CN117607417A - 一种检测尿酸的试剂、试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测尿酸的试剂、试纸条及其制备方法和应用，涉及尿酸检测技术领域。本发明提供一种用于检测尿酸的试剂，包括试剂A和试剂B；所述试剂A包括硼酸缓冲盐、尿酸酶、辣根过氧化物酶、4‑氨基安替比林、显色剂、稳定剂等；所述试剂B为聚乙烯醇溶液。本发明利用所述试剂制备得到的试纸条检测效率高，能够定性检测唾液尿酸含量，可用于随时监测尿酸水平，且抗干扰能力强，检测结果真实有效。

Description

一种检测尿酸的试剂、试纸条及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于尿酸检测技术领域，具体为一种检测尿酸的试剂、试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
尿酸是人体内嘌呤代谢的最终产物，正常成人每天产生700mg左右尿酸，其中经肾脏排泄尿酸约500mg，经肠道排泄尿酸约200mg，维持体内尿酸平衡。由于尿酸产生过多或尿酸排泄不良就会导致血中尿酸升高。一般情况下，当血尿酸浓度大于416μmol/L时，临床可诊断为高尿酸血症。高尿酸血症不仅造成肾功能损害还可以诱发痛风，尿毒症，冠心病，高血压，糖尿病等。近年来随着生活水平的提高，各个年龄段的发病率都在上升，高尿酸血症已经成为现代社会中高发疾病之一。同时，在早期阶段无明显症状，所以患者不能及时察觉并加以治疗。因此需要对高尿酸血症进行早期预警和诊断。对于高风险人群，临床建议终生监测与管理、定期筛查。现有的临床检测尿酸的方法是有创的采血处理后通过大型分析仪器进行检测，不仅操作繁琐，不能达到快速检测的目的，对于需要长期监测尿酸指标的人群来说，有创的采血方式大大降低了人们的依从性，且不能随时进行采血处理，因此，需要开发一款能够随时取用的检测方法。
唾液标本由于采集容易且无需采血，因此常作为无创检测或监测的理想标本。在临床化学检查中，唾液已被用于某些血浆成分或治疗药物的浓度监测。一些研究报道，血清和唾液中的尿酸水平之间存在线性关系。因此，用唾液尿酸水平来监测血清中尿酸含量的高低不仅具有无创性，且可随时多次进行采集。因此，亟需研发一种基于唾液尿酸检测试纸条，满足患者随时取用方便，检测准确性的要求。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测尿酸的试剂，所述试剂能够与唾液样本中的尿酸发生特异性反应，可用于检测唾液样本中的尿酸含量。
本发明的目的还在于提供一种检测尿酸的试纸条的制备方法，本发明制备得到的试纸条以唾液样本为基础，可用于随时监测尿酸水平，且抗干扰能力强，检测结果真实。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种检测尿酸的试剂，所述试剂包括试剂A和试剂B；所述试剂A包括如下含量的原料：硼酸-EDTA缓冲溶液，8～15U/mL尿酸酶，500～800U/mL辣根过氧化物酶，1～5U/mL维生素C氧化酶，0.5～2U/mL胆红素氧化酶，8～15mg/mL牛血清白蛋白，80～120μL/mL聚乙二醇-200，0.5～1mg/mL4-氨基安替比林，2～3mg/mLN-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，0.5～1mg/mL邻苯二胺盐酸盐，0.1～0.5mL明胶；所述试剂B为8～15mg/mL聚乙烯醇溶液。
本发明提供了一种检测尿酸的试纸条的制备方法，将滤纸浸泡在所述的试剂A中，水浴、烘干，得到烘干后的；将所述烘干后的滤纸再浸泡到所述的试剂B中，烘干、剪切，粘贴于基板上即可。
优选地，所述水浴的条件为25～35℃水浴12～30h。
优选地，所述烘干的温度为25～35℃。
本发明还提供了一种所述制备方法获得的试纸条。
本发明还提供了一种检测尿酸的试剂盒，所述试剂盒包括所述的试纸条和标准比色卡。
优选地，所述标准比色卡按如下步骤制作：称取尿酸，溶解于热碳酸锂溶液中制备尿酸标准储备液，配置已知浓度的尿酸溶液，将试纸条浸泡于已知浓度的尿酸溶液，待试纸条颜色变化稳定后，在普通色卡上找出对应的标准色，根据各标准色的色值印制出标准比色卡。
更优选地，所述已知浓度的尿酸溶液0，100，325，750μM的尿酸溶液。
本发明还提供了一种基于唾液检测尿酸的方法，所述方法为非诊断目的，所述方法包括如下步骤：将新鲜唾液直接滴加至所述试纸条的样品端，通过肉眼直接观测试纸的颜色变化，并将试纸颜色与标准比色卡对照，得出唾液尿酸含量范围。
本发明还提供了一种所述的检测尿酸的试剂或所述制备方法获得的试纸条在制备检测尿酸产品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种用于检测尿酸的试剂，所述试剂能够与唾液中的尿酸进行特异性反应。本发明利用所述试剂制备了一种基于唾液样本快速检测尿酸的试纸条，本发明获得的试纸条能够在正常唾液尿酸浓度100μM下不显色，高唾液尿酸浓度325μM时显紫色，检测效率高，3min内能够定性检测唾液尿酸含量，可用于随时监测尿酸水平，且抗干扰能力强，检测结果真实有效，最大程度的避免了检测过程中出现的假阴/阳性。本发明制备的试纸条通过非侵入性采集标本唾液，无创监测尿酸水平，解决检测过程中出现的干扰性问题。本发明的试纸条制备流程简单，成本较低，可大规模大批量生产。
附图说明
图1为本发明的试纸条有效性测试结果图；
图2为本发明的试纸条灵敏度测试结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测尿酸的试剂，所述试剂包括试剂A和试剂B；所述试剂A优选地包括如下含量的原料：硼酸-EDTA缓冲溶液，8～15U/mL尿酸酶，500～800U/mL辣根过氧化物酶，1～5U/mL维生素C氧化酶，0.5～2U/mL胆红素氧化酶，8～15mg/mL牛血清白蛋白，80～120μL/mL聚乙二醇-200，0.5～1mg/mL4-氨基安替比林，2～3mg/mLN-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，0.5～1mg/mL邻苯二胺盐酸盐，0.1～0.5mL明胶；所述试剂B为8～15mg/mL聚乙烯醇溶液。所述试剂A更优选地包括如下含量的原料：硼酸-EDTA缓冲溶液，10U/mL尿酸酶，600U/mL辣根过氧化物酶，2U/mL维生素C氧化酶，1U/mL胆红素氧化酶，10mg/mL牛血清白蛋白，100μL/mL聚乙二醇-200，0.812mg/mL 4-氨基安替比林，2.36mg/mLN-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，0.6mg/mL邻苯二胺盐酸盐，0.2mL明胶；所述试剂B为10mg/mL聚乙烯醇溶液。在本发明中，所述硼酸-EDTA缓冲溶液包括如下重量份原料：89mM三硼酸盐，2mMEDTA，pH＝8.3。在本发明中，所述明胶由如下方法制备：3g明胶加入10mL蒸馏水，浸泡过夜，使用前煮沸。在本发明中，对所述原料的来源不作特殊限定。在本发明的具体实施例中，所述尿酸酶，辣根过氧化物酶，胆红素氧化酶，4-氨基安替比林，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐均购自Macklin；所述维生素C氧化酶，聚乙二醇-200购自上海源叶生物科技有限公司；所述牛血清白蛋白，明胶，硼酸-EDTA缓冲溶液购自sigma；所述聚乙烯醇购自上海迈瑞尔化学技术有限公司。
本发明还提供了一种检测尿酸的试纸条的制备方法，包括如下步骤：将滤纸浸泡在所述的试剂A中，水浴、烘干，得到烘干后的；将所述烘干后的滤纸再浸泡到所述的试剂B中，烘干、剪切，粘贴于基板上即可。
在本发明中，所述水浴的条件优选为25～35℃水浴12～30h，更优选为30℃水浴24h。过高的温度会影响试纸和试剂的稳定性，而在低温孵育下可能会影响试纸对水分试剂的吸收，进而影响试剂的性能。本发明的水浴条件能够保证试纸对水分的吸收效果以及试剂的稳定反应。
在本发明中，所述烘干的温度优选为25～35℃，更优选为30℃。过高温度下的快速烘干可能导致试剂结构的变化，从而影响其检测性能；温度太低会导致烘干时间过长，也会影响试纸的性能。本发明的烘干条件能够有效避免上述问题的出现，提高试纸的检测性能。
在本发明的具体实施例中，所述滤纸优选为whatman滤纸。在本发明中，所述whatman滤纸购自Macklin。
在本发明的具体实施例中，所述剪切的规格优选为1cm×1cm。在本发明的具体实施例中，将滤纸剪切成1cm×1cm的滤纸通过双面胶粘贴到基板的一端，之后便于唾液尿酸的检测。未使用的滤纸真空封装后避光保存于-20℃冰箱中。在本发明中，对所述基板不作特殊限定，所述基板可为塑料卡片纸。
本发明还提供了一种上述制备方法获得的试纸条。本发明所述的试纸条制作工艺简单，使用方便，成本低。本发明所述试纸条的工作原理为：唾液样本中的尿酸能够在尿酸酶的作下催化氧化生成产物尿囊素，二氧化碳和过氧化氢；过氧化氢进一步在辣根过氧化物酶的作用下，能够与显色物质与4-氨基安替比林(4-AAP)和N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOPS)生成红色醌亚胺化合物，该红色产物的生成量和唾液中的尿酸含量成正比。同时，显色剂邻苯二胺盐酸盐(OPD)也能在过氧化氢和辣根过氧化酶存在的条件下生成黄色产物2,2-二氨基偶氮苯。通过不同显色剂在过氧化氢和辣根过氧化酶环境中的竞争反应，使得试纸能够在正常唾液尿酸浓度100μM下不显色，高唾液尿酸浓度325μM时显紫色。
本发明还提供了一种检测尿酸的试剂盒，所述试剂盒包括所述的试纸条和标准比色卡。
在本发明中，所述标准比色卡按如下步骤制作：称取尿酸，溶解于热碳酸锂溶液中制备尿酸标准储备液，配置已知浓度的尿酸溶液，将试纸条浸泡于已知浓度的尿酸溶液，待试纸条颜色变化稳定后，在普通色卡上找出对应的标准色，根据各标准色的色值印制出标准比色卡。在本发明中，所述尿酸标准储备液的浓度优选为1600μmol/L。所述尿酸标准贮备液制备方法优选为：取60mg碳酸锂，溶解在40mL蒸馏水中，在60℃水浴箱中加热使其完全溶解。精确称取尿酸26.9mg，溶解于热碳酸锂溶液中，冷却至室温，转入100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，之后稀释至相应浓度进行检测，其于溶液保存于棕色瓶中备用。
在本发明中，所述已知浓度的尿酸溶液0，100，325，750μM的尿酸溶液。在本发明中，本领域技术人员可以根据实际需要调整尿酸溶液的浓度，制备不同梯度浓度的尿酸溶液。
本发明还提供了一种基于唾液检测尿酸的方法，所述方法为非诊断目的，所述方法包括如下步骤：将新鲜唾液直接滴加至所述试纸条的样品端，通过肉眼直接观测试纸的颜色变化，并将试纸颜色与标准比色卡对照，得出唾液尿酸含量范围。
本发明还提供了一种所述制备方法获得的试纸条在制备检测尿酸产品中的应用。具体地，本发明制备方法获得的试纸条便于实时监测尿酸含量的高低，对患者的健康检查提供一定的指导意义；所述试纸条可应用于临床快速了解患者尿酸浓度的实用性产品中；所述试纸条可应用于临床评价患者尿酸浓度的辅助性工具。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种检测尿酸的试剂，包括试剂A和试剂B；所述试剂A包括如下含量的原料：5mL硼酸-EDTA缓冲液中添加50U尿酸酶，3000U辣根过氧化物酶，10U维生素C氧化酶，胆红素氧化酶5U，50mg牛血清白蛋白，500μL聚乙二醇-200，4.06mg 4-氨基安替比林，11.8mg N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，3mg邻苯二胺盐酸盐，然后加入1mL明胶；所述试剂B为10mg/mL聚乙烯醇溶液。
实施例2
一种检测尿酸的试剂，包括试剂A和试剂B；所述试剂A包括如下含量的原料：5mL硼酸-EDTA缓冲液中添加40U尿酸酶，2500U辣根过氧化物酶，5U维生素C氧化酶，胆红素氧化酶2.5U，40mg牛血清白蛋白，400μL聚乙二醇-200，2.5mg 4-氨基安替比林，10mg N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，2.5mg邻苯二胺盐酸盐，然后加入0.5mL明胶；所述试剂B为8mg/mL聚乙烯醇溶液。
实施例3
一种检测尿酸的试剂，包括试剂A和试剂B；所述试剂A包括如下含量的原料：5mL硼酸-EDTA缓冲液中添加75U尿酸酶，4000U辣根过氧化物酶，25U维生素C氧化酶，胆红素氧化酶10U，75mg牛血清白蛋白，600μL聚乙二醇-200，5mg 4-氨基安替比林，15mg N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，5mg邻苯二胺盐酸盐，然后加入2.5mL明胶；所述试剂B为15mg/mL聚乙烯醇溶液。
实施例4
一种检测尿酸的试纸条的制备方法，包括如下步骤：用移液枪取5mL硼酸-EDTA(89mM三硼酸盐，2mMEDTA，pH＝8.3)缓冲溶液加入培养皿中，依次向培养皿中添加50U尿酸酶，3000U辣根过氧化物酶，10U维生素C氧化酶，胆红素氧化酶5U，50mg牛血清白蛋白，500μL聚乙二醇-200，4.06mg 4-氨基安替比林，11.8mg N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，3mg邻苯二胺盐酸盐，然后加入1mL明胶(3g明胶加入10mL蒸馏水，浸泡过夜，使用前煮沸)，之后将滤纸正面朝下浸泡在溶液中，30℃水浴24h后，用烘箱30℃烘干。将上述烘干的滤纸再浸泡到50mL 10mg/mL聚乙烯醇溶液中，再次30℃烘箱干燥完全后，将滤纸剪切成1cm×1cm的滤纸通过双面胶粘贴到塑料卡片纸的一端，之后便于唾液尿酸的检测。
实施例5
一种检测尿酸的试纸条的制备方法，包括如下步骤：用移液枪取5mL硼酸-EDTA(89mM三硼酸盐，2mMEDTA，pH＝8.3)缓冲溶液加入培养皿中，依次向培养皿中添加40U尿酸酶，2500U辣根过氧化物酶，5U维生素C氧化酶，胆红素氧化酶2.5U，40mg牛血清白蛋白，400ìL聚乙二醇-200，2.5mg 4-氨基安替比林，10mg N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，2.5mg邻苯二胺盐酸盐，然后加入0.5mL明胶(3g明胶加入10mL蒸馏水，浸泡过夜，使用前煮沸)，之后将滤纸正面朝下浸泡在溶液中，25℃水浴30h后，用烘箱35℃烘干。将上述烘干的滤纸再浸泡到50mL 8mg/mL聚乙烯醇溶液中，再次25℃烘箱干燥完全后，将滤纸剪切成1cm×1cm的滤纸通过双面胶粘贴到塑料卡片纸的一端，之后便于唾液尿酸的检测。
实施例6
一种检测尿酸的试纸条的制备方法，包括如下步骤：用移液枪取5mL硼酸-EDTA(89mM三硼酸盐，2mMEDTA，pH＝8.3)缓冲溶液加入培养皿中，依次向培养皿中添加75U尿酸酶，4000U辣根过氧化物酶，25U维生素C氧化酶，胆红素氧化酶10U，75mg牛血清白蛋白，600μL聚乙二醇-200，5mg 4-氨基安替比林，15mg N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，5mg邻苯二胺盐酸盐，然后加入2.5mL明胶(3g明胶加入10mL蒸馏水，浸泡过夜，使用前煮沸)，之后将滤纸正面朝下浸泡在溶液中，35℃水浴12h后，用烘箱25℃烘干。将上述烘干的滤纸再浸泡到50mL 15mg/mL聚乙烯醇溶液中，再次35℃烘箱干燥完全后，将滤纸剪切成1cm×1cm的滤纸通过双面胶粘贴到塑料卡片纸的一端，之后便于唾液尿酸的检测。
对比例1
与实施例4不同的是，试剂A中不含有胆红素氧化酶。
实施例7
1600ìmol/L尿酸标准贮备液：取60mg碳酸锂，溶解在40mL蒸馏水中，在60℃水浴箱中加热使其完全溶解。精确称取尿酸26.9mg，溶解于热碳酸锂溶液中，冷却至室温，转入100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，之后稀释至相应浓度进行检测，其于溶液保存于棕色瓶中备用。
配制浓度依次为0，100，325，750μM的尿酸溶液用以测试实施例4～6制备得到的试纸条的有效性。将实施例4获得的试纸条显色区域浸泡在尿酸溶液中5s后，拿出并静置3min，等待试纸颜色变化稳定后读取结果。
通过图片1可以看出，随着尿酸浓度的逐渐增加，试纸条显色区域的颜色逐渐由白色变为紫色，且紫色越来越重；将未加入胆红素氧化酶等的试纸条与上述正常试纸条对比，结果显示，与正常试纸条相比，未加入酶稳定剂的试纸条在尿酸检测时试纸显色明显偏浅，检测结果偏低。实施例2和实施例3的结果与实施例1相同。
实施例8
将实施例7制备得到的尿酸标准贮备液溶液在唾液中，并用唾液分别稀释至0，100，325，750μM。取实施例4获得的试纸条将显色区域浸泡在唾液尿酸中5s，拿出并静置3min，等待试纸颜色变化稳定后读取结果。
取已知唾液尿酸浓度的唾液直接用于试纸的检测。通过图片2可以看出，当唾液尿酸浓度逐渐升高时，试纸条显色区域的紫色越来越重。将未加入胆红素氧化酶等的试纸条与上述正常试纸条对比，结果显示，与正常试纸条相比，未加入酶稳定剂的试纸条在尿酸检测时试纸显色明显偏浅，检测结果偏低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测尿酸的试剂，其特征在于，所述试剂包括试剂A和试剂B；所述试剂A包括如下含量的原料：硼酸-EDTA缓冲溶液，8～15U/mL尿酸酶，500～800U/mL辣根过氧化物酶，1～5U/mL维生素C氧化酶，0.5～2U/mL胆红素氧化酶，8～15mg/mL牛血清白蛋白，80～120μL/mL聚乙二醇-200，0.5～1mg/mL4-氨基安替比林，2～3mg/mLN-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，0.5～1mg/mL邻苯二胺盐酸盐，0.1～0.5mL明胶；所述试剂B为8～15mg/mL聚乙烯醇溶液。
2.一种检测尿酸的试纸条的制备方法，包括如下步骤：将滤纸浸泡在权利要求1所述的试剂A中，水浴、烘干；将所述烘干后的滤纸再浸泡到权利要求1所述的试剂B中，烘干、剪切，粘贴于基板上即可。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述水浴的条件为25～35℃水浴12～30h。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述烘干的温度为25～35℃。
5.一种如权利要求2～4任意一项所述制备方法获得的试纸条。
6.一种检测尿酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求5所述的试纸条和标准比色卡。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述标准比色卡按如下步骤制作：称取尿酸，溶解于热碳酸锂溶液中制备尿酸标准储备液，配置已知浓度的尿酸溶液，将试纸条浸泡于已知浓度的尿酸溶液，待试纸条颜色变化稳定后，在普通色卡上找出对应的标准色，根据各标准色的色值印制出标准比色卡。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述已知浓度的尿酸溶液0，100，325，750μM的尿酸溶液。
9.一种基于唾液检测尿酸的方法，其特征在于，所述方法为非诊断目的，所述方法包括如下步骤：将新鲜唾液直接滴加至权利要求5所述试纸条的样品端，通过肉眼直接观测试纸的颜色变化，并将试纸颜色与标准比色卡对照，得出唾液尿酸含量范围。
10.权利要求1所述的检测尿酸的试剂或权利要求2～4任意一项所述制备方法获得的试纸条在制备检测尿酸产品中的应用。
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