衍生物于20-60℃下搅拌反应1-28h；调节反应液pH＝6-8终止反应；将放应液透析后加入高碘酸钠溶液后避光30-40℃搅拌反应4-8h，加入乙二醇搅拌0.2-0.8h终止反应，经透析、冷冻干燥得产物。
金纳米颗粒具有更高的原子序数及X射线光子俘获截面，并且可以通过被动靶向有效聚集到肿瘤组织。与此同时，金纳米粒子可以在经过外层修饰后实现给药的同时沉积放疗射线能量。
进一步地，M@AuNPs采用以下方法制得：
1)柠檬酸钠还原：将5-40mg/mL的氯金酸溶液和10-80mg/mL柠檬酸钠水溶液倒入50-150mL 90-100℃超纯水搅拌反应10-80min得金纳米粒子AuNPs溶液；
2)表面修饰：采用CTAB模板法进行制备，将AuNPs溶液倒入配制好的5-20mL 0.1-0.8mol/L的CTAB溶液中，后滴加0.2-1.0mL硅酸四乙酯反应6-24h，经洗涤、离心、干燥后得介孔金纳米粒子M@AuNPs。
本发明所得可注射水凝胶在成胶时使用自设计双联注射器进行原位成胶，该注射器具有组分配比可调的优点的同时可将各组分充分混合，成胶均匀有效的同时均匀包载金纳米粒子。
本发明水凝胶基底选用为天然生物多糖，价廉易得的同时经简单改性后即可满足希夫碱反应条件，能够在注射位置原位快速生成凝胶；水凝胶依靠亚胺动态键成胶具有一定的自修复能力，确保注射部位受到挤压后仍能恢复一定的力学性能；水凝胶均匀负载外层修饰的金纳米粒子，能够在实现药物靶向可控释放的同时实现放疗增敏，更低剂量实施保乳术后放疗，有效实现对正常乳房组织的保护。
附图说明
图1为实施例1所得纳米复合水凝胶实物及微观形貌图(SEM)；
图2为实施例2所得水凝胶在不同pH值溶液下药物释放曲线；
图3为实施例3所得水凝胶处理组肿瘤细胞活性氧(ROS)试剂盒染色后在荧光显微镜下照片。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步描述，以便更好地理解本技术方案。
N-琥珀酰壳聚糖制备方案如下：精确称量2.0g壳聚糖于三口烧瓶中，加入80mL乙酸溶液中机械搅拌溶解，溶解后加入320mL甲醇继续机械搅拌；将2.5g的丁二酸酐溶解于25mL丙酮溶液中,配制成的丁二酸酐混液,在激烈的机械搅拌下向壳聚糖溶液中逐滴加丁二酸酐混液，30min滴加完成后继续室温反应8h；把乳液用真空泵抽滤后,用乙醇浸没反应后的产物再次抽滤，经丙酮、乙醇洗涤后得粗产物；将粗产物完全溶解于水中后用5％ NaOH溶液调节溶液pH＝9后透析、冷冻干燥得产物。
醛基化透明质酸制备方法如下：精确称量2g透明质酸(钠)溶解于200mL水中，调节所得溶液的pH至4.5后加入4gEDCI(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)搅拌20min使之溶解，随后加入8g丙二醇酰肼衍生物于室温下搅拌反应3h，调节反应液pH至7.0将反应液透析并冻干得丙二醇化修饰的透明质酸(钠)；将2g丙二醇化透明质酸(钠)加入200mL水中，后加入40mL10 wt％高碘酸钠水溶液，于室温避光下搅拌反应12h后滴加5mL乙二醇搅拌1h终止反将反应液使用透析袋(3500Da)透析48h并冻干得醛基化修饰的透明质酸(钠)。
介孔金纳米粒子制备方案如下：配制20.0mg/mL氯金酸溶液和50.0mg/mL柠檬酸钠溶液，在沸腾超纯水中加入1mL氯金酸溶液和2mL柠檬酸钠溶液，反应1h后冷却得金纳米粒子(AuNPs)溶液；后将AuNPs溶液倒入配制好的8mL 0.4mol/L的CTAB溶液中，后滴加0.2mL硅酸四乙酯反应24h，经洗涤、离心、干燥后得介孔金纳米粒子(M@AuNPs)。
实施例1：水凝胶体系的制备
将N-琥珀酰壳聚糖粉末使用无菌PBS溶液配制成5wt％A溶液，将醛基化透明质酸粉末使用无菌PBS溶液配制成10wt％B溶液，并将1mgM@AuNPs分散于醛基化透明质酸溶液中，将A、B溶液各5mL于西林瓶中均匀混合成胶或使用注射器混合均匀成胶。
本实施例制备的水凝胶的形貌图(SEM)如图1，可以看出，N-琥珀酰壳聚糖/醛基化透明质酸-醛基化碘克沙醇所形成的凝胶冻干后凝胶内部呈良好的连续紧密多孔的网络结构，成胶较均匀，M@AuNPs均匀分布在水凝胶中，表明M@AuNPs已成功载入水凝胶。
实施例2：纳米复合水凝胶体外药物释放测试
采用紫外分光光度计测试不同时长释放溶液中药物吸光度。将N-琥珀酰壳聚糖粉末使用无菌PBS溶液配制成5wt％A溶液，将醛基化透明质酸粉末使用无菌PBS溶液配制成10wt％B溶液，并将1mgM@AuNPs分散于醛基化透明质酸溶液中，将A、B溶液于西林瓶中均匀混合成胶或使用注射器混合均匀成胶。后将纳米复合水凝胶转移到透析袋分别浸泡于pH＝5.7或7.4溶液中，于37℃摇床上进行体外药物释放实验。
本实施例测试所得的药物释放曲线图如图2。可以看出，在早期快速释放6h后释放行为逐渐平稳，显示出药物缓慢释放特性，并且药物在酸性环境中具有更快的释放速率，证实了本发明水凝胶药物靶向递送和持续性释放的特性。
实施例3：水凝胶放疗增敏效果测试
放疗射线对肿瘤的灭杀是通过辐照后细胞内的水分分解成ROS介导的，使用ROS检测试剂盒来测量肿瘤细胞的ROS值以验证本发明纳米复合水凝胶放疗增敏效果。将Huh-7细胞接种到6孔板，培养24h后对照组使用原培养基、实验组使用含实施例2中水凝胶的培养基替换原培养基，继续培养24h后进行5Gy射线照射，后使用活性氧检测试剂盒进行荧光染色对比实验组和对照组活性氧含量。
本实施例水凝胶处理前后肿瘤细胞经ROS试剂盒染色后再荧光显微镜下的照片为图3。M@AuNPs比对照组荧光亮度更高，可确认M@AuNPs在经低剂量辐照后能诱导肿瘤细胞产生更多ROS，从而提高杀死肿瘤细胞的效果。
本发明创新性提出乳腺癌保乳术后综合治疗新策略，设计及制备了一种包载纳米粒子的可注射水凝胶，该水凝胶结构中均匀包载外层改性的金纳米粒子，能够缓慢靶向释放治疗药物实施免疫治疗的同时由于金纳米粒子具有更高的原子序数而实现射线能量的沉积从而有效灭杀瘤床位置肿瘤细胞。该策略有效降低了全乳放疗辐射剂量，有利于对出瘤床外乳房正常组织实现保护。
Claims (7)
1.一种用于乳腺癌保乳术后放疗增敏的纳米复合水凝胶，其特征在于，包括负载有介孔金纳米离子M@AuNPs的水凝胶。
2.一种制备如权利要求1所述的用于乳腺癌保乳术后放疗增敏的纳米复合水凝胶的方法，其特征在于，原料包括改性壳聚糖溶液、改性透明质酸溶液及M@AuNPs；
所述方法包括按料液比1mg:5 mL的比例将M@AuNPs分散于改性透明质酸溶液中，然后将改性壳聚糖溶液与改性透明质酸溶液等量均匀混合制得水凝胶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于具体包括以下步骤：
1）将改性壳聚糖粉末使用无菌PBS溶液配制成5wt%A溶液；
2）将改性透明质酸粉末使用无菌PBS溶液配制成10wt%B溶液；
3）按料液比1mg:5 mL的比例将M@AuNPs分散于B溶液中；
4）将等量的A溶液和B溶液于西林瓶中均匀混合成胶或使用注射器混合均匀成胶。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于壳聚糖选用羧甲基壳聚糖、羟乙基壳聚糖、羧乙基壳聚糖、N-琥珀酰壳聚糖中的任一种。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于改性壳聚糖按照以下方法制得：
称取一定量壳聚糖溶解于1-3%乙酸溶液后加入300-600 mL甲醇并进行机械搅拌；将一定量丁二酸酐溶解于丙酮配制成丁二酸酐溶液；将壳聚糖溶液滴入丁二酸酐混液后静置过夜；将混合液抽滤后乙醇洗涤重新抽滤得固体产物；固体产物溶于水中并调节溶液pH=8-9后用过量丙酮、乙醇洗涤后经抽滤、冷冻干燥得产物。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于改性透明质酸为醛基化透明质酸，具体按以下方法制得：将透明质酸溶于水中并调节溶液pH=4-5；加入EDCI搅拌使之溶解后加入丙二醇酰肼衍生物于20-60℃下搅拌反应1-28h；调节反应液pH=6-8终止反应；将放应液透析后加入高碘酸钠溶液后避光30-40℃搅拌反应4-8h，加入乙二醇搅拌0.2-0.8h终止反应，经透析、冷冻干燥得产物。
7.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于M@AuNPs采用以下方法制得：
1）柠檬酸钠还原：将5-40mg/mL的氯金酸溶液和10-80mg/mL柠檬酸钠水溶液倒入50-150 mL 90-100 ℃超纯水搅拌反应10-80min得金纳米粒子AuNPs溶液；
2）表面修饰：采用CTAB模板法进行制备，将AuNPs溶液倒入配制好的5-20mL 0.1-0.8mol/L的CTAB溶液中，后滴加0.2-1.0mL硅酸四乙酯反应6-24h，经洗涤、离心、干燥后得介孔金纳米粒子M@AuNPs。
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