JP6320441B2 - ライソゾーム病2疾患責任酵素の迅速マススクリーニング検査法 - Google Patents
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
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Description
[1]1枚の乾燥血液ろ紙から複数のライソゾーム病責任酵素活性を迅速に測定する、ライソゾーム病責任酵素の迅速マススクリーニング検査方法であって、該責任酵素がα-L-Iduronidase(IDU)及びIduronate-2-sulfatase(IDS)であり、以下の工程を含む方法:
(1)乾燥血液ろ紙から共通抽出液を用いて血液試料を抽出する工程、
(2)抽出した血液試料に合成基質を含む基質液を添加して酵素反応を行わせる工程、
(3)酵素反応により得られた生成物を蛍光測定する工程。
[2]前記共通抽出液が、リン酸イオン及びクエン酸イオンを含まない緩衝液である、[1]に記載の方法。
[3]前記共通抽出液に界面活性剤が含まれる、[1又は[2]に記載の方法。
[4]前記界面活性剤がTritonX-100であり、0.05%〜0.5%で含まれる、[3]に記載の方法。
[5]前記共通抽出液に、0.02%〜0.1%のアジ化ナトリウム及び0.05%〜0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)が含まれる、[1]から[4]のいずれか一項に記載の方法。
[6]前記基質液が、(i)塩化カリウム及び4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液並びに(ii)Iduronidase及び4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液の組み合わせである、[1]から[5]のいずれか一項に記載の方法。
[7]前記(i)における4-Methyumbelliferyl合成基質が、4-Methylumbelliferyl α-L-Idopyranosiduronic Acid, Sodium Saltであり、0.1mM〜3mMで含まれる、[6]に記載の方法。
[8]前記(i)における基質液のpHが3〜4である、[6]又は[7]に記載の方法。
[9]前記(i)における基質液の緩衝液が還元作用を有する、[6]から[8]のいずれか一項に記載の方法。
[10]前記緩衝液が、ギ酸ナトリウム緩衝液である、[9]に記載の方法。
[11]前記(i)における基質液に、0.1mM〜1mMのDithiothreitol(DTT)が含まれる、[6]から[10]のいずれか一項に記載の方法。
[12]前記(i)における基質液に、0.01%〜0.1%のPolyoxyethyleneglycol Dodecyl Ether(Brij-35)が含まれる、[6]から[11]のいずれか一項に記載の方法。
[13]前記(i)における基質液に、1μg/mL〜20μg/mLのD-Saccharic acid 1,4-lactoneが類似酵素阻害剤として含まれる、[6]から[12]のいずれか一項に記載の方法。
[14]前記(ii)におけるIduronidaseが、遺伝子組換え技術により作製したIduronidaseであり、0.1μg/mL〜2μg/mLで含まれる、[6]に記載の方法。
[15]前記(ii)における4-methylumbelliferyl合成基質が、4-Methylumbelliferyl-a-L-Idopyranosiduronic Acid-2-Sulfate, Sodium Saltであり、0.1mM〜3mMで含まれる、[6]又は[14]に記載の方法。
[16]前記(ii)における基質液のpHが4〜5である、[6]、[14]又は[15]に記載の方法。
[17]前記(ii)における基質液の緩衝液が、酢酸ナトリウム緩衝液である[6]又は[14]から[16]のいずれか一項に記載の方法。
[18]前記(ii)における基質液に10mM〜30mMの酢酸鉛又は2〜20mMの酢酸セリウムが含まれる、[6]又は[14]から[17]のいずれか一項に記載の方法。
[19]工程(2)において、酵素反応の停止を、酵素反応溶液にグリシンを含む共通反応停止液を添加することにより行う、[1]から[18]のいずれか一項に記載の方法。
[20]前記共通反応停止液のpHが10〜11である、[19]に記載の方法。
[21]前記酵素反応を、25〜45℃の温度で行った後、前記共通反応停止液を添加する、[19]又は[20]に記載の方法。
[22]前記酵素反応を2〜4時間で行う、[1]から[21]のいずれか一項に記載の方法。
[23]前記蛍光測定の測定波長が、励起波長365〜375nm、検出波長460〜470nmである、[1]から[22]のいずれか一項に記載の方法。
[24]1枚の乾燥血液ろ紙から複数のライソゾーム病責任酵素を同時に抽出する方法であって、共通抽出液を用いることを含み、該責任酵素がalpha-L-Iduronidase(IDU)及びIduronate-2-sulfatase(IDS)である、方法。
[25]前記共通抽出液が、リン酸イオン及びクエン酸イオンを含まない緩衝液である、[24]に記載の方法。
[26]前記共通抽出液に界面活性剤が含まれる、[24]又は[25]に記載の方法。
[27]前記界面活性剤がTronX-100であり、0.05%〜0.5%で含まれる、[26]に記載の方法。
[28]前記共通抽出液に、0.02%〜0.1%のアジ化ナトリウム及び0.05%〜0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)が含まれる、[24]から[27]のいずれか一項に記載の方法。
[29]下記を含む、[1]に記載の検査方法に使用するためのキット:
(1)乾燥血液ろ紙、
(2)共通抽出液、
(3)合成基質を含む基質液、
(4)共通反応停止液、及び
(5)酵素反応により得られた生成物を蛍光測定する手段。
[30]前記共通抽出液が、0.1%BSA、0.1%TrtionX-100及び0.05%アジ化ナトリウムを含む精製水である、[29]に記載のキット。
[31]前記合成基質を含む基質液が、MPS I基質液とMPS II基質液との組み合わせであり、MPS I基質液が、0.6mM 4-methylumbelliferyl-α-L-Idopyranosiduronic acid,sodium salt、5μg/mL D-Saccharic acid 1,4-lactone、0.05%Birij-35、50mM KCl及び0.25mM DTTを含むpH3〜4の100mMギ酸ナトリウム緩衝液、MPS II基質液が、0.25mM 4-methylumbelliferyl-α-L-Idopyranosiduronic Acid -2-sulfate, Sodium Salt (4MU-IDS)、1μg/mL遺伝子組換えIduronidase及び20mM酢酸鉛又は2〜20mMの酢酸セリウムを含むpH4.5の50mM酢酸ナトリウム緩衝液である、[29]又は[30]に記載のキット。
[32]前記共通反応停止液が、300mMグリシン-NaOH緩衝液(pH10.6)である、[29]から[31]のいずれか一項に記載のキット。
乾燥血液ろ紙を検体としたライソゾーム病責任酵素活性測定は、乾燥血液ろ紙と基質液を直接混合して酵素反応を行わせる方法や、乾燥血液ろ紙に少量のbufferを添加した後、基質液を添加して反応させる方法、乾燥血液ろ紙から血液を抽出して、抽出した血液試料に基質液を添加して酵素反応を行わせる方法などがある。
酵素活性(pmol/hr/disk)=抽出試料の4MU量(μM)×抽出試料量(μL)÷酵素反応時間(hr)×(乾燥血液ろ紙1枚当たりの抽出液量(μL)÷抽出試料量(μL))
(1)乾燥血液ろ紙、
(2)共通抽出液、
(3)合成基質を含む基質液、
(4)共通反応停止液、及び
(5)酵素反応により得られた生成物を蛍光測定する手段。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
(1)検体、試薬等
本実施例において用いた検体、試薬等は以下のとおりである。
[検体及び標準品]
・検体:正常人ヒト乾燥血液ろ紙(新生児72名の各乾燥血液ろ紙)、及びcontrol乾燥血液ろ紙(2種)
・4MU標準品:4-methylumbelliferone(SIGMA-ALDRICH社製、Product No.M1381)
・4-methyumbelliferyl-α-L-Idopyranosiduronic acid sodium salt(トロントリサーチケミカル(TRC)社製、Product No. M334701)
・4-methyumbelliferyl-α-L-Idopyranosiduronic acid -2-sulfate disodium salt(トロントリサーチケミカル(TRC)社製、Product No. M334715)
・D-Saccharic acid 1,4-lactone monohydrate(SIGMA-ALDRICH社製、Product No. S0375)
・遺伝子組換えIduronidase(R&D systems社製、試薬カタログコード番号4119-GH-01)
・共通抽出液:0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1%TrtionX-100及び0.05%アジ化ナトリウムを含む精製水
・MPS I基質液:0.6mM 4-methylumbelliferyl-α-L-Idopyranosiduronic acid sodium salt、5μg/mL D-Saccharic acid 1,4-lactone、0.05%Birij-35、50mM KCL及び0.25mM DTTを含むpH3.5の100mMギ酸ナトリウム緩衝液
・MPS II基質液:0.25mM 4-methylumbelliferyl-α-L-Idopyranosiduronic acid -2-sulfate,sodium salt (4MU-IDS)、1μg/mL遺伝子組換えIduronidase及び20mM酢酸鉛を含むpH4.5の50mM酢酸ナトリウム緩衝液
・共通反応停止液:300mMグリシン-NaOH緩衝液(pH10.6)
本実施例における測定操作は以下のとおりである。
各乾燥血液ろ紙より、φ3.0mmの乾燥血液ろ紙検体を96wellマイクロプレートプレートの各wellに切り出し、各wellに200μLの共通抽出液を添加して、室温で振とうしながら1時間の抽出操作を行った。抽出された血液試料を20μLずつ2枚の蛍光測定用96well Blackマイクロプレート(NUNC社製)にwell to wellで移注した。4MU標準品は、2.5μMより2倍段階希釈した希釈標準液を血液試料と同様に20μLずつ蛍光測定用96well Blackマイクロプレートに移注した。検体及び4MU標準液の入ったwellにそれぞれの合成基質を20μL添加し、25℃、37℃、45℃の恒温槽内に4時間静置して酵素反応を行わせた。酵素反応終了後、共通反応停止液を各well200μL添加して、軽く混合した後、蛍光オートリーダー(TECASN社製、infinite M200pro)を用いて、励起波長370nm、検出波長465nmで蛍光強度を測定し、4MU標準液の蛍光強度と比較して各乾燥血液ろ紙1枚当たりの酵素活性を求めた。
Claims (25)
- 1枚の乾燥血液ろ紙から複数のライソゾーム病責任酵素活性を迅速に測定する、ライソゾーム病責任酵素の迅速マススクリーニング検査方法であって、該責任酵素がα-L-Iduronidase(IDU)及びIduronate-2-sulfatase(IDS)であり、以下の工程を含む方法:
(1)乾燥血液ろ紙から共通抽出液を用いて血液試料を抽出する工程、ここで、共通抽出液は、リン酸イオン及びクエン酸イオンを含まない緩衝液であり、界面活性剤と0.02%〜0.1%のアジ化ナトリウムを含む、
(2)抽出した血液試料に合成基質を含む基質液を添加して酵素反応を行わせ、酵素反応の停止を、酵素反応溶液にグリシンを含むpH10〜11の共通反応停止液を添加することにより行う工程、
(3)酵素反応により得られた生成物を蛍光測定する工程、ここで蛍光測定の測定波長が、励起波長365〜375nm、検出波長460〜470nmである。 - 前記界面活性剤がTritonX-100であり、0.05%〜0.5%で含まれる、請求項1に記載の方法。
- 前記共通抽出液に、0.05%〜0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)が含まれる、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記基質液が、(i)塩化カリウム及び4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液並びに(ii)Iduronidase及び4-Methylumbelliferyl合成基質を含む緩衝液の組み合わせである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記(i)における4-Methyumbelliferyl合成基質が、4-Methylumbelliferyl α-L-Idopyranosiduronic Acid, Sodium Saltであり、0.1mM〜3mMで含まれる、請求項4に記載の方法。
- 前記(i)における基質液のpHが3〜4である、請求項4又は5に記載の方法。
- 前記(i)における基質液の緩衝液が還元作用を有する、請求項4から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記緩衝液が、ギ酸ナトリウム緩衝液である、請求項7に記載の方法。
- 前記(i)における基質液に、0.1mM〜1mMのDithiothreitol(DTT)が含まれる、請求項4から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記(i)における基質液に、0.01%〜0.1%のPolyoxyethyleneglycol Dodecyl Ether(Brij-35)が含まれる、請求項4から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記(i)における基質液に、1μg/mL〜20μg/mLのD-Saccharic acid 1,4-lactoneが類似酵素阻害剤として含まれる、請求項4から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記(ii)におけるIduronidaseが、遺伝子組換え技術により作製したIduronidaseであり、0.1μg/mL〜2μg/mLで含まれる、請求項4に記載の方法。
- 前記(ii)における4-methylumbelliferyl合成基質が、4-Methylumbelliferyl-a-L-Idopyranosiduronic Acid-2-Sulfate, Sodium Saltであり、0.1mM〜3mMで含まれる、請求項4又は12に記載の方法。
- 前記(ii)における基質液のpHが4〜5である、請求項4、12又は13に記載の方法。
- 前記(ii)における基質液の緩衝液が、酢酸ナトリウム緩衝液である請求項4又は12から14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記(ii)における基質液に10mM〜30mMの酢酸鉛又は2〜20mMの酢酸セリウムが含まれる、請求項4又は12から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素反応を、25〜45℃の温度で行った後、前記共通反応停止液を添加する、請求項1に記載の方法。
- 前記酵素反応を2〜4時間で行う、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 1枚の乾燥血液ろ紙から複数のライソゾーム病責任酵素を同時に抽出する方法であって、共通抽出液を用いることを含み、該責任酵素がalpha-L-Iduronidase(IDU)及びIduronate-2-sulfatase(IDS)であり、共通抽出液が、リン酸イオン及びクエン酸イオンを含まない緩衝液であり、界面活性剤と0.02%〜0.1%のアジ化ナトリウムを含む、方法。
- 前記界面活性剤がTronX-100であり、0.05%〜0.5%で含まれる、請求項19に記載の方法。
- 前記共通抽出液に、0.05%〜0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)が含まれる、請求項19又は20に記載の方法。
- 下記を含む、請求項1に記載の検査方法に使用するためのキット:
(1)乾燥血液ろ紙、
(2)リン酸イオン及びクエン酸イオンを含まない緩衝液であって、界面活性剤と0.02%〜0.1%のアジ化ナトリウムを含む、共通抽出液、
(3)合成基質を含む基質液、
(4)酵素反応溶液にグリシンを含むpH10〜11の共通反応停止液、及び
(5)酵素反応により得られた生成物を蛍光測定する手段。 - 前記共通抽出液が、0.1%BSA、0.1%TrtionX-100及び0.05%アジ化ナトリウムを含む精製水である、請求項22に記載のキット。
- 前記合成基質を含む基質液が、MPS I基質液とMPS II基質液との組み合わせであり、MPS I基質液が、0.6mM 4-methylumbelliferyl-α-L-Idopyranosiduronic acid,sodium salt、5μg/mL D-Saccharic acid 1,4-lactone、0.05%Birij-35、50mM KCl及び0.25mM DTTを含むpH3〜4の100mMギ酸ナトリウム緩衝液、MPS II基質液が、0.25mM 4-methylumbelliferyl-α-L-Idopyranosiduronic Acid -2-sulfate, Sodium Salt (4MU-IDS)、1μg/mL遺伝子組換えIduronidase及び20mM酢酸鉛又は2〜20mMの酢酸セリウムを含むpH4.5の50mM酢酸ナトリウム緩衝液である、請求項22又は23に記載のキット。
- 前記共通反応停止液が、300mMグリシン-NaOH緩衝液(pH10.6)である、請求項22から24のいずれか一項に記載のキット。
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